Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Protein-protein etkileşimleri hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde, sürdürülmesinde ve değiştirilmesinde çok önemli bir rol oynadıkları için hücrelerdeki tüm biyolojik süreçlerin ayrılmaz bir parçasıdır. Bu etkileşimler sinyal transdüksiyon, patojen yanıtı, hücre-hücre etkileşimleri, metabolik ve gelişimsel süreçler gibi çok çeşitli fenomenlerde yer almaktadır. Transkripsiyon faktörleri söz konusu olduğunda, bu etkileşimler alt ünüllerin oligomerizasyonuna, çekirdek, sitoplazma vb. Burada, Floresan Ömür Boyu Görüntülemeyi (FLIM) içeren Bimoleküler Floresan Kompleasyonu (BiFC) tabanlı Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanarak in vivo üçlü etkileşimi görselleştirmek için bir metodoloji sunuyoruz. Bu gösteri için seçilen proteinlerden ikisi BiFC ortağı olarak etkileşime girer ve yeniden inşa edilen floresan aktiviteleri üçüncü ortakla FRET-FLIM'i test etmek için kullanılır. Dört ila beş haftalık büyüme odası tarafından yetiştirilen Nicotiana benthamiana bitkileri bu gösteri için model bitki sistemi olarak kullanılmıştır.
Giriş
Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) çeşitli metabolik ve gelişimsel süreçleri düzenleyerek ökaryotik hücrelerin düzgün çalışmasının temelini oluşturur. Bazı PPI'lar kararlıdır, bazıları ise doğada geçicidir. Etkileşimler, dimerik, trimerik, tetramerik homomerik ve heteromerik1gibi etkileşimdeki üye sayısına ve türüne göre kategorize edilebilir. Protein etkileşimlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, protein fonksiyonlarının ve düzenleyici ağların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir.
Transkripsiyon faktörleri düzenleyici işlevlerde yer alan proteinlerdir. DNA'ya bağlanarak aşağı akış genlerinin transkripsiyon....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Giriş ve varış vektörlerindeki genlerin klonlatma (Şekil 2)
- İlgi genlerinin (bizim durumumuzda M ve C genleri) kodlama sırasını (CDS) PCR ile güçlendirin ve uygun giriş vektörlerinde (örneğin, pENTR/D-TOPO vektörü) klonlayın; Bu denemede kullanılan vektörler için Tablo 1'e bakın).
- Klonları antibiyotik içeren plakalarda yetiştirin. Antibiyotikler üzerinde seçilen klonları,22,23'üsınırlandırarak ve DNA dizileme yaparak doğrulayın.
- Yeniden inşa edilen CDS'leri giriş klonlarından hedef vektörl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, bitkilerdeki vivo üçlü protein-protein etkileşimlerini incelemek için optimize edilmiş bir yöntemi temsil eder. Protokolün temel ilkesi, üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu ölçmek için bir test oluşturmak için iki floresan etiketli protein etkileşimi tekniğini, yani BiFC ve FRET'i birleştirmektir. Burada FRET bağışçısının varlığında ve yokluğunda FRET donör ortağının floresan ömrünü ölçmek için FLIM'i kullandık. İki protein arasında olumlu bir etkileşim varsa, donörün floresan ömrün.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mevcut protokol, MADS kutu proteininin iki monomeri ile kalsiyum sensör proteini arasında üçlü bir kompleks oluşumunu belirlemek için BiFC tabanlı FRET-FLIM testinin kullanımını göstermektedir. Protokol, Y. John Shyu ve ark. tarafından hazırlanan ve Fos-Jun heterodimers ile NFAT veya p65 arasında oluşturulan üçlü kompleksi hassaslaştırılmış emisyon yöntemi7kullanarak görselleştirmek için BiFC tabanlı bir FRET yöntemi geliştirdikleri bir rapordan uyarlanmıştır. Daha önce, Galperin ve iş arkadaşları.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
NB, GG, SB, KC, üniversite hibe komisyonuna (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE ve Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi'ne (CSIR) araştırma bursları için içtenlikle teşekkür eder. Biyoteknoloji Departmanı (DBT), Hindistan Hükümeti, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (DST-FIST), Hindistan Hükümeti'ni finansal destek için çok şükür kabul ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 ml İğnesiz Şırınga | Dispovan | - | |
| Asetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim karışımı | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | Çalışmada kullanılan vektörler Ağ Geçidi Bazlı |
| Gentamisin Sülfat Himedia | CMS461 | ||
| Kanamisin Sülfat | Himedia | MB105 | |
| MES hidrat | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Klonlama Kiti | Thermo Fischer Scientific | K240020 | Çalışmada kullanılan vektörler Gateway tabanlı |
| Phusion yüksek kaliteli Taq DNA polimerazdır | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Herhangi bir Yüksek kaliteli Polimeraz çalışabilir |
| Rifampisin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Konfokal lazer tarama mikroskobu | Leica | SP8 FALCON | için FLIM özelliklerine sahip herhangi bir CLSM kullanılabilir analiz |
| Spektinomisin dihidroklorür pentahidrat | Himedia | TC034 |
Kaynaklar
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
