Yöntem makalesi

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

6.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62852

⸱

23 Eylül 2021

 ,  ,  , 
1Graduate School of Genome Science & Technology, University of Tennessee Knoxville, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee Knoxville, 3Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory

Bu makalede

Özet

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Özet

Hedeflenen biyosentez için mühendislik hücresel metabolizması, mühendis hücrenin hayatta kalma gereksinimleri etrafında çalıştığından kapsamlı tasarım-yap-test-öğrenme (DBTL) döngüleri gerektirebilir. Alternatif olarak, hücresiz ortamlarda DBTL döngüleri gerçekleştirmek bu süreci hızlandırabilir ve ana bilgisayar uyumluluğu ile ilgili endişeleri hafifletebilir. Hücresiz metabolik mühendislik (CFME) için umut verici bir yaklaşım, metabolik olarak aktif ham hücre özlerini biyo-üretim ve modifiye proteinleri ve yolları hızla keşfetmek ve prototipleme için platformlar olarak kullanmaktadır. Bu yetenekleri gerçekleştirmek ve CFME performansını optimize etmek, lysate tabanlı hücresiz platformların metabolomlarını karakterize etmek için yöntemler gerektirir. Yani, analitik araçlar hedeflenen metabolit dönüşümlerindeki iyileştirmeleri izlemek ve lysate metabolizmasını manipüle ederken akı metabolit için değişiklikleri emmek için gereklidir. Burada, E. coli S30 lisatlarında metabolit üretimini ve akısını karakterize etmek için optik veya kütle spektrometrik tespiti ile birlikte yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak metabolit analizleri uygulandı. Özellikle, bu rapor, düşük maliyetli substratların (yani glikozun) çeşitli yüksek değerli ürünlere dönüştürülmesinde merkezi metabolik ara ve yan ürünlerin neslini ölçmek için kırma indeks tespiti (RID) kullanılarak HPLC analizleri için CFME lysates'ten örneklerin hazırlanmasını açıklar. Cfme reaksiyonlarında metabolit dönüşümünün analizi, 13C etiketli glikoz ile ters fazlı sıvı kromatografisi ile birlikte, spesifik metabolit verimlerini ve başlangıç malzemelerinden gelen lysate metabolik akıyı karakterize etmek için güçlü bir araç olan tandem kütle spektrometresine (MS / MS) bağlı olarak sunulmaktadır. Tamamen, bu analitik yöntemleri CFME lysate metabolizmasına uygulamak, bu sistemlerin daha hızlı veya yeni metabolik mühendislik görevlerini yürütmek için alternatif platformlar olarak ilerlemesini sağlar.

Giriş

Kimyasal üretim için mühendislik mikroplarındaki sınırlamalar, rakip hücresel sağkalım fonksiyonlarının bulunmadığı in vitro biyokimyasal reaksiyonların yeniden kapsüllenerek ele alınabilir1. Ayrıca, açık reaksiyon ortamı (yani hücre zarının yokluğu) manipülasyona daha elverişlidir ve canlı hücrelere kıyasla izlenmesi daha kolaydır. Hücresiz metabolik mühendisliğin (CFME) bu temel kavramı, hidrojen ve monoterpenler gibi değerli kimyasalları şimdiye kadar mikrobiyal hücre fabrikalarında sunulandan daha yüksek büyüklükteki üretim metrikleriyle sentezlemek için metabolik yolların yeniden uzlaştırılmasıyla zarif bir şekilde gösterilmiştir. . Bununla birlikte, tüm yolları arındırma yöntemleri şu anda zaman ve maliyetle kısıtlanmıştır. Alternatif olarak, hücresiz metabolik sistemler, tüm yol rekonsitasyonuna göre hızlı ve ucuz yöntemlerle ham hücre özlerinden türetilebilir4. Hücre özlerinde tutulan merkezi metabolizma, 24 saat5,6üzerinde merkezi metabolik öncüller oluşturmak için tamponlanmış çözeltilerde enerji substratları (örneğin, glikoz ve enzimatik kofaktörler) ve tuzlarla desteklenebilir. Lysate bazlı CFME reaksiyonuna eksojen enzimler eklemek, glikozun yüksek titrelerde daha değerli kimyasallara daha karmaşık biyo-dönüşümlerini sağlar4,6,7. Hücre benzeri metabolik karmaşıklıkları nedeniyle bu sistemlerde verim tehlikeye girme eğiliminde olsa da, daha yüksek verim dönüşümü için lisat proteomları küratörlüğünü yapmak için benzersiz yöntemler geliştirilmiştir ve geliştirilmektedir7,8.

Lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik dönüşümleri gerçekleştirme kolaylığı, kimyasal üretimi hücre dışına tamamen taşımak veya bu tasarımları vivo2,9'da oluşturmadan ve test etmeden önce yüksek verime sahip yeni yolları prototipleme için bu mükemmel platformları yapar. Her iki uygulama için de metabolik dönüşümleri izlemek veya lysates metabolik akı genel değişiklikleri gözlemlemek için araçlar CFME ilerlemesinin ayrılmaz bir parçası. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), CFME reaksiyonlarının kimyasal bileşenlerini yüksek çözünürlükle ayırmak için kullanılabilir ve metabolit niceleme5,10için optik veya kütle spektrometrik dedektörleriyle bire bir olabilir. HPLC'nin temel prensibi, bir çözücüde çözünen (yani mobil faz) ve bir sütundan pompalanan analizlerin belirli sütun paketleme malzemesi (yani sabit faz)11ile etkileşime girmesidir. Kimyasal özelliklerine bağlı olarak, bu analitler sonunda sabit fazdan elde tutulmadan ve mobil faz tarafından bir dedektöre taşınmadan önce değişen tutma süreleri gösterir. Bu rapor, RID ve MS/MS algılamasından yararlanan HPLC tabanlı yöntemlerle E. coli lysate tabanlı CFME reaksiyonlarının hazırlanmasını ve analizini detaylandırmamaktadır.

