Yöntem makalesi

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

DOI:

10.3791/62809

⸱

16 Ağustos 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) profili, egzersiz yapılan bir ekimden doğan yavruların kalp dokusunda modifiye edilir. Önerilen ve test edilen hipotez, hamilelik sırasında bir ekimin düzenli bir anne egzersizinin yavru kalp biyoenergetiklerinin mitokondriyal verimliliğini artıracağıydı. Bu hipotez, mitokondriyal ETC ve süperkompleks profillerini değerlendirmek için hafif izolasyon prosedürü kullanılarak mitokondri izole edilmesiyle test edildi. Burada açıklanan prosedür, daha önce dondurulmuş arşivlenmiş kalp dokularının işlenmesine izin verdi ve mitokondriyal ETC komplekslerinin, süperkomplekslerin ve ETC karmaşık aktivite profillerinin değerlendirilmesi için taze mitokondri hazırlığının gerekliliğini ortadan kaldırdı. Bu protokol, çok katlı antikor bazlı immünoblojlamada optimal ETC protein kompleksi ölçümünü ve mavi-yerli jel elektroforezi kullanılarak süper karmaşık değerlendirmeyi açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, doku lizizini ve mitokondri ekstraksiyonunu iyileştiren düşük enerjili dokuların düşük enerjili mekanik bozulması teknolojisi ile daha önce dondurulmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparat elde etmek için ayrıntılı adımlar sağlamaktı. Bu yöntemle, yüksek kesme stresi veya yüksek sıcaklık ve kısa homojenizasyon süresi (10-12 s) üretmeden ekstraksiyon verimliliğinin artırılması ulaşılabilir hale gelir1.

Arşivlenmiş donmuş dokudan mitokondri elde etmek, hem fonksiyonel2 hem de biyokimyasal çalışmaları gerçekleştirmek için değerli bir varlıktır3 aksi takdirde tam deneysel koşullar altında kolayca tekrarlanamaz. Klasik bir Potter-Elvehjem Teflon pestle cam homojenizatörü veya Dounce homojenizatörü kullanılmıştır ve hala karaciğer, böbrek ve beyin gibi yumuşak dokuları homojenize etmek için araştırma laboratuvarlarında kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kas ve kalp gibi homojenizasyon sert dokuları daha fazla homojenizasyon süresi, enzim tedavisi, yüksek hızlı homojenizasyon ve kapsamlı kullanıcı deneyimi gerektirir. Bu, mitokondri gibi bozulmamış organelleri kas ve kalp gibi sert dokulardan çıkarmak için dezavantajlıdır. Bu protokolde açıklanan yöntem, mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) protein komplekslerini ve bunların egzersiz ve sedanter ekime doğan yavrulardan hasat edilen, sıvı nitrojende flash dondurulan ve gelecekteki kullanım için -80 °C'de depolanan kalp dokularındaki süperkompleks oluşumunu analiz etmek için yüksek verimli mitokondri bakımından zenginleştirilmiş preparat elde etmek için kullanılır. Bu yöntem, kullanıcının daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokulardan mitokondri zenginleştirilmiş preparatını izole etmesini sağlar.

Hamile kemirgenlere dış nanomalzeme maruziyeti, gebelik sırasında kalp fonksiyonunu ve mitokondriyal solunumu ve biyoenergetikleri olumsuz yönde etkileyebilir4. Bununla birlikte, gebelikte fetal miyosit biyoenergetiklerinde aerobik egzersize bağlı olumlu değişiklikler henüz belgelenmiştir. Bununla birlikte, ortaya çıkan çalışmalar, hamilelik sırasında anne aerobik egzersizin fetal kardiyak fonksiyon üzerinde olumlu bir etkisi olduğuna dair kanıtlar samaktadır5. Daha fazla kanıt sağlamak için, gebelik sırasında anne egzersizinin yavru kardiyak mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri (yani Kompleks I'den Kompleks V'ye) üzerindeki uzunlamasına etkilerinin analizi yapıldı.

