Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62853

⸱

19 Temmuz 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

Bu makalede

Özet

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Özet

Maya mitokondriyal proteomunun karakterizasyonundaki son gelişmelere rağmen, önemli sayıda proteinin boyunkondriyal lokalizasyonu zor olmaya devam etmektedir. Burada, mitokondriyal protein fonksiyonu elucidation sırasında temel bir adım olarak kabul edilen maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için sağlam ve etkili bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, son derece saf bozulmamış mitokondri elde etmekten oluşan bir ilk adımı içerir. Bu mitokondriyal preparatlar daha sonra hipotonik şok (şişlik) ve proteinaz K (proteaz) ile inkübasyondan oluşan bir subfraksiyon protokolüne tabi tutulur. Şişlik sırasında, dış mitokondriyal membran seçici olarak bozulur ve proteinaz K'nin intermembran uzay bölmesinin proteinlerini sindirmesine izin verir. Buna paralel olarak, membran proteinlerinin topolojisi hakkında bilgi edinmek için, mitokondriyal preparatlar başlangıçta sonikasyona tabi tutulur ve daha sonra sodyum karbonat ile alkali ekstraksiyona tabi tutulur. Son olarak, santrifüjlemeden sonra, bu farklı tedavilerden elde edilen pelet ve süpernatant fraksiyonları SDS-PAGE ve batı lekesi tarafından analiz edilir. Submitochondrial lokalizasyon ve ilgi proteininin membran topolojisi, batı leke profili bilinen standartlarla karşılaştırılarak elde edilir.

Giriş

Mitokondriler, biyoenergetik, hücresel metabolizma ve sinyal yollarında önemli roller oynayan ökaryotik hücrelerin temel organelleridir1. Bu görevleri düzgün bir şekilde yürütmek için mitokondri, yapılarından ve işlevlerinden sorumlu benzersiz bir protein ve lipit kümesine güvenir. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, mitokondriyal süreçler üzerindeki araştırmalar ve diğer organeller için bir model sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır2. Mayadaki sadece sekiz protein için mitokondriyal genom kodları; mitokondriyal proteinlerin büyük çoğunluğu (~%99), sitosolik ribozomlar üzerine çevrilen nükleer genler tarafından kodlanır ve daha sonra sofistike protein ithalat makineleri tarafından doğru boyunkopondriyal bölmelerine ithal edilir3,4,5. Bu nedenle, mitokondriyal biyogenez hem nükleer hem de mitokondriyal genomların koordineli ifadesine bağlıdır6,7. Mitokondriyal biyogenezde kusurlara neden olan genetik mutasyonlar insan hastalıkları ile ilişkilidir8,9,10.

Son yirmi yılda, yüksek saflaştırılmış mitokondrileri hedefleyen yüksek verimli proteomik çalışmalar, en az 900 proteinden oluştuğu tahmin edilen maya mitokondriyal proteomunun kapsamlı bir şekilde nitelendirilmesiyle sonuçlandı11,12,13,14. Bu çalışmalar değerli bilgiler sağlasa da, dört mitokondriyal alt şirketteki her proteinin, yani dış zarın (OM), intermembran alanının (IMS), iç zarın (IM) ve matrisin suborganeller lokalizasyonu hala gereklidir. Bu soru, iki küçük mitokondriyal alt bileşenin (OM ve IMS)15,16'nın proteomik geniş çalışmaları ile kısmen ele alındı. Daha yakın zamanda, Vögtle ve işbirlikçileri mayada yüksek kaliteli bir küresel sekonondriyal protein dağılımı haritası oluşturarak ileriye doğru büyük bir adım attı. SILAC tabanlı nicel kütle spektrometresi, farklı boyunkondriyal fraksiyon protokolleri ve OM ve IMS proteomlarından elde edilen verileri birleştiren entegre bir yaklaşım kullanan yazarlar, dört mitokondriyal alt bölüme 818 protein atadı13.