HPLC, kırılma indisi algılaması (HPLC-RID) ile birleştiğinde, merkezi metabolik öncülleri ve son ürünleri hızlı bir şekilde tanımlamak için genel olarak erişilebilir bir yöntemdir. Kısaca, RID, analizlerin mobil faz12ile ışığın saptırılmasını nasıl değiştirdiğini ölçer. Numunelerdeki hedef analizlere karşılık gelen RID sinyalleri daha sonra standart çözümlerin RID sinyalleri ile karşılaştırmalarla ölçülebilir. CFME uygulamalarında, bu algılama modu en yaygın olarak boyut dışlama ve ligand değişim mekanizmalarının bir kombinasyonuna veya iyon moderatörlü bölüm kromatografisi 5 ,6,8,13'e göre bileşikleri ayıran HPLC sütunlarında kullanılmıştır. Bu özel teknik, glisat bazlı CFME reaksiyonlarında süksinit, laktat, format, asetat ve etanol gibi fermantasyon ürünlerinin oluşumunun yanı sıra glikoz gibi şeker substratlarının tüketimini hızlı bir şekilde ölçmek için kullanılır8. Bu bileşiklerin konsantrasyon değişikliklerini HPLC aracılığıyla kaydetmek, hem ham hücre özlerinin merkezi metabolik öncülleri havuza alma potansiyelinin aydınlatıcı olması hem de lysates6,8,14'tekiglikozdan karmaşık metabolik dönüşümler sırasında yol akısının fermentatif yollardan nasıl yönlendirildiğini anlamak için yararlı olmuştur. E. coli hücre özlerinde seminal CFME çalışmaları, fermantasyon bileşiklerinin glikoz katabolizminin son ürünleri olarak biriktiğini ve ayrıca eksojen enzimleri aşırı ifade eden lysates'te istenmeyen yan ürünler olarak ortaya çıktığını doğrulamaz6,15. Glikolitik reaksiyonları sürdürmek için kofaktörlerin (nad(P)H ve ATP) redoks eşdeğerlerinin yenilenmesinde fermentatif metabolizmanın gerekli bir rol oynadığı ileri sürülmektedir8. Bu nedenle, fermantasyon ürünlerini ayırmak için tasarlanmış HPLC tabanlı bir optik algılama yöntemi, çeşitli lisat tabanlı CFME görevlerini yürütürken kullanışlı ve yaygın olarak uygulanan bir araçtır.

CFME karbonhidrat, organik asit veya alkol olmayan metabolik son ürünleri biriktirmek için uygulanabilir4. Sentezlendikleri kadar hızlı tüketilen ara maddelerin ölçümü de istenebilir10. HPLC-RID'e maliyet ve zorluk açısından erişilebilir olsa da, bu yöntem metabolitleri yalnızca saklama süresine göre ayırt etme yeteneği ile kısıtlanır. Sıvı kromatografisi MS/MS algılama (LC-MS/MS)16ile birleştiğinde daha geniş bir metabolit yelpazesi analiz edilebilir. Bu yöntemle, mobil fazdaki analizler iyonize edilir ve her molekülün kütle ve yük özelliklerine göre farklı olarak tespit edilir. Hem metabolit'in kütle-şarj oranı (m/z) oranı hem de sütundaki tutma süresi hakkında bilgi, böylece çoğu metabolik ara ve son ürünün yüksek çözünürlüklü ayrılmasını kolaylaştırır16. Bu algılama tekniği, çok daha düşük akış hızları ve numune enjeksiyon hacimleri sağlayan nano-sıvı kromatografisi ile de birleşerek karmaşık lisat arka plan17'dekiküçük moleküllerin daha hassas bir şekilde algılanmasını sağlar. LC-MS/MS ayrıca izotop etiketleme ile uygulanabilir, çünkü birikmiş etiketler analitlerin m/z değerlerinde değişiklikler verir18. 13C6-glikoz substratı ile desteklenmiş bir CFME reaksiyonundan çıkarılan zaman noktası ölçümleri, özellikle takviye edilen glikozdan elde edilen son veya yan ürünleri belirleyebilir. Bu izotop izleme yöntemi henüz CFME çalışmalarında yaygın olarak uygulanmasa da, özellikle bu reaksiyonlardaki tuz karşıtları (yani asetat ve glutamat) ikincil substratlar olarak katabolize edildiğinden, lysate tabanlı CFME sistemlerinde metabolik dönüşümleri anlamak için güçlü bir araçtır19. Bu teknikten yararlanmak, bu güne kadar tam olarak anlaşılamayan lysates'te glikoz metabolizmasının kapsamlı bir resmini çizebilir. Burada, protokol nano-sıvı kromatografisi için nanoelekrospray iyonizasyonu (nano ESI) MS / MS ile birleştiğinde, özellikle E. coli lisates'te olası bir glikoz metabolizması modelini sorgulamak için kullanılabilecek bir yöntemi detaylandırmaktedir (Şekil 1). Model, fermentatif yolların raporlarına ve pentoz fosfat yolunun zengin medyada yetişen suşlardan elde edilen E. coli lysates'te aktif olduğu raporlarına dayanmaktadır5,6,8,14. Teknik ayrıca amino asit üretimini araştırmak için kullanılır, çünkü lizazlardaki glikozdan amino asit anabolizmi hakkındaki mevcut bilgi aromatik amino asitlerin sentezi gibi birkaç örnekle sınırlıdır7. Bu yollardaki son ürünlerin ve ara ürünlerin (yani organik asitler, şeker fosfatlar ve amino asitler) çoğunlukla polar doğası göz önüne alındığında, burada ters fazlı sıvı kromatografisi kullanılmıştır. Bu teknik kutup bileşiklerini kutupsal olmayan sabit fazdan elution ile ayırır. Bu bileşikler daha sonra nano ESI tarafından en az bir negatif temel yüke sahip analizlerin tespit edilmesine izin veren negatif iyon modunda iyonize edildi ve bu nedenle asidik bileşikleri tespit etmek için yararlıdır. Bu teknik burada glikoz türevi 13C içeren metabolitleri analiz etmek için kullanılır ve lysates glikoz metabolizmasını anlamak için LC-MS / MS'in yararını gösterir.

