Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine

4.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62866

⸱

22 Temmuz 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Bu çalışma, Escherichia coli'den (E. coli ) hücre ekstraktının hazırlanmasını ve ardından 24 saatten kısa sürede hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını açıklamaktadır. Hücresiz otoindüksiyon (CFAI) protokolünün açıklaması, araştırmacı gözetimini azaltmak ve elde edilen hücre ekstraktı miktarlarını artırmak için yapılan iyileştirmeleri detaylandırmaktadır.

Özet

Hücresiz protein sentezi (CFPS), transkripsiyon ve çeviri makinelerini in vitro olarak yakalayan bir biyoteknoloji platformu olarak büyümüştür. Çok sayıda gelişme, CFPS platformunu yeni kullanıcılar için daha erişilebilir hale getirdi ve uygulama yelpazesini genişletti. Lisat bazlı CFPS sistemleri için, hücre ekstraktları çeşitli organizmalardan üretilebilir ve protein sentezini arttırmak için bu konağın benzersiz biyokimyasından yararlanılabilir. Son 20 yılda, Escherichia coli (E. coli), satın alınabilirliği ve çok yönlülüğü nedeniyle CFPS'yi desteklemek için en yaygın kullanılan organizmalardan biri haline gelmiştir. Çok sayıda önemli ilerlemeye rağmen, E. coli hücre ekstraktı hazırlama iş akışı, yeni kullanıcıların uygulamaları için CFPS'yi uygulamaları için uygulamaları için önemli bir darboğaz olmaya devam etmiştir. Ekstrakt hazırlama iş akışı zaman alıcıdır ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için teknik uzmanlık gerektirir. Bu engellerin üstesinden gelmek için, daha önce kullanıcı girdisini ve gerekli teknik uzmanlığı azaltan 24 saat hücresiz otomatik indüksiyon (CFAI) iş akışının geliştirildiğini bildirmiştik. CFAI iş akışı, hücre ekstraktları üretmek için gereken işçiliği ve teknik beceriyi en aza indirirken, elde edilen toplam hücre ekstresi miktarlarını da arttırır. Burada, erişimi iyileştirmek ve E. coli tabanlı CFPS'nin geniş kapsamlı uygulamasını desteklemek için bu iş akışını adım adım açıklıyoruz.