Bu yüksek verimli proteomik çalışmaların elde ettiği gelişmelere rağmen, submitochondrial proteome bileşimi hakkındaki bilgimiz tamamlanmaktan çok uzaktır. Gerçekten de, Vögtle ve işbirlikçileri tarafından maya mitokondrilerine lokalize olduğu bildirilen 986 protein arasında, dört boyunluk bölmeden hiçbirine 168 atanamadı13. Ayrıca, yazarlar mitokondriyal membranların çevresine periferik olarak bağlı olduğu tahmin edilen proteinlerin membran topolojisi hakkında bilgi vermediler. Örneğin, iç zara periferik olarak atanan bir proteinin matrise mi yoksa intermembran uzaya mı dönük olduğunu bilmek mümkün değildir. Proteome çapındaki çalışmalardan elde edilen bu eksik verilerin yanı sıra, önemli sayıda mitokondriyal proteinin suborganeller lokalizasyonu hakkında çelişkili bilgiler vardır. Saccharomyces Genom Veritabanı (SGD) ve Uniprot gibi ortak veritabanlarında intermembran uzay proteini olarak atanan proteaz Prd1 buna bir örnektir. Şaşırtıcı bir şekilde, burada açıklanana benzer bir alt ihlal protokolü kullanarak, Vögtle ve işbirlikçileri Prd1'in gerçek bir matris proteini olduğunu açıkça gösterdi13. Yukarıda belirtildiği gibi, birçok mitokondriyal proteinin submitochondrial lokalizasyonunun aydınlatılması veya yeniden değerlendirilmesi gerekir. Burada, maya mitokondriyal proteinlerin suborganeller lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir protokol sunuyoruz. Bu protokol çeşitli araştırma grupları tarafından geliştirilmiş ve optimize edilmiştir ve birçok mitokondriyal proteinin membran topolojisinin yanı sıra boyunkondriyal lokalizasyonu belirlemek için rutin olarak kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Maya hücrelerinin büyümesi

  1. Hücrelerin küçük bir kısmını -80 °C gliserol stoğundan bir YPD (%1 maya özü, %2 pepton, %2 glikoz) agar plakasına seri yaparak ilgi suşunun tek kolonilerini izole edin. Plakayı 2-3 gün boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bu protokolde kullanılan S. cerevisiae suşu BY4741'den türetilmiştir (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Auxotrophic marker genleri hariç, bu suş silinmiş bir gen içermez ve herhangi bir plazmid taşımaz. Böylece, güçlü hücre büyümesini teşvik eden zengin bir ortamda başarıyla yetiştirilebilir. Plazmidlerle dönüştürülmüş suşlarla çalışırken, plazmid seçimi için uygun minimum ortamı kullanın.
  2. 100 mL Errlenmeyer şişesinde 10-20 mL YPGal ortamında (%1 maya özü, %2 pepton, %2 galaktoz) YPD agar plakasından 2-3 ayrı koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın. Kuvvetli sallama ile 24 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Büyüme ortamının seçimi protokolde kullanılan maya suşlarına bağlıdır. Hem YPD hem de YPGal, mitokondriyal solunum yapmayan suşların büyümesine izin veren fermente edilebilir karbon kaynakları içerir. Bununla birlikte, glikoz birçok mitokondriyal genin ekspresyonunun ifadesini bastırdığı için, daha düşük miktarlarda mitokondri üreteceğinden bu karbon kaynağının kullanılması önerilmez. Solunuma yetkin suşlarla çalışırken, daha yüksek bir mitokondri verimi elde etmek için gliserol ve etanol gibi karbon kaynaklarını kullanmak da mümkündür.
  3. Başlangıç kültürünü 1 L taze YPGal ortamına 0,1'den daha az bir OD600'e seyreltin. OD600 1-1.5'e ulaşana kadar hücreleri 30 °C'de kuvvetli sallayarak yetiştirin.
    NOT: Denemeyi yapmadan önce her maya suşunun büyüme hızını (iki katına çıkma süresi) belirleyin. Bu, kültürün 1-1,5 OD600'e ulaşması için gereken kuluçka süresinin doğru bir tahminini sağlayacaktır.

2. Son derece saflaştırılmış mitokondrilerin izolasyonu

NOT: Bu protokol, küçük değişikliklerle 17'den uyarlanmıştır.