Protokol

1. HPLC-RID nicelemesi için kurs CFME reaksiyonlarını başlatma, durdurma ve işleme.

  1. Daha önce hazırlanan E. coli lysates'i çözün ve reaksiyon bileşenlerinin geri kalanını buz üzerinde hazırlayın.
    NOT: Burada bildirilen elyatlar, 2xYPTG (% 1.8 glikoz) ortamda orta kütük fazında yetişen E. coli BL21DE3-Star'dan türetilmiştir.
    1. Uygun miktarda filtre sterilize edilmiş (0,20 μm gözenek filtresi) S30 tamponu (buzul asetik asitli pH 8,2'ye ayarlanmış 1 M Tris-OAc, 1,4 M Mg(OAc)2ve 6 M KOAc) hazırlayın.
    2. S30 tamponunda glikoz, glutamat tuzları, ATP, Koenzim A, NAD+, Bis-Tris tamponu ve dipotassium fosfat içeren bir enerji karışımı hazırlayın. Burada CFME reaksiyonlarını hazırlamak için kullanılan istenen reaksiyon hacmindeki son konsantrasyonlar 100 mM glikozdu, 18 mM magnezyum glutamat, 15 mM amonyum glutamat, 195 mM potasyum glutamat, 1 mM ATP, 0,2 mM Koenzim A, 1 mM NAD+, 150 mM Bis-Tris ve 10 mM dipotassium fosfat.
  2. Toplam lysat proteininin 4,5 mg/mL'si ile son reaksiyonları hazırlamak için bileşenleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde birleştirin. Burada CFME reaksiyonları zaman noktası başına üç taraflı olarak 50 μL'lik son hacimlerle hazırlandı. Reaksiyonları kendi zaman dilimleri için 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Glikoz ve glutamat tuzları ile erken metabolik reaksiyonları önlemek için hızlı çalışın ve reaksiyon karışımının son bileşeni olarak lisat ekleyin. Reaksiyon karışımlarının buz üzerinde ne kadar süre inkübe edildiğine bağlı olarak minimum glikoz tüketimi ortaya çıkabilir.
  3. HpLC-RID analizi için reaksiyonları sonlandırın ve numuneleri işleyin.
    1. Triplikat reaksiyonları uygun zaman noktalarında sonlandırmak için, hemen her numunenin nihai reaksiyon hacmine eşit miktarda% 5 trikloroasetik asit ekleyin (yani, 50 μL reaksiyona% 5 trikloroasetik asitin 50 μL'si). Her numuneyi reaksiyon hacminin 2 katı (yani 100 μL) steril su ile seyreltin.
    2. Sıfır süresini yeniden yakalamak için, reaksiyon bileşenlerinin geri kalanını eklemeden önce toplam son reaksiyon hacmiyle (yani 50 μL) aynı hacimde%5 trikloroasetik asidi lilatla karıştırın. Bu asitleşme adımı, glikozu önemli ölçüde metabolize etmeden önce lysate enzimlerini çökeltir.
    3. Örnekleri ve santrifüjleri 5 dakika boyunca 11.600 x g'da bir tezgah üstü mikrosantrifüj üzerinde vorteks edin ve organik analizleri içeren süpernatantları temiz tüplere aktarın. HPLC analizleri farklı bir günde yapılacaksa numuneleri -20 °C'de saklayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce depolanan numuneleri buz üzerinde çözdüğünüzden emin olun.
    4. Her bir süpernatantı 0,22 μm gözenek filtresi ile filtreleyin. Şırındlara alternatif olarak, santrifüj tüp filtreleri kullanın ve süpernatantları 1 dakika boyunca 16.300 x g'da santrifüjleyin.
    5. Her filtrat temiz bir HPLC cam şişeye aktarın. Şişeleri HPLC otomatik örnekleyici tepsisine yükleyin.
  4. Örnekleri standart eğri üretimi için hazırlayın.
    1. CFME reaksiyonlarında glikozun başlangıç konsantrasyonunun üzerinde equimolar miktarlarda S30 tamponunda çözünmüş tüm hedef analizlerin bir stok çözeltisini hazırlayın. Burada 150 μM glikoz, süksinat, laktat, format, asetat ve etanolden oluşan bir stok çözeltisi hazırlandı. 0 μM ile stok konsantrasyonu (yani 150 μM) arasında değişen son konsantrasyonlarda triplikat 50 μL çözeltileri elde etmek için stok çözeltisinden 1:1 (v/v) seri seyreltme gerçekleştirin.
    2. Her çözeltiyi 50 μL% 5 trikloroasetik asit ve 100 μL steril su ile seyreltin. 1.3.4-1.3.5 adımlarını yineleyin.
      NOT: Metabolit konsantrasyonlarının doğru nicelleştirilmesini sağlamak için her numune grubuyla standart eğri üretimi için çözümler çalıştırın.