Sonuçlar, anne egzersizinin yavruların kardiyak mitokondrilerinde enerji üretiminin verimliliğini artırdığını düşündürebileceğinden, bu çalışmanın sağlıkla önemli bir ilgisi vardır. Bu çalışmada, ekmekler (dişi domuz) iki nedenden dolayı hayvan modeli olarak kullanılmıştır: (i) kardiyak fizyoloji insan6'ya benzer ve (ii) farklı zaman noktalarından yavrulardan kalp dokusu hasadı kurumsal bir IACUC onayı altında mümkündür. Önerilen çalışma, anne egzersizini ve yavruların kalp dokusunun hücresel ve biyokimyasal makyajı üzerindeki potansiyel olumlu etkilerini bağlayan temel soruların çoğunu yanıtlamayı amaçlamaktadır. Bu yaklaşım, gebelik sırasında fetal kardiyak miyositler içindeki biyoenergetik değişikliklerin sorunlarını ele alan uzun ve maliyetli boyuna çalışmalardan elde edilen daha önce dondurulmuş kardiyak dokudan nazik ama etkili mitokondri izolasyon teknikleri gerektirir. Bu çalışmada açıklanan yöntem, hem analitik hem de fonksiyonel çalışmalar için mitokondri ile zenginleştirilmiş hazırlık için daha önce dondurulmuş arşivlenmiş dokunun büyük miktarda kullanılmasını sağlar. Çalışma ayrıca, anne egzersizinin rahim ve ötesinde kalp sağlığı üzerindeki etkilerini belirleyen gelecekteki çalışmalara yol açabilecek ön veriler sağlayarak bu alandaki bilgi boşluğunun doldurulmasına yardımcı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dondurulmuş yavru kalp dokuları, kurumsal IACUC onay mektubu ile birlikte Dr. Sean Newcomer'dan alındı. Kalp dokuları uzun süreli uzunlamasına bir çalışmadan elde edildi, sıvı nitrojende flaş donduruldu ve ileride kullanılmak üzere -80 °C'de depolandı. Yavru kalp dokusunun işlenmesiyle ilgili tüm protokoller Kansas City Üniversitesi IBC ve IACUC komitelerinin yönergelerine uydu.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: Tüm numuneleri üreticinin yönergelerine göre hazırlayın. Tüm tariflerde ve protokol adımlarında ultra saflaştırılmış su veya eşdeğeri kullanın. Bu işlem sırasında kişisel koruma ekipmanı (laboratuvar böbürlenmeleri, yüz maskesi, eldiven ve gözlük/yüz kalkanı) giyin. Tampon hacimleri altı doku örneğinin işlenmesi için uygundur.

