Method Article

CD95 Ölüme Neden Olan SinyalIzasyon Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Procaspase-8'in Bu Komplekste İşleniş

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, doğrudan ölüme neden olan sinyal kompleksinde (DISC) caspase-8 işlemenin algılanmasını sağlayan ve bu kompleksin bileşimini belirleyen deneysel bir iş akışı sunulmaktadır. Bu metodoloji, hücre ölüm yollarının moleküler mekanizmalarının çözülmesinden apoptoz ağlarının dinamik modellemesine kadar geniş uygulamalara sahiptir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dış apoptoz, CD95/Fas/APO-1 veya tümör nekroz faktörüne bağlı apoptoz indükleyici ligand (TRAIL)-reseptör 1/reseptör 2 (TRAIL-R1/R2) gibi ölüm reseptörlerinin (DR) aktivasyonu ile aracılık eder. Bu reseptörlerin konyak ligandları ile uyarılması, ölüme neden olan sinyal kompleksinin (DISC) montajına yol açar. DISC, ölüm etki alanı (FADD), prokaspazlar-8/-10 ve hücresel FADD benzeri interlökin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör proteinleri (c-FLIP'ler) ile Fas ilişkili protein olan DR'den oluşur. DISC, procaspase-8 işleme ve etkinleştirme için bir platform görevi görür. İkincisi, DISC'de bir araya getirilen ölüm efektörü etki alanı (DED) filamentlerinde küçültme/oligomerizasyon yoluyla gerçekleşir.

Procaspase-8'in aktivasyonu, birkaç adımda gerçekleşen işlenmesi ile takip edilir. Bu çalışmada, bu komplekste DISC oluşumunun ölçülmesine ve procaspaz-8'in işlenmesine olanak sağlayan yerleşik bir deneysel iş akışı açıklanmaktadır. İş akışı, batı blot analizi tarafından desteklenen immün önksepitasyon tekniklerine dayanmaktadır. Bu iş akışı, DISC'ye prokaspaz-8 işe alımının farklı adımlarının ve işlenmesinin dikkatli bir şekilde izlenmesine izin verir ve dışsal apoptozun moleküler mekanizmalarını araştırmak için son derece önemlidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En iyi çalışılan ölüm reseptörlerinden (DR) biri CD95'tir (Fas, APO-1). Dışsal apoptotik yol, DR'nin konyak ligand ile etkileşimi ile başlar, yani CD95L, CD95 veya TRAIL-Rs'ye bağlanır. Bu, ilgili DR. DISC'de DİSK oluşumu ile sonuçlanır CD95, FADD, procaspaz-8/-10 ve c-FLIP proteinleri1,2'den oluşur. Ayrıca, DISC, CD95 ve FADD gibi ölüm alanı (DD) içeren proteinler ile FADD, procaspase-8/-10 ve c-FLIP gibi DED içeren proteinler arasındaki etkileşimlerle bir araya getirilir (Şekil 1). Procaspase-8, DED'lerinin ilişkilendirilmesi yoluyla oligomerizasyondan geçer, bu da DED filamentlerinin oluşumuna ve ardından prokaspaz-8 aktivasyonu ve işlenmesine neden olarak ortaya çıkır. Bu, hücre ölümüne yol açan bir kaspaz kaskad tetikler (Şekil 1)3,4. Bu nedenle, prokaspaz-8, ILGILI makromoleküler platform DISC'de etkinleştirilen CD95 veya TRAIL-Rs tarafından aracılık edilen dış apoptoz yolunun merkezi bir başlatıcı kaspazıdır.

İki procaspase-8 izoformunun, yani procaspase-8a (p55) ve -8b 'nin (p53), DISC5'ealındığı bilinmektedir. Her iki izoform da iki DED'den oluşur. DED1 ve DED2, prokaspaz-8a/b'nın N-terminal kısmında ve ardından katalitik p18 ve p10 etki alanlarında bulunur. Prokaspaz-8 DED'lerin detaylı kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) analizi, prokaspaz-8 proteinlerinin DED filamentleri4,6adı verilen filamentli yapılara bir araya topladığını ortaya koydu. Dikkat çekici bir şekilde, doğrusal prokaspaz-8 zincirlerinin başlangıçta dimerizasyon ve ardından DISC'de prokaspaz-8 aktivasyonu ile meşgul olduğu öne sürüldü. Şimdi, bu zincirlerin prokaspaz-8 DED filamentinin sadece bir alt yapısı olduğu bilinmektedir, ikincisi üçlü sarmal3, 4,6,7içine monte edilmiş üç zincirden oluşur.

