Bu çalışma, Escherichia coli'den (E. coli ) hücre ekstraktının hazırlanmasını ve ardından 24 saatten kısa sürede hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını açıklamaktadır. Hücresiz otoindüksiyon (CFAI) protokolünün açıklaması, araştırmacı gözetimini azaltmak ve elde edilen hücre ekstraktı miktarlarını artırmak için yapılan iyileştirmeleri detaylandırmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Hücresiz protein sentezi (CFPS), transkripsiyon ve çeviri makinelerini in vitro olarak yakalayan bir biyoteknoloji platformu olarak büyümüştür. Çok sayıda gelişme, CFPS platformunu yeni kullanıcılar için daha erişilebilir hale getirdi ve uygulama yelpazesini genişletti. Lisat bazlı CFPS sistemleri için, hücre ekstraktları çeşitli organizmalardan üretilebilir ve protein sentezini arttırmak için bu konağın benzersiz biyokimyasından yararlanılabilir. Son 20 yılda, Escherichia coli (E. coli), satın alınabilirliği ve çok yönlülüğü nedeniyle CFPS'yi desteklemek için en yaygın kullanılan organizmalardan biri haline gelmiştir. Çok sayıda önemli ilerlemeye rağmen, E. coli hücre ekstraktı hazırlama iş akışı, yeni kullanıcıların uygulamaları için CFPS'yi uygulamaları için uygulamaları için önemli bir darboğaz olmaya devam etmiştir. Ekstrakt hazırlama iş akışı zaman alıcıdır ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için teknik uzmanlık gerektirir. Bu engellerin üstesinden gelmek için, daha önce kullanıcı girdisini ve gerekli teknik uzmanlığı azaltan 24 saat hücresiz otomatik indüksiyon (CFAI) iş akışının geliştirildiğini bildirmiştik. CFAI iş akışı, hücre ekstraktları üretmek için gereken işçiliği ve teknik beceriyi en aza indirirken, elde edilen toplam hücre ekstresi miktarlarını da arttırır. Burada, erişimi iyileştirmek ve E. coli tabanlı CFPS'nin geniş kapsamlı uygulamasını desteklemek için bu iş akışını adım adım açıklıyoruz.
Giriş
Biyoteknoloji uygulamaları için hücresiz protein sentezinin (CFPS) kullanımı son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır 1,2,3. Bu gelişme kısmen, CFPS'de meydana gelen süreçleri ve her bir bileşenin rolünü anlamada artan çabalara bağlanabilir 4,5. Ek olarak, optimize edilmiş kurulumlara ve alternatif enerji kaynaklarına atfedilen azaltılmış maliyetler, hücresiz teknolojinin yeni kullanıcılar için uygulanmasını kolaylaştırmıştır 6,7,8,9.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Medya büyümesi
- Tablo 1'de açıklandığı gibi 960 mL CFAI ortamı hazırlayın ve KOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
- Kültür ortamını 121 °C'de 30 dakika boyunca 2,5 L şaşkın şişeye ve otoklavlara aktarın.
- Tablo 1'de açıklandığı gibi 40 mL'lik bir şeker çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi ayrı bir otoklavlanmış cam kaba filtreleyerek sterilize edin.
NOT: Şeker çözeltisi, daha fazla kullanıma kadar 30 °C'lik bir inkübatörde saklanabilir. - Otoklavlamadan sonra ortamın 40 °C'nin altına tamamen soğumasını bekleyin.
- CFAI ortamının aşılanmasından önce, şeker çözeltisini doğrudan CFAI ortamına e....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
CFAI ortamı hazırlanırken, glikoz, ortamdaki ana enerji substratı olarak laktoz ve gliseroldeki bir artış ile değiştirildi. Ek olarak, CFAI ortamının tamponlama kapasitesi de artırıldı. Bu özel bileşenler Tablo 1'de verilmiştir.
Hücreler daha sonra değişen ekstrakt miktarlarına rağmen ekstrakt kalitesiyle tutarlılık göstermek için hem OD600 / 10'a hem de CFAI ortamındaki standart 2.5'e büyütüldü. 2.5 OD600 CFAI ortamı, LB suyundaki bir tohum kültüründen 3.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücre büyümesi sırasında iki temel eylem için geleneksel olarak araştırmacı gözetimine ihtiyaç vardır: T7 RNAP'nin indüksiyonu ve belirli bir OD600'de hücrelerin toplanması. CFAI, araştırmacının zamanını ve yüksek kaliteli hücre ekstraktları hazırlamak için gereken teknik eğitimi azaltmak için bu gereksinimlerin her ikisini de ortadan kaldırır. T7 RNAP'nin otomatik indüksiyonu, glikozun ortamdaki birincil şeker olarak laktoz ile değiştirilmesi, büyümenin aktif olarak izlenmesi ve daha sonra hücre büyümesi sıra.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rakip finansal çıkar çatışmalarına sahip olmadıklarını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, teknik destek için Dr. Jennifer VanderKelen ve Andrea Laubscher'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yararlı tartışmalar için Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Voyvoda, Logan Burrington ve Jillian Kasman'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Bill ve Linda Frost Fonu, Biyoteknoloji Uygulamaları Merkezi'nin Chevron Biyoteknoloji Uygulamalı Araştırma Bağış Bursu, Cal Poly Research, Bilimsel ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF-1708919) finansman desteğini de kabul ediyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Mikrofüj Tüpleri | Phoenix | MPC-425Q | |
| 1L Santrifüj Tüpü | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti JE Santrifüj | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Sitasyon 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glikoz | Fisher | D16-3 | |
| D-Laktoz | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinik Asit | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Gliserol | Fisher | BP229-1 | |
| Glisin | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K (Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K (OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanin | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginin | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagin | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartik | Asit Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Sistein | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamik | Asit Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamin | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadin | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-İzolösin | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Lösin | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lizin | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Metionin | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Fenilalanin | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Prolin | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serin | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Treonin | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Triptofan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tirozin | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Suyu | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Mikrofüj 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Moleküler Sınıf Su | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R İnkübatör | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4 (Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTP'ler | ThermoFisher | R0481 | |
| Oksalik Asit | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potasyum Fosfat Dibazik | Akros, Organikler | A0382124 | |
| Potasyum Fosfat Monobazik | Akrolar, Organikler | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plazmid Hazırlık Kiti | ThermoFisher | K210007 | |
| Putresin | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidin | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tripton | Fisher Biyoreaktifleri | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Şaşkın Sallama Şişesi | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonik İşlemci | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Maya Özü Fisher | Biyoreaktifleri | 1/2/8013 |
Kaynaklar
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