  1. 154.035 g sakkaroz (0,3 M finali), 3,904 g HEPES (10 mM final), 0,111 g EDTA (0,2 mM final) birleştirerek 1,5 L doku yıkama tamponu hazırlayın. Karıştırma plakasındayken 1,0 L suya malzemeler ekleyin, pH'ı seyreltilmiş HCl ile 7,2'ye ve son hacme kadar makyajı 1,5 L'ye ayarlayın.
    NOT: Numune başına yaklaşık 200 mL yıkama tamponu gereklidir (50-300 mg). Bir günde altı doku örneği işlenebilir. İzolasyon arabelleği yapmak için kalan yıkama arabelleği kullanın.
  2. 210 mL yıkama arabelleğine 210 mg BSA ekleyerek, daha önce 1.1 adımında açıklanan yıkama tamponundan yalıtım tamponu hazırlayın. Seyreltilmiş NaOH çözeltisi ile pH'ı 7,4'e ayarlayın.
    NOT: Doku örneği başına yaklaşık 35 mL izolasyon tamponu gereklidir; bu nedenle, altı numune için 210 mL yalıtım tamponu gereklidir. Hazırlık gününde taze BSA çözeltisi (1mg/mL finali) ekleyerek bu tamponu hazırlayın. BSA, serbest yağ asitleri gibi doğal uncoupler'ları çıkararak mitokondriyal özellikleri iyileştirdiği için mitokondrileri izole etmek için kullanılır. BSA'nın beyin mitokondrisinde başta süksinit olmak üzere substratların oksidasyon oranını artırarak antioksidan aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur7. Alternatif olarak, sığır serum albümini ovalbumin gibi daha az pahalı asitsiz analoglarla ikame edilebilir.
  3. 0,011 g EDTA 'yı birleştirerek 150 mL resüspensiyon tamponu hazırlayın (0,2 mM EDTA'nın son konsantrasyonu veya 200 mM stok EDTA çözeltisinin 150 μL'si kullanın 150 mL resüspenzyon tamponu), 12.836 g sakkaroz (0.25 M sakkaroz son konsantrasyonu) ve 0.236 g Tris (10 mM Tris-HCl finali). 0,1 N NaOH ile pH'ı 7,8'e ayarlayın. Kullanmadan hemen önce proteaz inhibitörü kokteylinin 60 μL'sini ekleyin.
  4. 7,5 mg tripsin 3,0 mL 1 mM HCl (2,5 mg tripsin/mL finali) çözünerek tripsin çözeltisini hazırlayın. Bu miktar bir örnek için yeterlidir.
    NOT: Tripsin çözeltisini işlenmesi planlanan doku örneklerinin sayısına göre hazırlayın.
  5. BSA (0.65 mg/mL tripsin inhibitörü finali) içeren 20 mL izolasyon tamponunda 13.0 mg tripsin inhibitörünü birleştirerek soya fasulyesinden tripsin inhibitörü çözeltisini hazırlayın.
    NOT: Yeni bir tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlayın.
  6. 1 mL suya 0,1 g amonyum persülfat ekleyerek amonyum persülfat reaktifini hazırlayın ( amonyum persülfat finali).
    NOT: Amonyum persülfat reaktifi taze olarak hazırlanmalı veya büyük bir hacim aliquoted ve -20 °C dondurucuda tutulabilir.
  7. 0,131 g 6-amino kaproik asidi 1,0 mL ultra saflaştırılmış suda birleştirerek aminokproik asit çözeltisini (ACA) hazırlayın ve 4 °C'de (1 M 6-aminocaproik asit finali) saklayın.
  8. 0,5 mL suda 1 g Coomassie G-250 ve 1 M aminokeproik asit ( boya çözeltisi son konsantrasyonu) 0,5 mL çözünerek Coomassie parlak mavi boya çözeltisini hazırlayın.
  9. Mavi yerel PAGE (BN-PAGE) için %5 Digitonin hazırlayın. Örnek hazırlamada ne kadar digitonin gerektiğini ve pipetleme hatalarını dengelemek için biraz ekstra hacim (10 mg ile abartın) yaklaşık olarak hesaplayın. 15 mg için: İlk olarak, 15 mg digitonin 30 μL0 DMSO'da seyreltin. Vortex, digitonin çözüme girmesine yardımcı olmak için. Ardından, ddH2O'nun (270 μL) kalan% 90'ını ekleyin. Çözeltiyi (girdap) karıştırmak için hafifçe ısıtın ve ardından buz üzerinde soğutun.
  10. Yerel PAGE anot arabelleği hazırlayın. 1 L'lik son bir hacim yapmak için 950 mL suya 50 mL 20x yerel PAGE çalışan tampon ekleyin. Bunu 1x çalışan arabellek olarak kullanın.
  11. Koyu mavi bir katot tamponu hazırlayın. 0.0160 g Coomassie parlak mavi G-250'yi 80 mL yerel PAGE anot tamponunda çözün; iyice karıştırın.
    NOT: Hemen kullanım için taze katot tamponu hazırlayın. Sadece 60 mL gerekebilir, ancak herhangi bir sızıntı durumunda ekstra 20 mL yapın.
  12. Açık mavi katot tamponu hazırlayın. 180 mL yerel PAGE anot tamponuna 20 mL koyu mavi katot tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
    NOT: Bu arabellek yalnızca bir kez kullanılabilir.
  13. Örnek katkı maddesi olarak %5 Coomassie G-250 hazırlayın. 200 μL Coomassie stoğunun 200 μL'si 1 M ACA ile yapılmış (adım 1,8) seyreltin ve 4 °C'de saklayın.
  14. 10 mL son hacimde @ gliserol, %0,04 Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glisin birleştirerek 4x doğal PAGE örnek tamponu hazırlayın. Aliquot onları ve dondurucuda -20 °C'de saklayın.

2. Donmuş kalp dokusundan Mitokondri izolasyonu

NOT: Mitokondri izolasyon prosedürünü 4 °C soğuk bir odada gerçekleştirin. Bununla birlikte, soğuk odanın kullanılamaması durumunda, prosedürü gerçekleştirmek için büyük boyutlu bir buz banyosu kullanın.