2. HPLC sistemini metabolit tespiti için hazırlama.













  2. figure-protocol-1

Sonuçlar

Glikozdan yaygın fermantasyon ürünlerinin lizat bazlı hücre içermeyen sentezini ölçmek için, 2xYPTG ortamlarında yetişen suşlardan elde edilen lizatlar birincil karbon kaynağı olarak 100 μM glikoz ile beslendi8. Reaksiyonlar protein asitlenmesi ile 24 saat boyunca durduruldu. Glikoz katabolizmasından üretilen piruvat, süksinit, laktat, format, asetat ve etanol içeren filtrelenmiş süpernatantlar, RID modülü ile donatılmış bir HPLC sisteminin otomatik örnekleyici modülüne yüklendi. 1.17 μM'de fermentatif son ürünler ve glikoz filtrelenmiş karışımları ile şişeler, S30 tamponunda 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM ve 150 μM konsantrasyonlar standart olarak cihaza yüklendi. Analizler bir HPLC sütunundan RID'ye isokratik olarak elde edildi. 1 ila 150 μM aralığında glikoz, süksinat, laktat, format, asetat ve etanol için tepeler RID ile çözülebilir. Glikoz için tepe alanları, zaman seyri ve standart eğri örnekleri için RID verilerinden manuel entegrasyon ile türetilmiştir. Succinate, laktat, format, asetat ve etanol için çıkarılan tepe alanları otomatik olarak entegre sinyallerden alınmıştır. Tüm standart eğriler (tepe alanı ve bilinen konsantrasyon) R2 değerlerine sahipti >0.99 ve burada kullanılan konsantrasyon aralığı boyunca doğrusaldı.

Tüm hedef analizler için molar konsantrasyonları kendi standart eğrilerinden hesaplanmıştır. Glikoz reaksiyonun ilk 3 h'sine kadar tüketildi ve esas olarak laktata fermente edildi (Şekil 2A,B). Etanol birikimi de reaksiyonun ilk 3 h'sinde önemli ölçüde meydana geldi ve daha sonra durdu (Şekil 2C). 3 saat sonra önemli glikoz tüketimi ile anlamlı laktat ve etanol üretiminin gözlemlenmesi, laktat ve etanol üretim yollarının glikoliz yoluyla sürekli glikoz tüketimi için gerekli olan glikolitik NADH'dan 1 net mol NAD+ yenilenmesine izin verinden daha önce görülmemiş bir şey değildi(Şekil 1). Laktat ve etanol böylece lysate bazlı hücre içermeyen glikoz metabolizmasında başlıca fermantasyon son ürünleri olarak düşünülebilir. Asetat başlangıçta S30 tamponunun bir bileşeni olarak reaksiyonlarda mevcuttu ve beklenmedik bir şekilde sadece glikoz tüketimi yavaşladığında 6 saat sonra metabolizma nedeniyle birikti (Şekil 2D). Bu sonuç, asetat fermantasyonunun daha önceki zaman noktalarında hızlı glikolitik akıyı mutlaka etkinleştirmediğini göstermektedir. Bu arada, format ve succinate küçük fermantasyon ürünleri olarak sentezlendi (Şekil 2E,F). Yöntem, E. coli S30 lisatlarında şeker substrat tükenmesinin ve fermentatif ürün oluşumunun mutlak nicelemesini sağladı.

Özellikle lysate glikoz metabolizmasını profillamak için MS tespiti burada uygulandı. 2xYPTG ortamlarında yetişen suşlardan elde edilen lysates karbon kaynağı olarak 13C6-glikoz ile beslendi. CFME reaksiyonları üç taraflı olarak 0 saat, 1 saat, 2 saat ve 3 saat boyunca çalıştırıldı. Her zaman noktasından alınan numuneler, ters fazlı bir sütunla donatılmış bir LC sistemine yüklendi ve Fourier dönüşümü ve iyon kapanı kütle spektrometreleriyle birleştirilmişti. Organik asitler, şeker fosfatlar ve amino asitleri analiz etmek için negatif iyon modu spektrumları elde edildi ve işlendi. Merkezi karbon metabolizmasına ait 13C etiketli türün hesaplanan teorik kütleleri, özellikle glikoz türevi bileşikleri tanımlamak için arandı. E. coli CFME'deki kullanılan kaynak gerinim ekim koşullarına ve önceki aktif yol raporlarına dayanarak, burada lysate proteomunun glikolitik fermantasyona, pentoz fosfat yoluna ve muhtemelen amino asit anabolizması 5 , 6,7,8,14 ' e (Şekil 1)glikoz besleyen metabolik bir ağdan oluştuğu varsayılmıştır. Bu nedenle, arama, glikoz türevi 13C etiketlerini içeren 16 metabolitin açıkça açıklama eklendiğini gösteren bu yolların üyelerine daraltıldı (Ek Tablo 1).

13 C6-glikoz, glikolitik ara bolluklardaki dalgalanmaların kanıt ettiği gibi glikoliz yoluyla gözle görülür şekilde tüketildi (Şekil 3A-E). HPLC-RID verileriyle tutarlı olarak, glikoz 13C3-laktata birikti ve reaksiyonun ilk 3 h'si içinde 13C3-succinate fermente edildi(Şekil 4A, B). 13C3-succinate izotopologue oluşumu, süksitin 2 karbonlu asetil-CoA molekülünün TCA döngüsüne girişinden değil, 3 karbon fosfolinolün (PEP) molekülünün karboksilasyonu ile üretilmesi muhtemel olduğu lysate glikoz metabolizmasının önerilen modelini destekler (Şekil 1). TCA döngüsünün aktivasyonu önceki CFME çalışmalarında varsayılmıştır, ancak TCA'nın diğer 13C etiketli ara malı burada tespit edilmiştir8,19,21. 13 C3-aspartat sentezi ancak ilk h içinde meydana geldi ve PEP'in doğrudan oksaloasetat'a dönüştürüldüğü fikrini güçlendirerek tüketildi (Şekil 1, Şekil 6C). Veriler, glikoz bakımından zengin medyada (2xYPTG) fermentatif büyüme sırasında toplanan kaynak suşlarından elde edilen bir lysate proteomunu yansıtır. Bu, süksinit üretimine katılmayan TCA enzimlerinin geri kalanının oksidatif bir TCA dalı oluşturduğu anlamına da neden olacaktır (Şekil 1). Bununla birlikte, bu yoldaki metabolitlerin hiçbiri tespit edildi, muhtemelen CFME reaksiyonuna tuz karşıtlığı olarak eklenen yüksek glutamat konsantrasyonları bu dalın ilerlemesini önler.