DED filamentinde küçültme üzerine, prokaspaz-8a/b'daki konformasyonel değişiklikler prokaspaz-8'in aktif merkezinin oluşumuna ve aktivasyonuna yol açar3,8. Bunu, iki yoldan aracılık edilen procaspase-8 işleme takip eder: birincisi bir p43 / p41 dekolte ürününün üretimi ve ikincisi bir p30 dekolte ürününün ilk neslinden geçer. p43/p41 yolu, Asp374'te prokaspaz-8a/b'nın bölünmesiyle başlatılır ve p43/p41 ve p12 bölünme ürünleriyle sonuçlanır (Şekil 2). Ayrıca, bu parçalar Asp384 ve Asp210/216'da otomatik olarak bölünür ve aktif kaspaz-8 heterotetramer, p102/p18 29,10,11oluşumuna neden olarak. Ek olarak, p43/p41 işleme yoluna paralel olarak, Procaspase-8a/b'nın da Asp216'da bölündlüğü, bu da C-terminal bölünme ürünü p30'un oluşumuna yol açar, ardından proteolizi p10 ve p1810'a (Şekil 2).

DED filamentinde procaspase-8a/b aktivasyonu kesinlikle c-FLIPs12adlı proteinler tarafından düzenlenir. c-FLIP proteinleri üç izoformda oluşur: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)ve c-FLIPRaji (c-FLIPR). Her üç izoform da N-terminal bölgelerinde iki DED içerir. c-FLIPL ayrıca C-terminal katalitik olarak aktif olmayan kaspaz benzeri etki alanı12,13 'esahiptir. C-FLIP-c-FLIPS ve c-FLIPR'ninher iki kısa izoformu da DISC6, 14,15'teDED filament oluşumunu bozarak anti-apoptotik bir şekilde hareket eder. Ek olarak, c-FLIPL kaspaz-8 aktivasyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde düzenleyebilir. Bu hem pro- hem de anti-apoptotik etkilere neden olabilir16,17,18. Katalitik olarak aktif prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimerini oluşturan c-FLIPL, prokaspaz-8'in aktif merkezinin stabilizasyonuna ve aktivasyonuna yol açar. c-FLIPL'nin pro-veya anti-apoptotik işlevi doğrudan DED filamentlerindeki miktarına ve sonraki monte edilmiş prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimers19miktarına bağlıdır. DISC'deki düşük veya ara c-FLIPL konsantrasyonları, kaspaz-8'in aktivasyonunu destekleyen DED filamentinde yeterli miktarda prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimer ile sonuçlanır. Buna karşılık, artan c-FLIPL miktarları doğrudan DISC20'deanti-apoptotik etkilerine yol açar.

Birlikte ele alındığında, DISC'de procaspase-8a/b'nın etkinleştirilmesi ve işlenmesi, birkaç adımı içeren son derece düzenlenmiş bir süreçtir. Bu makalede, prokaspaz-8 işleminin doğrudan DISC'de ölçülmesi ve bu kompleksin bileşiminin analizi tartışılmaktadır. Bu, örnek DR kompleksi olarak CD95 DISC kullanılarak sunulacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T hücre deneyleri 42502-2-1273 Uni MD etik anlaşmasına göre gerçekleştirilmiştir.

1. Deney için hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu immün önkseçasyon için ortalama hücre sayısı 1 × 107'dir. Yapışan hücrelerin deneyden bir gün önce tohumlanması gerekir, böylece deney gününde 1 ×10 7 hücre vardır.

  1. Yapışan hücreleri deneye hazırlama
    1. Tohum 5-8 ×10 6 yapışan hücre 20 mL orta (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakınız) deney başlamadan bir gün önce 14,5 cm'lik yemeklerde her durum için.
    2. Deney gününde, hücrelerin% 80-90 birleştiğinden ve yemeğe yapışmasını sağlayın. Ortamı atın ve yapışık hücrelere taze ortam ekleyin.
  2. Deneme için süspansiyon hücrelerini hazırlama
    1. Deney başlamadan hemen önce 14,5 cm'lik yemeklere durum başına 1 × 107 süspansiyon hücresini 10 mL kültür ortamına dikkatlice yerleştirin (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın).
    2. Birincil hücreleri kullanıyorsanız, birincil T hücrelerini daha önce açıklanan yordam21'egöre yalıtın. Birincil T hücrelerini 24 saat boyunca 1 μg/mL fitohemagglutinin ile tedavi edin, ardından 6 gün boyunca 25 U/mL IL2 tedavisi.
    3. Deney başlamadan hemen önce 14,5 cm'lik yemeklere durum başına 1 × 108 birincil T hücresini 10 mL kültür ortamına dikkatlice yerleştirin (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Bu hücreler daha küçük olduğu için bu daha yüksek sayıda birincil T hücresi önerilir.