  1. -80 °C dondurucudan önceden dondurulmuş kalp dokusu örneklerini alın.
    NOT: Belirli bir günde mitokondri izolasyonu için en fazla dört doku örneği rahatça işlenebilir.
  2. Kalp dokusu örneğini içeren tüpü tartın ve ağırlığı kaydedin. 40 mL yıkama tamponu içeren üç beher (her biri 50 mL) hazırlayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce her bir kabı buz tuzu banyosunda 3-5 dakika boyunca karıştırılarak eşit miktarda buz ve tuzla soğutun. Her bir kabın içine manyetik karıştırma çubukları koyun ve karıştırıcıyı orta hız için ayarlayın.
    NOT: Beherleri aşırı dondurmayın ve buz kristalleri bulutları ortaya çıkmaya başladıktan hemen sonra kullanın.
  3. Donmuş kalp dokusunu doğrudan ilk beherdeki buz gibi çözeltiye koyun. Mümkün olduğunca fazla kan almak için cımbız kullanarak dokuya hafif basınç uygularken yaklaşık 5 dakika bekleyin.
  4. Boş tüpü tartın ve kalp dokusunun net ağırlığını elde etmek için orijinal ağırlıktan çıkarın (adım 2.2).
  5. Dokuyu tokalarla çıkarın ve kanı çıkarmak için kalbi temiz bir kağıt havlu ile sıkın. Daha sonra, dokuyu ikinci kabın içine yerleştirin. Fazla kanı çıkarmak için karıştırırken yaklaşık 5 dakika bekleyin.
  6. Kağıdı kağıt havlu üzerinde hafifçe kurulayın. Tüm yağ, pıhtılaşmış kan, kulak kepçesi ve fasyayı (beyaz doku) çıkarın. Sonra, ventrikül dokusunu bire birler.
  7. 2.7.1-2.7.9 adımlarını izleyerek parçalayıcıyı kullanarak doku örneklerini parçala.
    1. Kalp dokusunu (~50-300 mg) koç tarafından doku öğütücü odasına yerleştirin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Öğütücü ile kullanılmak üzere doku öğütücü odası (tüp). Parçalayıcı tüpteki doku homojenizasyonu, doku örneği başına yaklaşık 10-12 s gerektirir. Homojenize doku delikli diskten üst odaya geçtikten sonra doku homojenizasyonu tamamlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Tüpün kapak tarafına ~0,2-0,8 mL yıkama tamponu ekleyin.
    NOT: Parçalama sırasında birleştirilen numunenin toplam hacminin ve yıkama tamponunun 0,7-0,8 mL'yi aşmamasını sağlayın.
  2. Parçalayıcı odasını parçalayıcı kapağıyla sıkıca kaplamak için tüp aracını kullanın.
    NOT: Öğütücü kapağını fazla sıkmayın.
  3. Öğütücü haznesini, koç tarafı aşağı olacak şekilde öğütücü tutucu ünitesine yerleştirin. Koç, öğütücü tutucuya bir bağlantı elemanı takacaktır.
  4. Öğütücü sürücüsünün bitini takın; parçalayıcı kapağı ile bit meşgul izin verin. Parçanın sıkıca yerine kilitlendiğinden emin olun.
    NOT: Her zaman tam şarjlı öğütücü sürücüsünü kullanın.
  5. Öğütücü tutucu üzerindeki basınç göstergesi öğütücü tutucuda yaklaşık 2 ayara ulaşana kadar öğütücü sürücüsüne ve öğütücü odasına aşağı doğru basınç uygulayın.
    NOT: Parçalanan doku daha lifliyse ayar daha yüksek bir seviyede olabilir.
  6. Ayarı 2'de tutarken, öğütücü sürücüsünün tetiğine basarak öğütücü sürücüsünü yaklaşık 10-12 sn çalıştırın.
  7. Dokunun katı kütlesinin tamamının mı yoksa çoğunun lizis diskinden mi parçalandığını ve tüpe bakarak parçalayıcı odasının üst odasına geçirilip geçirilmediğini kontrol etmek için tüpe bakın.
    NOT: Doku örneğinin daha uzun süre parçalanarak parçalanması gerekebilir. Tüpü öğütücü tutucuya geri verin ve işleme devam edin. Doku örneklerinin çoğu sadece 10-12 s parçalama gerektirir. Tüm parçalama sürtünme nedeniyle bir miktar ısı üretecek olsa da, bu kısa işlem süresi numuneyi önemli ölçüde ısıtmayacaktır.
  8. Numuneyi parçaladıktan sonra, öğütücü haznesini tutucu ünitesinden kaldırın. Parçalayıcı kapağını çıkarmak ve daha sonra kullanmak üzere temiz bir yüzeye yerleştirmek için tüp aracını kullanın.
    NOT: Öğütücü kapağı numune özü ile kontamine olarak kabul edilmelidir ve numune tipine bağlı olarak enfeksiyöz malzemelerle kontamine olabilir. Çapraz kontaminasyonu önlemek için diğer doku örnekleri için aynı öğütücü kapağı kullanmayın.
  1. Parçalanmış kalp dokusunu 40 mL yıkama tamponu ile üçüncü kabın içine aktarın ve çubuğu karıştırın ve karıştırma plakasındayken orta hızda 5 dakika boyunca dokuyu karıştırın.
  2. Süspansiyonu naylon ağ monofilamenti (74 μm gözenek boyutu) ile filtreleyin ve filtratı atın. 10 mL yıkama tamponu ile 3x filtre üzerindeki parçalanmış dokuyu yıkayın.
    NOT: Naylon ağ monofilamentinin su ile önceden ıslatıldığından emin olun.
  3. Yıkanmış ve parçalanmış dokuyu 20 mL yıkama tamponu ile 50 mL'lik bir behere aktarın ve kabı manyetik karıştırıcı üzerindeki buz banyosuna yerleştirin. 15 dakika boyunca sürekli karıştırırken 0,5 mL tripsin çözeltisi ekleyin. Kuluçkanın yaklaşık yarısında (yaklaşık 7,5 dk), doku süspansiyonunu 0-15 mL hacim tutacak gevşek bir şekilde monte edilmiş el camı cam homojenizatöre aktarın.