Giriş

Biyoteknoloji uygulamaları için hücresiz protein sentezinin (CFPS) kullanımı son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır 1,2,3. Bu gelişme kısmen, CFPS'de meydana gelen süreçleri ve her bir bileşenin rolünü anlamada artan çabalara bağlanabilir 4,5. Ek olarak, optimize edilmiş kurulumlara ve alternatif enerji kaynaklarına atfedilen azaltılmış maliyetler, hücresiz teknolojinin yeni kullanıcılar için uygulanmasını kolaylaştırmıştır 6,7,8,9. Protein sentezi için gerekli transkripsiyon ve translasyon faktörlerini uygulamak için, hücre ekstresi genellikle hücresiz reaksiyonları yönlendirmek için kullanılır10. Son zamanlarda yayınlanan kullanım kılavuzları, işlevsel özüt üretmek için basit protokoller sağlamış ve1,11,12,13,14 gibi yeni ve deneyimli kullanıcılar için uygulamayı kolaylaştırmıştır. Hücre ekstraktı genellikle, istenen spesifik kullanıma bağlı olarak farklı organizmalar kullanılarak yetiştirilebilen bir hücre kültürünün lizisi yoluyla elde edilir 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) hızla fonksiyonel ekstraktlar üretmek için en yaygın kullanılan konakçı organizmalardan biri haline gelmiştir17. BL21 Star (DE3) suşu tercih edilir, çünkü proteazları dış zardan (OmpT proteaz) ve sitoplazmadan (Lon proteaz) uzaklaştırır ve rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ortamı sağlar. Ek olarak, DE3, lacUV5 promotörünün kontrolü altında T7 RNA polimeraz (T7 RNAP) genini taşıyan λDE3'ü içerir; yıldız bileşeni, mRNA4,14,18,19'un bölünmesini önleyen mutasyona uğramış bir RNaseE geni içerir. LakUV5 promotörü altında, izopropil-tiyogalaktopiranosid (IPTG) indüksiyonu, T7 RNAP20,21'in ekspresyonuna izin verir. Bu suşlar, ekstrakt hazırlanması için hammadde veren hücrelerin büyümesi ve toplanması için kullanılır. Hücre lizisi, boncuk çırpma, Fransız presi, homojenizasyon, sonikasyon ve azot kavitasyonu1,11,12,22 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bakteri kültürü ve hasat süreci, E. coli kullanırken çoğu platformda tutarlıdır, ancak birkaç gün ve yoğun araştırmacı gözetimi gerektirir 1,11,13. Bu işlem genellikle LB suyunda bir gecede tohum kültürü ile başlar, bu da gece büyümesi üzerine ertesi gün daha büyük bir 2xYTPG kültürüne (maya, tripton, fosfat tamponu, glikoz) aşılanır. Bu daha büyük kültürün büyümesi, 2.5 14,20'lik bir optik yoğunlukta (OD) erken-orta log fazına ulaşana kadar izlenir. Transkripsiyon ve çeviri bileşenlerinin daha önce23,24 erken ve orta log fazında oldukça aktif olduğu gösterildiğinden sürekli ölçüm gereklidir. Bu işlem tekrarlanabilir ekstrakt oluşturabilse de, laboratuvarımız yakın zamanda araştırmacı gözetimini azaltan, belirli bir litre hücre kültürü için ekstraktın genel verimini artıran ve hem deneyimli hem de yeni kullanıcılar için E. coli bazlı ekstrakt preparatına erişimi artıran Hücresiz Otomatik İndüksiyon (CFAI) Ortamını kullanarak yeni bir yöntem geliştirmiştir (Şekil 1 ). Burada, CFAI iş akışını uygulamak için, çizgili bir hücre plakasından 24 saat içinde tamamlanmış bir CFPS reaksiyonuna geçmek için adım adım kılavuz sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Medya büyümesi

  1. Tablo 1'de açıklandığı gibi 960 mL CFAI ortamı hazırlayın ve KOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
  2. Kültür ortamını 121 °C'de 30 dakika boyunca 2,5 L şaşkın şişeye ve otoklavlara aktarın.
  3. Tablo 1'de açıklandığı gibi 40 mL'lik bir şeker çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi ayrı bir otoklavlanmış cam kaba filtreleyerek sterilize edin.
    NOT: Şeker çözeltisi, daha fazla kullanıma kadar 30 °C'lik bir inkübatörde saklanabilir.
  4. Otoklavlamadan sonra ortamın 40 °C'nin altına tamamen soğumasını bekleyin.
  5. CFAI ortamının aşılanmasından önce, şeker çözeltisini doğrudan CFAI ortamına ekleyin.
  6. Medyayı aşılamak için, daha önce çizgilenmiş bir E. coli BL21 Star (DE3) plakasından bir döngü dolusu koloni kaydırın ve doğrudan ortama yerleştirin. Döngüyü ortama döndürün, ancak kabın kenarlarına dokunmaktan kaçının. Çizgi plakasının canlı hücrelerle taze olduğundan emin olun.
  7. Şişeyi aşılanmış ortamla birlikte 200 rpm'de sallarken 30 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kültürün bir gecede büyümesine izin verin. Hücreler akşamları aşılanırsa, kültür ertesi sabah 10'un 600 nm'sinde (OD600) ölçülen yaklaşık bir optik yoğunluğa ulaşacaktır. Aşılama ve hasat zamanları gerektiği gibi ayarlanabilir.

