Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması
Bu makalede
Özet
Özet
Kemoterapi veya ışınlamanın neden olduğu tümörlerin immünojenik hücre ölümü, tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri serbest bırakarak ve tip I interferon üretimini indükleyerek tümöre özgü T hücresi yanıtlarını tetikleyebilir. Kontrol noktası inhibisyonu da dahil olmak üzere immünoterapiler, terapötik bir etki ortaya çıkarmak için öncelikle önceden var olan tümöre özgü T hücrelerine dayanır. Bu nedenle, immünojenik hücre ölümünü içsel bir anti-kanser aşısı olarak kullanan sinerjik terapötik yaklaşımlar yanıtlarını artırabilir. Bununla birlikte, tedaviye bağlı stres altındaki hücreler tarafından salınan immünojenik faktörlerin spektrumu, özellikle hücre dışı veziküller (EV'ler) ile ilgili olarak eksik karakterize olmaya devam etmektedir. EV'lerin, hemen hemen tüm hücrelerden yayılan nano ölçekli membranöz parçacıkların, hücreler arası iletişimi kolaylaştırdığı düşünülmektedir ve kanserde, tümör antijenlerine karşı çapraz astarlamaya aracılık ettiği gösterilmiştir. Çeşitli koşullar altında tümörlerden türetilen EV'lerin immünojenik etkisini değerlendirmek için uyarlanabilir, ölçeklenebilir ve geçerli yöntemler aranmaktadır. Bu nedenle, burada EV'lerin in vivo immünojenisitesini değerlendirmek için nispeten kolay ve sağlam bir yaklaşım sunulmaktadır. Protokol, farelerin EV'lerle in vivo immünizasyonundan sonra, tedavi veya kararlı durum koşulları altında tümör hücre kültürlerinden çökeltme bazlı tahlillerle izole edilen dalak T hücrelerinin akış sitometrisi analizine dayanmaktadır. Örneğin, bu çalışma, B16-OVA murin melanom hücrelerinin oksaliplatin maruziyetinin, tümör-reaktif sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonuna aracılık edebilecek immünojenik EV'lerin salınımıyla sonuçlandığını göstermektedir. Bu nedenle, EV'lerin in vivo immünizasyon ve akış sitometrisi yoluyla taranması, immünojenik EV'lerin ortaya çıkabileceği koşulları tanımlar. İmmünojenik EV salınımının koşullarını belirlemek, EV'lerin kansere karşı terapötik etkinliğini test etmek ve sonuçta EV'lerin kanser immünolojisindeki rolüne dair yeni bilgiler ortaya çıkarmak için altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için önemli bir ön koşul sağlar.
Giriş
Bağışıklık sistemi, hem bağışıklık kontrol noktası inhibisyonu tarafından kışkırtıldığında hem de geleneksel kanser tedavilerinin etkinliği için kansere karşı mücadelede çok önemli bir rol oynar. Kemoterapötik ajanlar oksaliplatin ve doksorubisin gibi genotoksik tedavilere yenik düşen tümör hücreleri veya iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi, potansiyel olarak adaptif bir anti-tümör immün yanıtı başlatan antijenleri ve tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri (DAMP'ler) serbest bırakabilir1. İmmünojenik hücre ölümü bağlamında en belirgin DAMP'ler, kemotaktik ATP gibi beni bul sinyallerini, antijen sunan hücreler tarafından tümör hücresi alımını teş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneylerin başlangıcında, fareler en az 6 haftalıktı ve spesifik patojensiz koşullar altında tutuldu. Bu protokol, Kurumsal etik standartlara ve geçerli yerel düzenlemelere uygundur. Hayvan çalışmaları yerel düzenleyici kurum (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmalarda cinsiyetle ilgili olası önyargılar araştırılmamıştır.