HPLC-RID verileri ayrıca 3 saat reaksiyon süresi içinde 13C2-asetat algılamasının olmaması ile tamamlanır ve glikozdan 3 h'ye kadar asetat birikmesi olmadığını gösterir(Şekil 2B). Bununla birlikte, asetatın doğrudan öncüsü olan asetil-fosfat (asetil-P), asetil-CoA'dan asetat sentezi için Pta-AckA yolunun Pta kolunun aktif olduğunu düşündürmektedir (Şekil 4C,D). AckA katalizörlü defosforilasyonu 13C2-asetil-P ila 13C2-asetat, asetat reaksiyonlarda kullanılan S30 tamponunun önemli bir bileşeni olduğu için muhtemelen bu zaman dilimi içinde oluşmaz (Şekil 1, Şekil 2B).

Şeker fosfatları 6-fosfooğluconolactone (6PGL), 6-fosfogluconat (6PG), ribüloz-5-fosfat (Ru5P) ve sedoheptulose-7-fosfat (S7P) için 13C6-glikoz türevi karbonların birleştirilmesi de gözlenmiştir (Şekil 5). Bu sonuçlar pentoz fosfat yolunun lizat glikoz metabolizmasına katılımını doğrular ve muhtemelen daha önce proteomik bir çalışma tarafından önerilen 13C9-tirozin sentezini besler, aynı zamanda 13C5-histidin üretimi için bir öncü sağlar (Şekil 6A,B)7. Etiketli fenilalanin ve triptofan burada gözlenmemiştir ve esansiyel amino asitlerin çoğu da gözlenmemiştir. Bununla birlikte, amino asit anabolizminin besin açlığı çeken koşullarda veya sabit faz7,22'deyetişen hücrelerden elde edilen lysatlarda zenginleştirilmesi muhtemel olduğundan, bu tamamen şaşırtıcı değildir. Ayrıca, şimdiye kadarki veriler, glikoliz ve fermantasyon ara maddelerinin kofaktör rejenere edici uç reaksiyonlara doğru hunilendiğini göstermektedir, gliseraldehit-3-fosfat, piruvat ve asetil-CoA'dan (örneğin glisin, sistein, serine, alanin, valine, leucine ve lizin) elde edilen birçok amino asidin sentezini engellemelidir (Şekil 1). Belirtildiği gibi, ilk bir saat içinde 13C3-aspartat üretilirken, aspartat 13C içeren amino asit (yani, threonine, isoleucine, methionine ve asparagine) türetilmiştir, çünkü glikoz türevi aspartat fermantasyona katılır (Şekil 1, Şekil 6C). Son olarak, glutamattan elde edilen etiketli glutamat ve amino asitlere doğru akı reaksiyon ortamında yüksek glutamat seviyeleri tarafından engellenmiş olabilir (Şekil 1).

figure-results-1
Şekil 1: Yüksek glikoz konsantrasyonlarında katlanarak büyüyen E. coli BL21DE3-Star'dan elde edilen putatif metabolik bir lysates modeli. Glikoliz (yeşil), pentoz fosfat yolu (koyu turuncu) ve asetil-CoA'dan fermentatif yolların (mavi) ara ve son ürünleri lizat bazlı CFME'de bildirilmiştir. Süksinit fermantasyonunun varlığı, oksidatif TCA dalının (gri) aktivasyonunu ima eder. Lysates amino asit anabolizması (altın) iyi tanımlanmamıştır ve burada araştırılmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: E. coli ham özleri ile hazırlanan CFME reaksiyonlarında glikoz tüketimi ve fermentatif son ürün sentezi için HPLC-RID verileri. (A) Glikoz tüketimi ve (B) laktat, (C) etanol, (D) asetat, (E) formate ve (F) CFME reaksiyonlarında süksinit üretimi 24 saat boyunca izlendi. Standart eğrilerle ölçülen ortalama mM konsantrasyonları ve hata çubukları (n = 3) sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: E. coli lysate CFME'de 13 C6-glikoz ve 13C etiketli glikolitik ara malı zaman seyri eğilimleri. (A) 13C6-glikoz, (B) 13C6-glikoz-6-fosfat/ fruktoz-6-fosfat, (C ) 13C6-fruktoz-1,6-bifosfat, (D) 13C3-gliseraldehit-3-fosfat/dihidroksiyaceton fosfat ve (E) 13C6 -CFME reaksiyonlarında 3 saatin üzerindeki piruvat. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: E. coli lysate CFME'de 13C6-glikoz fermantasyonunda ara ve son ürünlerin zaman seyri eğilimleri. 3 saat üzerindeki CFME reaksiyonlarında (A) 13C3-laktat, (B) 13C3-süksinit, (C) 13C2-asetil-fosfat ve (D) 13C2-asetil-CoA'nın bağıl bollukları. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: E. coli lysate CFME'de 13C6-glikoz türevi pentoz fosfat yolu aralarının zaman seyri eğilimleri. (A) 13C6-6-fosphogluconolactone, (B) 13C6-6-fosfolikonat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfat ve (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfat 3 saatin üzerinde. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: E. coli lysate CFME'de saptanan 13C6-glikoz türevli amino asitlerin zaman seyri eğilimleri. (A) 13C9 -tirozin,(B) 13C5-histidin ve (C) 13C3-aspartate 3 saat üzerinde göreceli bolluk. MzMINE yazılımı tarafından çıkarılan ham tepe alanları, pozitif ek açıklamalar için ortalamaları ve hata çubuklarını (SE) hesaplamak için kullanılmıştır (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmiş bir CFME reaksiyonunda majör fermentatif ürünler için zirveleri gösteren temsili HPLC-RID kromatogramı. Glikoz, süksinit, laktat, format, asetat ve etanol zirveleri, 5 mM sülfürik asit çözücü ile izokratik elüasyon sırasında bir HPLC sütununda tutma süreleri ile yeterince ayırt edilebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: 13C etiketli metabolitler için temsili kütle spektrumu, özellikle (A) laktat,(B) glikoz ve (C) 6-fosfoogluconat (6PG) 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmiş bir CFME reaksiyonunda.