  1. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  2. Hücreleri damıtılmış suyla yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
  3. Hücrelerin ıslak ağırlığını belirleyin.
    NOT: Hücre peletinin ağırlığını adım 2.2'den ölçmenin en kolay yolu, hücrelerin toplanmasından hemen önce boş santrifüj tüpünün ağırlığını belirlemektir. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücrelerle aynı tüpün ağırlığını ölçün. Hücrelerin ağırlığı iki ölçüm arasındaki farktır.
  4. Pasteur pipet veya P5000 ucu kullanarak DTT arabelleğindeki hücreleri (1 g hücre başına 2 mL) yeniden biriktirin. DDT arabellek bileşimi için Tablo 1'e bakın.
  5. Hücreleri 30 °C'de hafif sallanarak 20 dakika kuluçkaya yaslanın (~70 rpm).
  6. Hücreleri peletmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj.
  7. Hücreleri enzim olmadan Zymolyase tamponu ile yıkayın (1 g hücre başına yaklaşık 7 mL).
    Zymolyase tampon bileşimi için Tablo 1'e bakın.
  8. Hücreleri peletmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj.
  9. Tampondaki hücreleri Zymolyase olmadan yeniden biriktirin (1 g hücre başına 7 mL).
  10. Hücre süspansiyonu 250 mL Erlenmeyer şişesine aktarın ve Zymolyase-20T (g ıslak ağırlık başına 3 mg) ekleyin.
  11. Hücreleri 30 °C'de 30-40 dakika boyunca hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın (~70 rpm). Zymolyase tedavisinden önce ve sonra hücre süspansiyonunun bulanıklığını karşılaştırarak bu işlemin verimliliğini kontrol edin.
    NOT: Bu adımda, hücreler Zymolyase tarafından hücre duvarı sindirimi nedeniyle sferoplastlara dönüştürülecektir.
    1. Bunun için, 2 mL su içeren ayrı cam tüplere her hücre süspansiyonunun 50 μL'sini ekleyin. Kuvvetli bir şekilde karıştırılduktan sonra, sferoplastların ozmotik bozulması nedeniyle Zymolyase ile tedavi edilen hücre süspansiyonunun bulanıklığı hızla azalmalıdır. Öte yandan, tedavi edilmeyen hücre süspansiyonunun bulanıklığı değişmeden kalmalıdır.
      NOT: Bulanıklığın etkileri basit görsel muayene veya her iki numunenin OD600'ünin ölçülmesi ile de izlenebilir. İkinci durumda, Zymolyase tedavi edilen numunenin OD600'ü tedavi edilmeyen numunenin% 10-20'si olmalıdır. Alternatif bir yöntem, ışık mikroskopisi kullanarak her iki örnekteki hücreleri saymayı içerir.
    2. Sferoplast oluşumunun verimi düşükse, daha fazla Zymolyase ekleyin ve 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
  12. Sferoplastları 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
    NOT: Hidrolitik enzimler tarafından protein bozulmasını önlemek için diğer tüm adımlar hızlı ve buz üzerinde veya 4 °C'de yapılmalıdır.
  13. Sferoplastları buz gibi homojenizasyon tamponu (1 g hücre başına yaklaşık 6,5 mL) ve pelet ile 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleme ile iki kez yıkayın. Homojenizasyon arabelleği bileşimi için Tablo 1'e bakın.
  14. Sferoplastları buz gibi homojenizasyon tamponunda (1 g hücre başına 6,5 mL) yeniden uygulayın ve önceden soğutulmuş bir cam Dounce homojenizatöre aktarın. Yaklaşık 30 mL'lik büyük bir cam homojenizatör kullanın.
  15. Bir pestle kullanarak 15 vuruşla sferoplastları homojenize edin.
    NOT: Strok sayısı pestil takılmasına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Sıkı pestle için 15 vuruş yeterlidir. Öte yandan, gevşek bir haşere kullanıyorsanız, 25 darbeye kadar yapılması önerilir.
  16. Homojenatı 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 1 hacim buz gibi homojenizasyon tamponu ekleyin.
  17. Homojenatı düşük hızda santrifüj, pelet çekirdeğine, hücre kalıntılarına ve kırılmamış hücrelere 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.500 x g .