figure-protocol-2
Şekil 1: Öğütücü ile kullanılmak üzere doku öğütücü odası (tüp). Parçalayıcı tüpteki doku homojenizasyonu, doku örneği başına yaklaşık 10-12 s gerektirir. Homojenize doku delikli diskten üst odaya geçtikten sonra doku homojenizasyonu tamamlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Köpüğü üretmeden süspansiyonu dağıtmak için 4-5 vuruşla hafifçe homojenize edin. Homojenatı 50 mL'lik bir kabın içine yerleştirin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca karıştırma plakasında hafifçe karıştırın.
  2. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, tripin inhibitörini içeren izolasyon tamponunun 10 mL'lik kısmını homojenatı içeren kabın içine ekleyin ve hafifçe karıştırırken 4 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. Süspansiyonu bir naylon filtreden tekrar filtreleyin ve filtratları 50 mL konik bir tüpe kaydedin.
  4. Naylon filtrede kalan partikül fraksiyonunu toplayın ve cam üzerindeki homojenizatöre yerleştirin. Yıkama tamponunun 15-20 mL'sini ekleyin ve 25-30 sn boyunca elle hafifçe homojenize edin.
    NOT: Filtrat bu adımda çok yavaş akar. Filtrat akışını artırmak için, konik tüpün içine dokunan huni ucunu yerleştirin.
  5. Homojenatı filtratla birleştirin, tüpleri dengeleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 600 x g'da santrifüj.
  6. Pelet tarafından kirlenmeyi önlemek için naylon filtre kullanarak elde edilen süpernatant'ı yeni bir konik tüpe filtreleyin. Santrifüjü 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da tekrar çalıştırın.
    NOT: Süpernatant kaldırmak ve kabarık pelet üstten 0.2 mL supernatant feda etmek için plastik bir transfer pipet kullanın.
  7. Süpernatant atın ve 1 mL izolasyon tamponu ile peleti 2-3 kez durulayın. Kabarık beyaz dış kenar tabakasını her seferinde attığından emin olun.
    NOT: İzolasyon tamponunu 1 mL uçlu bir pipet veya yeni bir transfer pipeti kullanarak ekleyerek peleti yıkayın. Peletin kırılmasını önlemek ve süpernatant kirlenmesini önlemek için tamponu doğrudan peletin üzerine değil, tüpün yanına ekleyin. Ardından, arabelleği bir aktarım pipetiyle aspire edin ve işlemi iki kez daha tekrarlayın.
  8. Her tüpe 5 mL izolasyon tamponu ekleyin ve peleti 1 mL uçlu bir pipet veya yeni bir transfer pipeti kullanarak parçalayın.
  9. Süspansiyonu 20 mL ek izolasyon tamponu ile seyreltin ve santrifüjü 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da tekrar çalıştırın.
  10. Üstnatant atın ve pellet resüse edici tamponun 5 mL'sinde yeniden süzülür. Ardından, toplam 20 mL için tampondan 15 mL daha ekleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da santrifüj ekleyin. Üstnatant atın. Elde edilen kahverengi pelet yıkanmış bozulmamış mitokondri içerir.
  11. Mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti, proteaz inhibitörleri de dahil olmak üzere, canlandırma tamponunun 250 μL'sinde yeniden sunun. 25 μL'de aliquot, sıvı nitrojende hızlı donma ve birkaç yıl boyunca -80 °C derin dondurucuda saklayın.
    NOT: Protein analizi tahlil için 5 μL mitokondri ile zenginleştirilmiş preparat yedek. Bir BN-PAGE (Mavi yerel PAGE) çalışması için, tüp başına 50 μg mitokondriyal proteinde yeniden canlanan pelet aliquot. 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.500 x g'da santrifüj. Süpernatantı dikkatlice emiş ve mitokondriyal peleti (50 μg protein / aliquot) birkaç yıl boyunca -80 ° C derin dondurucuda saklayın.

3. Mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) değerlendirmesi

NOT: Bireysel mitokondriyal ETC proteinleri (yani, Complex-I, II, III, IV, V) standart immünblotting tahlil ile değerlendirilebilir. Örneklerin çeşitliliği (dört zaman noktası: 48 saat, 3 ay,6 ay, 9 ay), iki deneysel durum (egzersiz ve sedanter) ve bir dizi immünprobing antikoru (beş antikor) nedeniyle çok yönlü bir immünblotting önerilir. Multipleksli immünblotting aşağıdaki gibi gerçekleştirin.

  1. 50 μg mitokondri zenginleştirilmiş protein örneğini/kuyusunu %4- gradyan poliakrilamid jel elektroforezinde (100 V, 90 dk) çözün.
  2. Proteinleri bir PVDF membranına aktarın (75 V; 60 dk)
  3. Membranı 4 °C'de en az 1 saat boyunca bir engelleme tampon çözeltisinde engelleyin.
    NOT: Engelleme süresi 4 °C'de bir geceye kadar uzatılabilir. Blokaj tamponu (Malzeme Tablosu), tipik yöntemlerde bulunan diğer memeli proteinlerinin yanı sıra antikorlarla spesifik bağlayıcı etkileşimlere sahip olma olasılığı daha düşük olan memeli olmayan bileşenler (yani balık proteinleri) içerir.
  4. Anti-Complex-I, II, III, IV, V antikorlarını içeren antikor kokteyli ile membranı araştırın ve 4 °C'de bir yörünge çalkalayıcıda bir gecede kuluçkaya yatırın.
  5. Ertesi gün, rt (oda sıcaklığı) bir orbital çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca IR etiketli ikincil antikor ile membran ve prob yıkayın.
  6. 1x TBS-T (Ara 20 içeren TBS) ve 1x TBS (Tris tamponlu salin) ile bir kez beş kez yıkayın.
    NOT: Son yıkama için TBS tamponuna deterjan eklemeyin.
  7. Görüntü çözümleyicisinde lekeyi görüntüleyin.

4. Mavi Yerli Poli Akrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE) tarafından mitokondri süpercomplex değerlendirmesi

NOT: ETC'nin süpercomplex profili BN-PAGE tekniği kullanılarak da değerlendirilebilir.