2. CD95L stimülasyon

  1. Hücreleri CD95L ile uyarın (daha önce20 veya ticari olarak mevcut olarak açıklandığı gibi üretilir (Bkz. Malzeme Tablosu)).
    NOT: CD95L konsantrasyonu ve stimülasyon süresi hücre tipibağımlıdır 13,15,22,23,24,25. Paralel olarak bir 'boncuk kontrolü' örneği oluşturmak için bir stimülasyon koşulu iki kez hazırlayın.
    1. Seçilen CD95L konsantrasyonu ile yapışan hücreleri uyarın. Plakayı bir açıda tutun ve ligand'ı yapışan hücrelere dokunmadan ortama borun.
    2. Ligand çözeltisini hücre süspansiyonuna pipetleyarak SÜSPANSIYON hücrelerini CD95L ile uyarın.

3. Hücre hasadı ve liziz

  1. Hücre tabaklarını buza yerleştirin.
    NOT: Ortamı atmayın. Ölmekte olan hücreler ortamda yüzer ve analiz için önemlidir.
  2. Hücre süspansiyonu içine 10 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve ekli hücreleri plakadan kazıyın. Hücre süspansiyonu 50 mL tüpte toplayın.
  3. Hücre kabını 10 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve yıkama çözeltisini aynı 50 mL tüpe yerleştirin. Hücre süspansiyonu 5 dakika, 4 °C için 500 × g'da santrifüj edin.
  4. Üstnatant atın ve hücre peletini 1 mL soğuk PBS ile yeniden depolayın. Hücre süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  5. Hücre süspansiyonu 5 dakika, 4 °C için 500 × g'da santrifüj edin. Üstnatant atın ve hücre peletini 1 mL soğuk PBS ile yeniden depolayın.
  6. Hücre süspansiyonu 5 dakika, 4 °C için 500 × g'da santrifüj edin. Süpernatant atın ve hücre peletini 1 mL lizis tamponu ile yeniden canlandırın (%4 proteaz inhibitörü kokteyli içerir). Buzda 30 dakika kuluçkaya yatır.
  7. Lisatı maksimum hızda (~17.000 × g)15 dakika, 4 °C'ye santrifüj edin.
  8. Süpernatantı (lysate) temiz bir tüpe aktarın. Peletin at. Başka bir tüpe 50 μL likür alın. Bradford tahlil ile protein konsantrasyonu analiz ve bir şişede 25 μg proteine karşılık gelen lysate miktarını alın. Şişeye yükleme tamponu (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. -20 °C'de lisat kontrolü olarak saklayın.

4. İmmün Önseçme (IP)

  1. 2 μL anti-APO-1 antikorları ve 10 μL protein A sepharose boncuklarını (üretici tarafından önerildiği gibi) lisate ekleyin. Bir 'boncuk kontrolü' oluşturmak için lysate (uyarılmış örnek) içeren ayrı bir tüpe boncukların sadece 10 μL'sini ekleyin.
    NOT: A sepharose boncuk proteinini kullanırken uçları keserek veya IP için özel ipuçları satın alarak geniş delikli pipet uçlarını kullanın.
  2. Lysate karışımını antikorlar / protein A sepharose boncukları ile 4 ° C'de bir gecede hafif karıştırma ile kuluçkaya bırakın. Lysates antikorlar / protein A sepharose boncukları ile 4 dakika, 4 ° C için 500 × g'da santrifüj. Süpernatant atın, boncuklara 1 mL soğuk PBS ekleyin ve bu adımı en az üç kez tekrarlayın.
  3. Üstnatant atın. Boncukları tercihen 50 μL Hamilton şırıncı ile aspire edin.