  18. Peletin bozulmasını önlemek için bir Pasteur pipet veya P5000 ucu kullanarak süpernatantı yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  19. 4 °C'de 5 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj.
  20. Süpernatantı yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve ham mitokondri fraksiyonunu peletmek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
  21. Süpernatantı atın ve P5000 ucu kullanarak hafifçe pipetleme yaparak ham mitokondriyal peleti 20-30 mL buz gibi homojenizasyon tamponunda hafifçe yıkayın.
  22. Süspansiyonu 50 mL santrifüj tüpüne ve santrifüjü 4.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca aktararak kalan hücre kalıntılarını saçmaya devam edin.
  23. Süpernatantı yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve ham mitokondri fraksiyonunu peletmek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
  24. Üstnatantı atın ve P1000 ucu kullanarak hafifçe pipetleme yaparak ham mitokondriyal peleti küçük bir hacimde (tipik olarak 1000 μL) buz gibi SEM tamponunda hafifçe yeniden depolayın. SEM arabellek bileşimi için Tablo 1'e bakın.
    NOT: Bu ham mitokondriyal fraksiyon doğrudan organello protein ithalatı tahlilleri gibi bazı uygulamalarda kullanılabilse de, önemli miktarda başka hücresel bileşen içerir. Bu kontaminasyonlar, bir proteinin sekonondriyal lokalizasyonunu belirlerken sonuçların yanlış yorumlanmasına neden olabilir. Bu nedenle, aşağıda açıklandığı gibi, yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriyal preparat elde etmek için daha fazla arınma adımı gereklidir.
  25. EM tamponunda %60, %32, %23 ve %15 (w/v) konsantrasyonlarda sakkaroz çözeltileri hazırlayın. Bu çözeltiler 4 °C'de 1 aya kadar stabildir. EM arabellek bileşimi için Tablo 1'e bakın.
  26. Ultrasantrifüj tüpüne 4 adımlı bir sakkaroz gradyanı aşağıdaki gibi hazırlayın: Santrifüj tüpünün altına% 60 (w/ v) sakkarozun 1,5 mL'sini yerleştirin. Daha sonra, pipet dikkatlice adım adım: % 32'nin 4 mL'si, % 23'ün 1.5 mL'si ve% 15 sakkarozun 1.5 mL'si (w / v). Aşamaları bozmamaya dikkat edin.
  27. Ham mitokondriyal fraksiyonu sakkaroz gradyanının üzerine dikkatlice yükleyin.
  28. Sallanan kova rotorunda 4 °C'de 134.000 x g'da 1 saat santrifüj.
  29. %60/32 sakkaroz arayüzünde kahverengi bir bantla temsil edilen son derece saflaştırılmış mitokondri fraksiyonu ulaşılana kadar sakkaroz çözeltisini dikkatlice çıkarmaya devam edin.
  30. P1000 kesim ucu kullanarak saflaştırılmış mitokondrileri kurtarın ve önceden soğutulmuş yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
  31. Geri kazanılan mitokondrileri 5-10 hacim buz gibi SEM tamponu ile seyreltin.
  32. 4 °C'de 12.000 x g'da 30 dakika santrifüj.
  33. P1000 kesme ucu kullanarak hafif pipetleme ile saf mitokondriyi 500 μL buz gibi SEM tamponunda yeniden depolayın.
  34. Üreticinin talimatlarını izleyerek Bradford prosedürünü kullanarak yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriyal preparatın protein konsantrasyonunun belirlenmesi. Buz gibi SEM tamponu ile protein konsantrasyonu 10 mg protein/mL olarak ayarlayın.
    NOT: Aşağıda açıklanan submitochondrial fraksiyonasyon protokolü için, taze hazırlanmış mitokondri kullanılması önerilir. Bununla birlikte, Vögtle ve işbirlikçileri mitokondriyal sağlamlığın ayrıntılı bir kalite kontrol analizini yaptı ve donmuş organellerin de bu protokolde kullanılabileceğini gösterdi13. Bunun için 40 μL'lik aliquots yapın ve sıvı nitrojende dondurun. -80 °C'de saklayın.