2. Hücre hasadı

  1. S30 arabelleğini önceden hazırlayın ve soğuk tutun. S30 tamponunu Tablo 2'ye göre son pH değeri 8,2'ye hazırlayın.
    NOT: S30 tamponu, hücre hasadından günler önce hazırlanabilir. Bu yapılırsa, ditiyotrreitol olmadan hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce dithiothreitol ekleyin.
  2. Bu noktadan itibaren, tüm çözeltileri ve malzemeleri buz üzerinde tutun. 1 L ortamın 1 L santrifüj şişesine aktarılması ve 10 dakika boyunca 4-10 °C arasında 5.000 x g'de santrifüj yapılması. Süpernatanın dekantını ve elden çıkarın. Steril bir spatula kullanarak, peleti önceden soğutulmuş ve daha önce tartılmış 50 mL konik bir tüpe aktarın.
  3. 30-40 mL soğuk S30 tamponu ile bir kez yıkayın, buz üzerinde dinlenme süreleri olan 30 saniyelik patlamalarda vorteks yoluyla peleti yeniden askıya alın.
    NOT: Daha yüksek bir pelet hacmi nedeniyle, hücre peletinin iki adet 50 mL konik tüpe bölünmesi, yıkama adımı için yararlı olabilir. Hücrelerin daha küçük alikotlarda depolanması, aşağı akış işleme için esneklik de sağlar.
  4. Hücre süspansiyonunu 5000 x g'da 4-10 °C arasında 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı atın ve temiz bir doku kullanarak 50 mL konik tüpün iç duvarlarındaki fazlalıkları silin, peletin kendisine dokunmaktan kaçının. Tartın ve peleti sıvı azot içinde dondurun. Daha fazla kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Kullanıcı ekstrakt hazırlama protokolüne devam etmeyi planlıyorsa, peletler flaş dondurma gerektirmeyebilir.

3. Ekstrakt hazırlama

  1. Dondurulmuş peleti, hücre peletinin her 1 g'ı için 1 mL S30 tamponu ile birleştirin ve yaklaşık 30-60 dakika boyunca buz üzerinde çözülmeye bırakın. Çözülmüş peleti vorteks yoluyla buz üzerinde dinlenme süreleri olan 30 saniyelik patlamalarda yeniden askıya alın. Görünür hücre kümeleri kalmayana kadar vorteks.
    NOT: Daha küçük kümeler, pipet kullanılarak karıştırılarak yeniden askıya alınabilir.
  2. 1.4 mL hücre resüspansiyonunun alikotlarını hücre lizisi için 1.5 mL mikrofüj tüplerine aktarın. Her tüpü 20 kHz frekansında ve% 50 genlikte, bir buz banyosu ile çevrili döngü başına 59 s dinlenme ile 45 s'lik üç patlama için sonikleştirin. Tüpü döngüler arasında ters çevirin ve son sonikasyon döngüsünden sonra hemen 4.5 μL 1 M ditiyotreitol ekleyin.
    NOT: Sonikasyondan salınan ısı nedeniyle, sonikasyon yapılmadığında tüm alikotların buz üzerinde tutulduğundan emin olmak son derece önemlidir. Buz banyosu sürekli olarak yenilenmeli veya tüm sonikasyon süreci boyunca serin kalacak kadar büyük olmalıdır.
  3. Her tüpü 10 dakika boyunca 18.000 x g ve 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatant ve alikotu 600 μL alikotta 1,5 mL mikrofüj tüplerine alın. Alikotları flaşla dondurun ve daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın. Pipete sadece süpernatant dikkat edilmelidir.