5. Batı lekesi

  1. Boncuklara 20 μL 4x yükleme tamponu ekleyin (bileşim için Malzeme Tablosuna bakın) ve 10 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın. Lisat kontrollerini 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
  2. Lysates, IPs ve bir protein standardını % 12,5 sodyum dodecyl sülfat (SDS) jeline yükleyin (jel hazırlama için Malzeme Tablosuna bakın) ve 80 V sabit voltajla çalıştırın.
  3. Proteinleri SDS jelinden nitroselüloz membrana aktarın.
    NOT: Burada, ilgi proteinleri için optimize edilmiş yarı kuru teknik, 12 dakika (25 V; 2.5 A= sabit) üzerinden transfer için kullanılmıştır. Nitroselüloz membranını ve iki mini boyutlu transfer yığınını elektroforez tamponunda bekletin (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın, üreticinin talimatlarına göre hazırlayın) batı şişkinliğinden önce birkaç dakika bekletin.
  4. Şişmiş zarı bir kutuya yerleştirin ve blokaj çözeltisinde 1 saat boyunca engelleyin (PBS'de (PBST) % 0,1 Ara-20 + % 5 süt). Membranı nazik ajitasyon altında blokaj çözeltisi ile kuluçkaya yatırın.
  5. Membranı PBST ile her yıkamada 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.

6. Batı leke tespiti

  1. Belirtilen seyreltmede ilk birincil antikoru ekleyin (Malzeme Tablosunabakın) zara ekleyin ve hafif ajitasyonla 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  2. Membranı PBST ile her yıkamada 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  3. Membranı 20 mL ikincil antikorla (PBST+%5 sütte 1:10.000 seyreltilmiş) oda sıcaklığında 1 saat hafif sallanarak kuluçkaya yatırın.
  4. Membranı PBST ile her yıkamada 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  5. PBST'yi atın ve zara yaklaşık 1 mL yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin.
  6. Kemomuminsan sinyalini tespit edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Pozlama süresi ve yakalanan görüntü sayısı hücredeki protein miktarına ve kullanılan antikorların özgüllüğüne bağlıdır. Tespit için kullanılan her antikor için ampirik olarak kurulmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diske caspase-8 işe alımını ve CD95 DISC'deki işlenmesini analiz etmek için, bu makalede CD95 DISC'nin IP'sini batı blot analiziyle birleştiren klasik bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu, DISC'de caspase-8 aktivasyonunun birkaç temel özelliğin algılanmasını sağlar: caspase-8-aktive edici makromoleküler platformun montajı, DISC'ye procaspase-8'in işe alınması ve bu başlatıcı caspazın işlenmesi (Şekil 1 ve Şekil 2). Bu iş akışı, hassas hücrelerin CD95L ile zamana bağ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yaklaşım ilk olarak Kischkel ve ark.27 tarafından tanımlanmıştır ve o zamandan beri birkaç grup tarafından başarıyla geliştirilmiştir. Bu komplekste etkili DISC-immün önsepitasyon ve izleme kaspaz-8 işleme için birkaç önemli konu göz önünde bulundurulmalıdır.

İlk olarak, immün önseçme sırasında tüm yıkama adımlarını takip etmek önemlidir. Özellikle önemli olan sepharose boncuklarının son yıkama adımları ve sepharose boncuklarının kurumasıdır. Bu, immün önkeklim sinya...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmalarımızı desteklediği için AB programı ERDF (Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu) ve DFG (LA 2386) tarafından finanse edilen Wilhelm Sander Vakfı (2017.008.02), Dinamik Sistemler Merkezi 'ni (CDS) kabul ediyoruz. Karina Guttek'e deneylerimizi desteklediği için teşekkür ederiz. Prof. Dirk Reinhold'u (OvGU, Magdeburg) bize birincil T hücreleri sağladığı için kabul ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%12,5 SDS jelkendinden yapılmıştır:
3,28 mL damıtılmış H2O
2,5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 mL akrilamid
100 &mikro; L %10 SDS
100 &mikro; L %10 APS
7.5 &mikro; L TEMED