Ek Tablo 1: Algılanan 13C etiketli metabolit listesi, saklama süreleri (MZmine kullanan örnekler arasında hizalanmış), teorik olarak tam 13C etiketli negatif mod m/z değerleri, algılanan özelliklerin m/z değerleri ve hesaplanan kütle hataları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Özetlenen HPLC-RID yaklaşımı, şeker substrat tüketimini ve daha sonra zaman içinde lisat merkezi metabolizmanın ana organik asit ve alkol ürünlerine dönüşümlerini başarıyla ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol tek bir mobil faz kullanarak basit bir izokratik yöntem kullanıyor, minimum numune hazırlama gerektiriyor ve basit bir hedeflenen aşağı akış analizine izin veriyor. HPLC-RID yöntemiyle ölçülen analizler, yalnızca saklama süreleri ve dolayısıyla seçilen sütun reçinesi ile etkileşimleri ile ayırt edilir. Burada kullanılan HPLC sütunu özellikle karbonhidratları, organik asitleri ve alkolleri boyut dışlama ve ligand değişimini (yani iyon moderatörlü bölme kromatografisi) birleştirerek ayırmak için tasarlanmıştır. Bu nedenle, açıklanan yöntem, karbonhidrat substratlarının daha hedefli analizi ve öncelikle lisat bazlı biyo-dönüşümleri kolaylaştırması ve enerji vermesi beklenen glikoz fermantasyon yollarının son ürünlerini seçmek için yararlıdır8,15,21. Ancak, bu protokol hücre özlerinde diğer metabolik yolların aktivasyonunu hesaba katmaz. Amino asitler ve şeker fosfatları23 ,24gibi diğer metabolitleri tespit etmek için diğer kromatografik ayırma tekniklerini (yani hidrofilik etkileşim kromatografisi), gradyan elütasyon yöntemlerini, daha karmaşık numune hazırlamayı (yani türetmeyi) ve farklı optik dedektörleri (örneğin, ultraviyole ışık veya buharlaştırıcı ışık saçılma dedektörleri) kullanan boru hatları kullanılabilir. . Alternatif olarak, LC-MS/MS kullanılarak lysate metabolizmasını incelemek için küresel bir yaklaşım alınabilir.

Açıklanan LC-MS/MS yöntemi, daha geniş bir metabolit aralığını ölçmek ve tanımlamak için tek bir iş akışıdır. LC-MS/MS, metabolitleri tutma süresine ve yüksek çözünürlüklü m/z oranlarına göre ayırt etme hassasiyeti ve yeteneği nedeniyle metabolom profilleme için son teknoloji ürünü bir analitik araçtır16. Merkezi karbon metabolik yolları ve amino asit anabolizması üzerinde durulan negatif mod MS/MS, özellikle polar organik asitleri, şeker fosfatlarını ve amino asitleri tespit etmek için uygulanmıştır. Nano-sıvı kromatografi tekniği ile birleştiğinde, yöntem karmaşık lisat arka plan17'dekiküçük molekülleri tespit etmek için yüksek hassasiyet sağlar. Bununla birlikte, lysate tabanlı CFME metabolizmasının profillerinin profillendirilmesi açısından, açıklanan LC-MS / MS protokolünün bir sınırlaması, 50 m / z'lik alt algılama sınırıdır, bu da lysate glikoz metabolizmasında önemli bir ürün olan etanolün ve her ikisinin de ayrıntılı HPLC-RID yöntemiyle kolayca ölçülen formatlanmasını önler. LC-MS/MS ile karşılaştırıldığında, HPLC-RID maliyet ve zorluk açısından göreceli erişilebilirliğin ek avantajına sahiptir. İkinci noktaya kadar, burada açıklanan LC-MS/MS yönteminin sorunlarını gidermek, kütle spektrometresinde bir dereceye kadar uzmanlık gerektirebilir. Bununla birlikte, MS algılaması, metabolomlardaki etiketli izotopları da ayırt edebildiğinden RID üzerinde benzersiz çekici uygulamalara sahiptir, karmaşık lisat metabolik ağ aracılığıyla karbon hareketini takviyeli substratlardan anlamak için mükemmel bir teknik18. Burada 13C6-glikoz ile reaksiyonları destekleyerek ve aşağı akış 13C içeren metabolitlerin göreceli bolluk değerlerini analiz ederek böyle bir yaklaşım uygulandı. Analiz, aktif ve aktif olmayan yolların tanımlanmasına izin vererek, daha önce bildirilen varsayımları destekledi ve lisatlardaki metabolik akı hakkında yeni içgörüler sağladı. Belirli analizler için yöntem dahilinde değişiklikler de yapılabilir. Örneğin, 13C etiketli hedef bileşiğin standart çözümleri, zaman içinde glikoz türevi moleküllerin mutlak nicel ölçümlerini elde etmek ve akı dağılımları hakkında sonuçlar çıkarmak için numunelerle birlikte analiz edilebilir. Pozitif yüklü bileşiklerin daha iyi algılanması, pozitif mod algılama için ayarlanmış .meth dosyalarıyla diziler çalıştırılarak mevcut iş akışında da etkinleştirilebilir.