1. Kemoterapiye maruz kaldıktan sonra tümör hücrelerinden elde edilen EV'lerin üretimi ve izolasyonu
- Kültür murin B16 melanom hücreleri DMEM'de (4 mM L-glutamin ve 4.5 g / L D-glikoz içeren) eksprese eden ve FCS (% 10 v / v), penisilin (100 Ünite / mL) ve streptomisin (100....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, tümör kaynaklı EV'lerin immünojenisitesinin basit ve kolay tekrarlanabilir değerlendirmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu sayede fareler, model antijen tavuk ovalbümini (OVA) eksprese eden tümör hücrelerinin in vitro kültürlerinden türetilen EV'lerle aşılanır. Sonraki immün yanıt, dalak T hücrelerinde akış sitometrisi ile analiz edilir.
Şekil 1 , tüm protokolün pratik adımlarına genel bir bakış sunmaktadır. Çalışma immünojenik .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, kemoterapiye bağlı stres altında melanom hücrelerinden türetilen EV'lerin immünolojik in vivo bir değerlendirmesini sağlarken, çeşitli tedaviler altında çeşitli kanserlerden yayılan EV'lere uyum sağlar. Örneğin, oksaliplatin ile tedavi edilen B16-OVA hücrelerinden türetilen EV'lerle farelerin bağışıklanması, dalaktaki IFN γ üreten CD8 + T hücrelerini genişletir, bunlar da ovalbümin ile ex vivo inkübasyon ile daha da uyarılır ve tümöre özgü bir bağışıklık tepkisini gösterir. Bu ne.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 ve Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.'ye), DKMS Yaşam Verme Vakfı'ndan (H.P.'ye) bir Mechtild Harf Araştırma Bursu, Melanom Araştırma İttifakı (S.H.'ye) tarafından Genç Araştırmacı Ödülü, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından verilen bir burs (F.S.'ye), Münih Teknik Üniversitesi tarafından bir Tohum Fonu (S.H.'ye) ve Wilhelm Sander Vakfı tarafından bir araştırma hibesi (2021.041.1, S.H.'ye). H. P., EMBO Genç Araştırmacı Programı tarafından desteklenmektedir.
YAZAR KATKILARI:
F.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Klonu 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue Biolegend | 100428 | Klonu GK1.5 | |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Klonu 53-6.7 |
| Anti-IFN ve gama; PE | eBioscience | RM90022 | Klonu XMG1.2 |
| Brefeldin A Biolegend | 420601 | Brefeldin A Çözeltisi (1.000x) | |
| Hücre Süzgeci, 100 & m | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 & m |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco'nun D-glikoz (4.5 g / L) ve L-glutamin (4 mM) ile Modifiye Eagle's MediumFBS |
| Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Buzağı Serumu (FCS) |
| Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 506 eBioscience | , Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Bölümü Fiksasyon / Geçirgenleştirme Konsantresi | eBioscience | 00-5123-43 | Fiksasyon / Geçirgenleştirme Konsantresi (10x) |
| Fiksasyon / Geçirgenleştirme Seyreltici | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Streptomyces conglobatus'tan İyonomisin Sigma-Aldrich 407952 - CAS 56092-82-1, & ge; % 97 (HPLC) | |||
| L-Glutamin | Gibco | 25030-032 | L-Glutamin (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | < 1 EU/mg endotoksin içeren ovalbümin - CAS 9006-59-1 |
| MRI | hastanesi | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeyen Fosfat Tamponlu Salin |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco | 1514-122 | Penisilin (10.000 U/mL) ve streptomisin (10.000 ug/mL) karışımı |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-miristat 13-asetat, & ge; % 99 (HPLC) |
| PVDF filtresi, 0,22 & mikro; m, şırıngalar için | Merck Millipore SLGV033RS | Millex-GV Filtre Ünitesi 0.22 & mikro; m Durapore PVDF Membran | |
| Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 D-glikoz (2.00 g / L) ve L-glutamin (300 mg / L) içeren ortam, HEPES |
| Şırıngası olmadan, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL İğneli Sub-Q Şırıngaları (0,45 mm x 12,7 mm) |
| Toplam Eksozom İzolasyon Reaktifi | İnvitrojen | 4478359 | Hücre kültürü ortamından izolasyon için |
| beta; -Merkaptoetanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | beta; -Merkaptoetanol (50 mM) |
Kaynaklar
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691(2014)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