iki toplama jeli için:
3.1 mL damıtılmış H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL akrilamid
50 &mikro; L %10 SDS
25 & L %10 APS
7.5 &mikro; L TEMED
14,5 cm hücre kaplarıGreiner639160
akrilamidCarl RothA124.1
Yüksek geri kazanım filtreli ve geniş delikli aerosol filtre pipet uçlarıVWR46620-664 (Kuzey Amerika) veya 732-0559 (Avrupa)boncuk pipetlemek için kullanılır
seyreltme: PBST'de 1:4000 + 1:100 NaN3
deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanananti-APO-1 AbALX-805-038-C100sadece immünopresipitasyon için kullanılır
anti-kaspaz-10 Ab, BiozolMBL-M059-3seyreltme: 1:1000 PBST + 1:100 NaN3
>anti-kaspaz-3 Abhücre sinyali9662 Sseyreltme: PBST'de 1:2000 + 1:100 NaN3
deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanananti-kaspaz-8 Ab C15ALX-804-242-C100seyreltme: PBST'de 1:20 + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715seyreltme: PBST'de 1:2000 + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abbu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZOALX-804-961-0100tarafından satın alınabilirseyreltme: PBST'de 1:10 + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abbu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanmıştır veya ENZOADI-AAM-212-Eseyreltme: PBST'de 1:10 + 1:100 NaN3
anti-PARP Abhücre sinyali9542seyreltme: PBST'de 1:1000 + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-merkaptoetanolCarl Roth4227.2
Bradford çözeltisi
Protein Tahlili Boya Reaktif Konsantresi 450ml		Bio Rad500-0006talimatlarına göre kullanılır
CD95Lbu deneylerde Prof. P. Krammer tarafından sağlanır veya ENZOALX-522-020-C005
kemolüminesans dedektörü
Chem Doc XRS+		Bio Rad tarafından satın alınabilir
cOmplete Protese İnhibitör Kokteyli (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
DPBS (10x), Ca, MgPAN olmadan PANBiotech P04-53500H2O ile 1:10 seyreltme, buzdolabında saklama
etroforez tamponukendi kendine yapılır10x elektroforez tamponu:
60.6 g Tris
288 g glisin < br / > 20 g SDS
ad 2 L H < alt > 2 < / sub > O
1:10 kullanımdan önce seyreltme
glisinCarl Roth3908.3
Keçi Anti-Fare IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05seyreltme 1:10.000 in PBST + %5 süt
Keçi Anti-Fare IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05seyreltme 1:10.000 inç PBST +% 5 süt
Keçi Anti-Tavşan IgG-HRPSouthernBiotech4030-05seyreltme 1: 10.000 PBST +% 5 süt
İnterlökin-2 İnsan (hIL-2)Merckgroup / RocheT hücrelerinin aktivasyonu için11011456001
KClCarl Roth6781.2
KH2< / sub>PO4< / sub>Carl Roth3904.1
yükleme tamponu
4x Laemmli Numune Tamponu, 10 mL		Bio Rad161-0747üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
Luminata Forte Western HRP substratMilliporeWBLUFO500
lizis tamponukendi kendine yapılan13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
960 mL H2 O
ortamı adhaerent hücreler için DMEM F12 (1:1) w kararlı Glutamin,  2,438 g/LPAN BiotechP04-41154orta ortama %10 FCS, %1 Penisilin-Streptomisin ve %0.0001 Puromycin eklenmesi
gibco by Life Technologie 21875034orta süt tozuna %10 FCS ve %1 Penisilin-Streptomisin eklenmesi
Carl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTkendi kendine yapılan20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Ara-20
ad 2 L H2O
seyreltme kullanımdan 1:20 önce
PBST + %5 kendikendine yapılan50 gr süt tozu + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801T Hücrelerinin aktivasyonu için
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standardı All BlueBio Rad161-03733-5 & mikro arasında kullanın; L
Protein A Sepharose CL-4B boncuklarNovodirect / Th.GeyerGE 17-0780-01üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış afinite reçine boncukları
sıyırıcıVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
çalkalayıcıHeidolph
sodyum azidCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini boyutlu transfer yığınlarıBio Rad170-4270üreticinin talimatlarına göre kullanılır
TransBlot Turbo 5x Transfer TamponuBio Rad10026938 üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır
TransBlot Turbo Mini boyutlu niktroselüloz membranBio Rad170-4270üreticinin talimatlarına göre kullanılır
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
İki ayırıcı jel için Lizat anti-aktin Ab Sigma Aldrich A2103'e sub> veya Enzo tarafından satın alınabilir, , , , bu veya ENZO tarafından satın alınabilir , , ile satın alınabilir , üreticinin , , , , birincil T hücreleri için süt ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Death Inducing Signaling ComplexProcaspase 8 ProcessingCD95 DISC FormationExtrinsic ApoptosisImmunoprecipitation TechniqueWestern BlotCaspase 8 ActivationFADD Recruitmentc FLIP ProteinsCaspase 8 Activity Assay

Related Articles