Açıklanan her iki yöntemde de analitik örnekleme, yüksek tekrarlanabilirlik sağlayarak uygun şekilde otomatikleştirilmiştir. Ayrıca, uygun cihaz taşıma uygulamaları ve bakımı gözlendiği sürece sorunsuz analitik çalıştırmalar beklenebilir. CFME reaksiyonlarını analiz etmek için bu araçları kullanırken, örneklemenin yukarı ve aşağı akışında daha kritik hususlar yapılmalıdır. Numune hazırlama sırasında, zaman kursu kontrollerinin zaman sıfırı temsili olması önemlidir. Burada, metabolik reaksiyonları durdurmak için asitleşme ile proteinler lysates çökebilirsiniz. Zaman sıfır örnekleri için, asit çözücü glikoz içeren reaksiyon karışımını eklemeden önce lysate ile birleştirildi. Trikloroasetik asit ile asitleşme, HPLC-RID verilerinde gösterildiği gibi glikozun sıfır zamanında metabolize edilmesini etkili bir şekilde sağlamıştır (Şekil 2). Bildirilen LC-MS/MS analizinde glikoz metabolizmasını söndürmek için benzer bir prosedür yapılırken, daha sonraki zaman noktalarında çıkarılan örneklere göre önemli ölçüde düşük bolluk değerlerinde de olsa, zaman sıfır örneklerinde 13C etiketli metabolit tespit edildi. Ayrıca, bu gözlemler glikoliz ara maddeleri ile sınırlıydı. Veriler, reaksiyonların bu son derece hassas yöntemle tespit edilen ekstraksiyon çözücü ile asitleşmeden sonra bir dereceye kadar glikolitik aktiviteyi koruduğunu göstermektedir. Ancak bu etkinliğin kapsamı ölçülmelidir. Önceki bir çalışma, asidik ekstraksiyon çözücülerinin ara glikolitik reaksiyonları yeterince söndürmeyebileceğini, ancak önemli glikoz tüketimini durdurabileceğinibildirmiştir 10. Bu, burada kullanılan sistemde daha fazla araştırılmaya devam ederken, zaman-sıfır ve daha sonraki zaman noktası örnekleri arasındaki göreceli bolluk değerlerindeki sert değişiklikler glikoz metabolizmasındaki eğilimler olarak yorumlanabilir. Bununla birlikte, alternatif söndürme yöntemlerinin araştırılması, özellikle mutlak miktarlarda metabolik ara madde elde etmek için benzer uygulamalarda tavsiye edilir10. Ayrıca, aşağı akış yazılım analizleri sırasında iyi uygulamalar da gözlenmelidir. İnsan hatasını azaltmak için RID sinyallerinden tepe alanlarını manuel olarak entegre ederken tutarlılık zorunludur. Manuel entegrasyon, numunelerdeki metabolit konsantrasyonlarını ölçmek için manuel olarak entegre edilmiş tepe alanları kullanıldığında standartların tepe alanlarına da uygulanmalıdır. Hedeflenen LC-MS/MS analizi boyunca, MZmine analizinden gelen belirsiz ek açıklamalar, MS kalitesinde bir tarayıcı kullanılarak manuel tepe denetimi ile doğrulanmalı ve m/z özellikleri yalnızca hesaplanan kütle hataları kabul edilebilir olduğunda açıklama eklenmelidir. Burada, izotop arama için kapsamlı ve sağlam yazılım henüz belirlenmediğinden, bu analizler sınırlı bir hedef kümesi için manuel olarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, 13C etiketli metabolitleri aramak için bu tür otomatik yöntemler şu anda ortaya çıkıyor ve merkezi karbon metabolizması25'inötesindeki lysates'in profil oluşturması gibi daha karmaşık analizleri de kolaylaştıracaktır.