3. Submitochondrial fraksiyonasyon protokolü

NOT: Bu protokol referans18'den uyarlanmıştır ve iki adımdan oluşur: (1) proteinaz K'nin varlığında veya yokluğunda hipotonik şişlik ve (2) sonikasyon ve ardından karbonat ekstraksiyonu. Protein bozulmasını önlemek için her iki protokolün tüm adımlarını buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirin.

  1. Proteinaz K varlığında hipotonik şişlik
    1. 10 mg/mL'de (400 μg) 40 μL yüksek saflaştırılmış mitokondriyi dört 1,5 mL önceden soğutulmuş etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. 1 ve 2 numaralı tüplere 360 μL SEM tampon ekleyin.
    3. 3 ve 4 numaralı tüplere 360 μL EM tampon ekleyin.
    4. 2 ve 4 numaralı tüplere 4 μL proteinaz K (10 mg/mL) ekleyin. Hataları önlemek için Tablo 2'de listelenen pipetleme düzenini kullanın.
      NOT: Kullanmadan hemen önce suda 10 mg/mL proteinaz K çözeltisi hazırlayın. Deneydeki son proteinaz K konsantrasyonu 50-100 μg / mL civarında olmalıdır. Daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
    5. Tüm tüpleri hafifçe karıştırın ve ara sıra karıştırarak 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    6. Proteinaz K aktivitesini durdurmak için dört tüpe de 4 μL 200 mM PMSF ekleyin.
      DİkKAT: PMSF oldukça zehirlidir. PMSF içeren çözümlerle çalışırken eldiven giyin.
    7. 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj.
    8. Süpernatantı toplayın ve yeni bir 1,5 mL önceden soğutulmuş etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Peletin bozulmasını önlemeye dikkat edin.
      NOT: Pelet, daha fazla SDS-PAGE ve batı blot analizi için doğrudan numune arabelleğine yeniden kullanılabilir. Bununla birlikte, PROTEINAZ K izleri PMSF tedavisinden sonra bile aktif kalabilir ve sonunda pelet SDS içeren numune tamponunda çözüldükten sonra bazı proteinleri sindirebilir. Bu sorunu önlemek için, proteinaz K, aşağıda açıklandığı gibi trikloroasetik asit (TCA) ile örneklerin tedavisi ile tamamen inaktive edilebilir.
      DİkKAT: TCA oldukça zehirlidir. TCA içeren çözümlerle çalışırken eldiven giyin.
    9. Peletin 400 μL buz gibi SEM tamponunda 3.1.8 adımından yeniden depolanın.
    10. TCA ile süpernatantı (adım 3.1.8'den) ve yeniden dürtülmüş peletin (adım 3.1.9'dan) %10'luk (w/v) son konsantrasyona kadar çökeltin.
    11. Buzdaki tüm tüpleri 10 dakika kuluçkaya yatır.
    12. TCA ile işlenmiş numuneleri 4 °C'de 12.000 x g'da 10 dakika santrifüj edin.
    13. Üstnatant çıkarın ve peletin 200 μL numune tamponunda yeniden süzülür.
      NOT: Bromofenol mavi pH göstergesinin asit tedavisi nedeniyle sararması mümkündür. Bu durumda, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının küçük aliquotlarını (1-5 μL) ekleyin.
    14. Tüm tüplere 4 μL 200 mM PMSF ekleyin.
    15. SDS-PAGE ve western blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar tüm numuneleri -80 °C'de saklayın.
  2. Sonication ve karbonat ekstraksiyonu
    NOT: Bu protokolde, sonication mitokondriyal membranların yırtılmasına neden olduktan sonra taze hazırlanmış mitokondrilerin kullanılması gerekli değildir.
    1. 10 mg/mL'de (2 mg protein) 200 μL yüksek saflaştırılmış mitokondriyi 1,5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. Mitokondrileri buz gibi SEM tamponu ile bir kat seyreltin.
    3. Buz üzerinde 3 x 30 s için sonicate mitokondri. Küçük birimler için uyumlu bir sonicator kullanın.
    4. Numuneyi 4 °C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüj edin.
    5. Süpernatantı toplayın ve yeni bir 1,5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Buzda tut. Bu örnek çözünür protein fraksiyonu (S) olarak adlandırılacaktır.
    6. Peletin 400 μL buz gibi SEM tamponunda 3.2.4 adımından yeniden depolanın.
    7. 3.2.6 adımından 100 μL resüspended pelet alın ve yeni bir 1.5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Buzda tut. Bu örnek submitochondrial parçacık fraksiyonu (SMP) olarak adlandırılacaktır.
    8. Kalan 300 μL'yi 3.2.6 adımdan tek kat taze hazırlanmış 200 mM sodyum karbonatla seyreltin.
    9. Numuneyi 3.2.8 adımından buz üzerinde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
    10. Numuneyi 4 °C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüj edin.
    11. Süpernatantı toplayın ve yeni bir 1,5 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Buzda tut. Bu örnek karbonat süpernatant fraksiyonu (CS) olarak adlandırılacaktır.
    12. Peletin 400 μL buz gibi SEM tamponunda 3.2.10 adımından yeniden depolanın. Bu örnek karbonat çökelmiş fraksiyon (CP) olarak adlandırılacaktır.
    13. TCA ile tüm örnekleri (S, SMP, CS ve CP) %10'luk (w/v) son konsantrasyona çökeltin.
    14. Buzdaki tüm tüpleri 10 dakika kuluçkaya yatır.
    15. TCA ile işlenmiş numuneleri 4 °C'de 12.000 x g'da 10 dakika santrifüj edin.
    16. Üstnatant çıkarın ve örnek arabellek her pelet resuspend. Örnek tampon sarı olursa, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının küçük aliquotlarını (1-5 μL) ekleyin.
    17. Tüm tüplere 1 μL 200 mM PMSF ekleyin.
    18. SDS-PAGE ve western blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar tüm numuneleri -80 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Submitochondrial fraksiyonasyon protokolünün başarısı, son derece saflaştırılmış bozulmamış mitokondri elde edilmesine bağlıdır. Bunun için, maya hücresi lizisi sırasında, organellerin sağlamlığının neredeyse tamamen korunması esastır. Bu, hücre duvarının enzimatik sindirimini birleştiren bir hücre liziz protokolü ve ardından bir Dounce homojenizatör kullanarak plazma zarının fiziksel bozulması ile elde edilir. Mitokondriyal içerikler daha sonra diferansiyel santrifüjleme ile toplanır. Bu subselüler fraksiyon, bir mitoko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan protokol, submitochondrial bölmelerdeki protein lokalizasyonunu belirlemek için uzun süredir başarıyla kullanılmış ve sürekli olarak optimize edilmiştir13,14,18,21,22,23. Bu protokolün güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, mitokondriyal preparatların saflığına ve bütünlüğüne güçlü bir şekilde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Dr. A. Tzagoloff'a (Columbia Üniversitesi) boyunokondriyal belirteç proteinleri Cyt'e karşı yetiştirilen antikorları sağladığı için teşekkür ederiz. b2, αKGD ve Sco1. Ayrıca, bu protokolün oluşturulması sırasında yararlı tartışmalar ve yorumlar için Dr. Mario Henrique de Barros'a (Universidade de São Paulo) teşekkür ederiz.

Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) araştırma hibeleri ile desteklendi (grant 2013/07937-8).

Fernando Gomes ve Helena Turano da SıRASıYLA 2017/09443-3 ve 2017/23839-7 hibeleri olan FAPESP tarafından desteklenmektedir. Angélica Ramos ayrıca Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bacto PeptoneBD211677
Bacto Maya özüBD212750
Beckman Ultra Şeffaf Santrifüj Tüpleri, 14 x 89 mmBeckman Coulter344059
Sığır serum albümini (BSA yağ asidi içermez)Sigma-AldrichA7030Homojenizasyon tamponu
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43815 bileşeniDDT tamponunun bileşeni
D-SorbitolSigma-AldrichS1876
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-AldrichE9884
GalaktozSigma-AldrichG0625
GlikozSigma-AldrichG7021
MOPSSigma-AldrichM1254
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)Sigma-AldrichP7626Proteinaz K'yi inaktive etmek için kullanılır
Potasyum fosfat dibazikSigma-AldrichP3786
Potasyum fosfat monobazikSigma-AldrichP0662
Proteinaz KSigma-Aldrich
SükrozSigma-AldrichS8501
Trikloroasetik asit (TCA)Sigma-AldrichT6399
Trizma TabanıSigma-AldrichT1503
Zymolyase-20T, Arthrobacter luteusMP Biomedicals, Irvine, CA'dan320921Sferoplast üretmek için canlı maya hücre duvarlarını parçalamak için kullanılır

Kaynaklar

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359(2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417(2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463(2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484(2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Submitokondriyal LokalizasyonMitokondriyal ProteinlerProteinaz K İşlemiHipotonik ŞişmeAlkalin EkstraksiyonSDS-PAGEWestern BlotMitokondriyal Alt Fraksiyonlama
Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.