  1. Örnek tampon kokteylini 50 μg mitokondri ile zenginleştirilmiş pelet proteini başına 20 μL için hazırlayın (7 μL su + 5 μL 4x yerli poliakrilamid jel elektroforez numune yükleme tamponu + 8 μL% 5 Digitonin + 2 μL Coomassie G-250).
    NOT: Mevcut numune sayısına (50 μg protein/numune) bağlı olarak bir stok numune tampon kokteyli yapın. Mitokondri ile zenginleştirilmiş peletin protein konsantrasyonuna göre uygun digitonin miktarlarını seçin (Tablo 1)8.
  2. Digitonin stoğunu 95 °C'de 3 dakika ısıtın, karıştırın ve ana karışımı yapmadan önce buz üzerinde soğutun.
  3. Numuneleri jel içine yüklemeden hemen önce Coomassie G-250 numune katkı maddesini ekleyin.
  4. 50 μg mitokondriyal protein pelet içeren bir tüpe 20 μL numune tampon kokteyli ekleyin. Köpüğü üretmeden peleti hafifçe pipetle karıştırarak çözün/yeniden diriltin.
  5. Mitokondri ile zenginleştirilmiş peletin maksimum çözünmesi için karışımı 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Zaman zaman, çözünürlüğü arttırmak için tüpleri hafifçe hafifçe kaydırın.
  6. İnkübasyon beklerken, yerel PAGE anot arabelleği/1x çalışan arabelleği ve koyu mavi renkli katot arabelleği hazırlayın.
  7. Çözünürize mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj edin.
  8. Santrifüjlemeden sonra, 15 μL süpernatantı buza yerleştirilen yeni tüplere toplayın.
  9. Adım 4.8'de elde edilen süpernatanta uygun miktarda %5 Coomassie G-250 reaktif ekleyin ( Tablo 1'e bakın).
    NOT: % 5 Coomassie G-250 hacmi, boyanın son konsantrasyonu deterjan konsantrasyonunun 1/4'ü olacak şekilde olmalıdır. Numuneleri jel içine yüklemeden hemen önce bu adımı gerçekleştirin.
ProteinDigitonin/protein4x Örnek Arabellek%5 DigitoninSuSon ses düzeyi%5 Coomassie G-250
oran (g/g)numune katkı maddesi
50 μg8587202
50 μg45411201

Tablo 1: İki farklı deterjan/protein oranına sahip Örnek Tampon Kokteyl Hazırlama. Membran proteinlerinin mitokondriyal süspansiyondan maksimum çözünmesi için, digitonin/mitokondriyal süspansiyon protein konsantrasyonu 4-8 g digitonin/g protein arasında ayarlanmalıdır. Kalp dokusunda, mitokondri süspansiyonundan süperkomkomlerin çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için 50 μg mitokondriyal süspansiyon proteinleri (yani, 8 g digitonin/g mitokondri proteini) için 400 μg digitonin kullanılmıştır.

  1. % 3-8 gradyan jel dökün, tarağı çıkarın ve jelin kuyularını 1x çalışan tamponla üç kez yıkayın.
    NOT: Jel bir gün önce dökülürse en iyi polimerize olur.
  2. Elektroforezi sistemini kurun ve jeli aparatın içine yerleştirin.
  3. Numune kuyularını koyu mavi renkli katot tamponu ile doldurun.
  4. Jelin ilk ve son kuyusuna yerel moleküler ağırlık belirteci olarak 10 μL'lik bir protein standardı yükleyin.
  5. Yukarıdaki 4.9.
  6. Kuyulardaki numuneleri bozmadan mini hücre tampon barajını yaklaşık 60 mL koyu mavi renkli katot tamponu ile dikkatlice doldurun ve ardından tampon tankını yerel PAGE 1x çalışan tamponla doldurun.
  7. Güç kaynağını açın ve numuneleri yaklaşık 30 dakika boyunca 150 V'ta elektrofor olarak açın.
  8. Koyu mavi renkli katot tamponu bir transfer pipeti ile tampon barajından (iç oda) çıkarın veya numune kuyularını aspire edin. İç odayı 150-200 mL açık mavi renkli katot tamponu ile doldurun ve elektroforez 250 V'ta 60 dakika çalıştırın.
    NOT: Elektroforezi süresi, boya cephesinin jel kasetin dibinden sadece 0,5 cm yukarı ne zaman göç ettiği kontrol edilerek belirlenebilir.
  9. Jeli kasetten çıkarın ve temiz bir plastik kaba yerleştirin. Jeli kaliteli damıtılmış su ile bir rocker / orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika yıkayın.
    NOT: Degrade jeli kasetten çıkarmak için, kırılma olasılığını en aza indirmek için kaseti daha güçlü olan alttan alın.
  10. Suyu dökün, jeli yeterli miktarda Coomassie GelCode Mavi leke reaktifine daldırin ve oda sıcaklığında bir orbital / rocker üzerinde 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Şişeyi birkaç kez hafifçe döndürerek kullanmadan önce Mavi leke reaktifi (Malzeme Masası) çözeltisini karıştırın.
  11. Boya çözeltisini dekante edin, damıtılmış su ekleyin, suyla birkaç kez durulayın ve ardından destaining için orbital / rocker'ı koyun.
    NOT: Jel destaining kabına bir parça sünger (~3 cm x 0,5 cm) yerleştirin ve jeli gece boyunca destaining için bırakın. Sünger, birden fazla su değişikliği gerektirmeden boya parçacıklarını adsorbe eder.
  12. Görüntü çözümleyicisinde jeli analiz edin.