Gelişmiş sıvı kromatografisi, karmaşık metabolik karışımlarda küçük molekülleri ayırmak için sağlam ve yaygın olarak uygulanan bir yöntemdir11. Açıklanan yöntemler, lysate tabanlı CFME reaksiyonlarında metabolit dönüşümlerini başarıyla analiz etmek için bu ayırma tekniğini kırılma indeksi veya kütle spektrometrik algılaması ile birleştirilmiştir. HPLC-RID ve LC-MS/MS, aktif lysate metabolizmasını profilleme için ayrı ayrı güçlü araçlardır ve tamamlayıcılıkları her tekniğin doğal sınırlamalarını gidermek için daha da kullanılabilir. Bildirilen yöntemler, lysate metabolizmasını anlamak, hedeflenen metabolit dönüşümlerindeki gelişmeleri izlemek ve lysate metabolizmasını manipüle ederken metabolit akısına yapılan değişiklikleri emmek için kullanılabilecekleri için CFME'nin uygulanmasını ve geliştirilmesini sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar, bilinen rakip finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Bitki Mikrop Arayüzleri Bilimsel Odak Alanı (http://pmi.ornl.gov) kapsamında Genomik Bilim Programı, ABD Enerji Bakanlığı, Bilim, Biyolojik ve Çevre Araştırmaları Ofisi tarafından desteklenmiştir. Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı, DE-AC05-00OR22725 sözleşmesi kapsamında ABD Enerji Bakanlığı için UT-Battelle, LLC tarafından yönetilmektedir. Bu makale UT-Battelle, LLC tarafından ABD Enerji Bakanlığı ile DE-AC05- 00OR22725 Sözleşmesi kapsamında yazılmıştır. Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti makaleyi yayınlanmak üzere kabul ederek, Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin bu makalenin yayınlanmış formunu yayınlamak veya çoğaltmak veya başkalarının bunu yapmasına izin vermek için münhasır olmayan, ödenmiş, geri alınamaz, dünya çapında bir lisansa sahip olduğunu kabul eder. Enerji Bakanlığı, DOE Kamu Erişim Planı (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) uyarınca federal sponsorlu araştırmaların bu sonuçlarına kamu erişimi sağlayacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 μ m santrifüj tüpü filtreleri (spin kolonları)Corning Costar8160
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriVWR87003-294
1260 Infinity İkili LC PompaAgilentG1312BHPLC-RID sistemi
1260 Infinity Yüksek Performanslı Gaz GidericiAgilentG4225AHPLC-RID sistemi
1260 Infinity Kırılma İndeksi DedektörüAgilentG7162AHPLC-RID sistemi
1260 Infinity Standart Otomatik Numune Alma CihazıAgilentG1329BHPLC-RID sistemi
13C6-glikozSigma-Aldrich389374CFME reaksiyon karışımı bileşeni (LC-MS/MS)
500 mL 0.20 &; m gözenekli (PES membran) filtreVWR10040-436
Asetonitril (LC/MS sınıfı)Fisher ScientificA955LC-MS/MS
Adenozin trifosfatSigma-AldrichA7699CFME reaksiyon karışımı bileşeni
Aminex HPX 87-H sütunuHPLC-RID için Bio-rad1250140Kromatografi sütunu
Amonyum asetat (LC / MS sınıfı)Fisher ScientificA11450LC-MS/MS için çözücü hazırlama
Amonyum glutamatSigma-AldrichG1376CFME reaksiyon karışım bileşeni
Otomatik numune alma cihazı flakon kapakları (sarı, çıtçıtlı)Thermo ScientificC4011-50YLC-MS/MS için numune saklama/teslim
Otomatik numune alma şişeleri (0,30 mL, polipropilen)WheatonW225181LC-MS/MS için numune saklama/teslim
Tezgah üstü mikrosantrifüjFisher Scientific13-100-675
Bis-TrisSigma-AldrichB9754CFME reaksiyon karışım bileşeni
Koenzim A (CoA)Sigma-AldrichC4282CFME reaksiyon karışımı bileşeni
D-dekstroz (Glikoz)VWRBDH9230CFME reaksiyon karışımı bileşeni
Dipotasyum fosfatSigma-AldrichP8281CFME reaksiyon karışımı bileşeni
EtanolFisher ScientificBP2818100Standart eğri çözeltisi hazırlama için S30 tamponunda çözülmüş (HPLC-RID)
Formik asit (LC/MS sınıfı)Thermo Scientific85178LC-MS/MS için çözücü hazırlama
Erimiş silika (iç çap 100 μ m, dış çap 375 μ m)Polymicro TechnologiesWM22005-NDiçin Kromatografi sütunu
Sigma-AldrichA6283S30 tampon bileşeni
İzopropanol (LC / MS sınıfı)Fisher ScientificA461LC-MS / MS
Kinetex 5 & mu için çözücü hazırlama; m C18 sabit faz (100 Å)PhenomenexN/A;LC-MS/MS
LTQ Orbitrap Velos Pro Kütle SpektrometresiThermoFisher ScientificN/A için özel sipariş Kromatografi kolonu;LC-MS/MS için özel sipariş Kütle spektrometresi
Magnezyum asetatSigma-AldrichM5661S30 tampon bileşeni
Magnezyum glutamatSigma-Aldrich49605CFME reaksiyon karışımı bileşeni
Metanol (LC/MS sınıfı)Fisher ScientificA456LC-MS/MS
NAD+Sigma-AldrichN0632CFME reaksiyon karışımı bileşeni
Nanospray İyonizasyon KaynağıThermoFisher Scientific/ProxeonES071 (en yeni model)LC-MS/MS için kütle spektrometresi
OpenLab CDS (Çevrimiçi) YazılımAgilentSürüm 2.15.26HPLC verilerinin alınması ve analizi için Kromatografi Veri Sistemi
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus YazılımıThermoSürüm 2.7LC-MS/MS sistemini ayarlamak için yazılım
Potasyum asetatSigma-AldrichP1190S30 tampon bileşeni
Potasyum glutamatSigma-AldrichG1501CFME reaksiyon karışımı bileşeni
Soğutmalı santrifüjEppendorf5415 C
Vidalı kapaklar (septalı, 9 mm)Supelco29315-UHPLC-RID, Vidalı cam şişeler için numune saklama/teslim
(2 mL)Supelco29376-UHPLC-RID,
Sodyum asetatSigma-Aldrich241245Standart eğri çözelti hazırlama (HPLC-RID) için S30
tamponunda çözülürSigma-Aldrich247596Standart eğri çözeltisi hazırlama için S30 tamponunda çözüldü (HPLC-RID)
Sodyum laktatSigma-Aldrich71716Standart eğri çözelti hazırlama için S30 tamponunda çözüldü (HPLC-RID)
Süksinik asitSigma-Aldrich398055Standart eğri çözelti hazırlama için S30 tamponunda çözüldü (HPLC-RID)
Sülfürik asitSigma-Aldrich258105HPLC-RID
Trikloroasetik asitSigma-AldrichT6399
Tris-asetatGoldBioT-090-100S30 tampon bileşeni
için çözücü hazırlama Otomatik örnekleyici ile Ultimate 3000 LCDionexSolvent Rafı: SRD-3600LC-MS/MS analizi için sıvı kromatografi sistemi
Otomatik numune alma cihazlı Ultimate 3000 LCDionexHızlı Ayırma İkili Pompa: HPG-3400RSLC-MS/MS analizi için sıvı kromatografi sistemi
Otomatik örnekleyicili Ultimate 3000 LCDionexHızlı Ayırma Kuyusu Plakası Otomatik Numune Alma Cihazı: WPS-3000TRSLC-MS/MS analizi için sıvı kromatografi sistemi
Su (LC/MS sınıfı)Fisher ScientificW6500LC-MS/MS
Xcalibur YazılımıTermoSürüm 3.0.63için solvent hazırlamaLC-MS/MS için veri toplama ve yorumlama yazılımı
için çözücü hazırlama etme Buzlu asetik asit için çözücü hazırlama için numune depolama/teslim ,

Kaynaklar

  1. Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
  2. Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
  3. Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
  4. Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003(2019).
  5. Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
  6. Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
  7. Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
  8. Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162(2021).
  9. Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
  10. Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72(2020).
  11. Coskun, O. Separation Tecniques: Chromatography. 3, Kare Publishing. Istanbul. (2016).
  12. Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
  13. Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
  14. Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
  15. Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
  16. Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
  17. Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
  18. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  19. O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
  20. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  21. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  22. Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000(2017).
  23. Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
  24. Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
  25. Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54(2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H creden Ba ms z Metabolik M hendislikLizat Tabanl SistemlerK r lma ndisi TespitiHPLC AnaliziGlikoz MetabolizmasMerkezi MetabolitlerFermantasyon r nleri

İlgili makaleler