5. İmmünoblot blot analizi ile Mitokondri süpercomplex değerlendirmesi

  1. Elektroforezin sonundaki jeli lekelemeden yeni bir BN-PAGE seti gerçekleştirin.
  2. İmmünblottlamayı tamamlamak için bölüm 3'teki (mitokondriyal elektron transfer kompleksi (ETC) değerlendirmesi ile aynı prosedürü izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün ardından kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş iyi bir protein karışımı verimi hazırlandı. Ekimin yavrularından hasat edilen ortalama 1,2 g dondurulmuş kalp dokusundan yaklaşık 15 mg/mL mitokondri ile zenginleştirilmiş protein karışımı elde edildi. Gözlemler, 0,5 g'dan az dondurulmuş kalp dokusunun BN-PAGE testini gerçekleştirmek için yeterli miktarda mitokondriyal zenginleştirilmiş protein karışımı vermediğini gösterdi. Mitokondriyal hazırlık miktarı,(i) bireysel elektron transfer komplekslerini (E...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için kritik adımlar burada belirtilmiştir. İlk olarak, doku homojenizasyonu işlemi sırasında aşırı saf etkilerin uygulanmaması için doku homojenizasyonu dikkatlice ele alınmalıdır. İlk doku homojenizasyonu için basınç döngüsü teknolojisinin (PCT) bir parçası olan bir doku parçalayıcı kullanılmalıdır9. Bu adım, donmuş doku koşulları nedeniyle zaten kırılgan olan mitokondrileri daha da tahrip edebilecek cam üzerine cam homojenizatörün (Şekil 1B) aşırı inme d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kansas City Üniversitesi'nin Abdulbaki Agbas için intramural hibesi ve Daniel Barrera için Yaz Araştırma Bursu ile finansal olarak desteklendi. Yazarlar Dr. Jan Talley'nin editörlük çalışmaları için minnettarlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amino kaproik asitSigma / AldrichA2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos kompleks kitiİnvitrojen458199
anti-VDAC antikoruabcamab15895kullanım 1 & g/mL
Coomassie G-250ThermoSientific20279
Coomassie JelCode MaviThermoScientific24592
DigitoninCabiochem300410
Cam-Cam havaneli homojenizatörVWRKT885451-0020
Image StudioLICOR
IR-Boya konjuge anti-Tavşan AbLICORLC0725
Çok kuyulu plaka okuyucuBioTekSynergy HT
Yerel moleküler ağırlık işaretleyiciThermoFisherBN2001
Naylon örgü monofilamentKüçük Parça IncCMN-74
Orbital çalkalayıcıThermoScientfic
PCT Parçalayıcı Basınç BiyobilimA.Ş
DENIZ BLOCK Engelleme tamponuThermoScienctific37527
Parçalayıcı PULSE Tüp BasıncıBioscience IncFT500-PS
Masa üstü santrifüjEppendorf5418
TripsinAmrescoM150-1G
Tripsin inhibitörüAmrescoM191-1GTaze hazırlık gerektirir
.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitochondrial Electron TransferCardiac Tissue MitochondriaFrozen Tissue MitochondriaMitochondrial BioenergeticsMaternal Exercise ModelBlue Native ElectrophoresisMultiplexed ImmunoblottingSupercomplex AssessmentComplex I II ActivityMitochondria Isolation

İlgili makaleler