4. Hücresiz protein sentezi

  1. Quadruplicate'te 1.5 mL mikrofüj tüplerinde 15 μL hücresiz protein sentez reaksiyonları gerçekleştirmek için önceki adımdan bir aliquot ekstraktı çözün.
  2. Her reaksiyonu, 240 ng DNA (16 μg / mL nihai konsantrasyon), 2.20 μL Çözelti A, 2.10 μL Çözelti B, 5.0 μL ekstrakt ve 15 μL'ye reaksiyonu doldurmak için değişen hacimde moleküler dereceli suyu birleştirerek hazırlayın. Bu reaksiyon daha yüksek hacimlere ölçeklendirilebilir. Oranlar için Tablo 3'e bakınız.
    1. A ve B çözeltilerini Tablo 4'e göre hazırlayın. Her çözelti 100 μL ila 1 mL'lik partiler halinde hazırlanabilir, aliquoted edilebilir ve daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklanabilir.
      NOT: DNA miktarı, ilgilenilen proteine bağlı olarak değişebilir. Bu durumda, kullanılan plazmid, pJL1-sfGFP, 16 μg / mL veya 597 μM'de performans gösterecek şekilde optimize edilmiştir.
  3. Reaksiyonların 37 °C'de en az 4 saat çalışmasına izin verin.

5. Muhabir proteininin miktarı, süper klasör yeşil floresan proteini (sfGFP)

  1. Yarım alanlı 96 kuyucuklu siyah polistiren plaka kullanarak, her hücresiz protein sentezi reaksiyon ürününün 2 μL'sini, pH 7.2'de 48 μL 0.05 M HEPES tamponu ile birleştirin. Her reaksiyon tüpünün üç ila dört kopyası önerilir.
  2. SfGFP'nin floresan yoğunluğunu 485 nm uyarma dalga boyu ve 528 nm emisyon dalga boyu ile ölçün.
  3. Bağıl floresan birimlerinin sfGFP'nin hacimsel verimine (μg / mL) dönüştürülmesi için, saflaştırılmış pJL1-sfGFP kullanarak standart bir eğri oluşturun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CFAI ortamı hazırlanırken, glikoz, ortamdaki ana enerji substratı olarak laktoz ve gliseroldeki bir artış ile değiştirildi. Ek olarak, CFAI ortamının tamponlama kapasitesi de artırıldı. Bu özel bileşenler Tablo 1'de verilmiştir.

Hücreler daha sonra değişen ekstrakt miktarlarına rağmen ekstrakt kalitesiyle tutarlılık göstermek için hem OD600 / 10'a hem de CFAI ortamındaki standart 2.5'e büyütüldü. 2.5 OD600 CFAI ortamı, LB suyundaki bir tohum kültüründen 3...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hücre büyümesi sırasında iki temel eylem için geleneksel olarak araştırmacı gözetimine ihtiyaç vardır: T7 RNAP'nin indüksiyonu ve belirli bir OD600'de hücrelerin toplanması. CFAI, araştırmacının zamanını ve yüksek kaliteli hücre ekstraktları hazırlamak için gereken teknik eğitimi azaltmak için bu gereksinimlerin her ikisini de ortadan kaldırır. T7 RNAP'nin otomatik indüksiyonu, glikozun ortamdaki birincil şeker olarak laktoz ile değiştirilmesi, büyümenin aktif olarak izlenmesi ve daha sonra hücre büyümesi sıra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rakip finansal çıkar çatışmalarına sahip olmadıklarını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, teknik destek için Dr. Jennifer VanderKelen ve Andrea Laubscher'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yararlı tartışmalar için Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Voyvoda, Logan Burrington ve Jillian Kasman'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Bill ve Linda Frost Fonu, Biyoteknoloji Uygulamaları Merkezi'nin Chevron Biyoteknoloji Uygulamalı Araştırma Bağış Bursu, Cal Poly Research, Bilimsel ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF-1708919) finansman desteğini de kabul ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL Mikrofüj TüpleriPhoenixMPC-425Q
1L Santrifüj TüpüBeckman CoulterA99028
Avanti JE SantrifüjBeckman Coulter369001
CoASigma-AldrichC3144-25MG
Sitasyon 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuBiotekBTCYT5F
D-GlikozFisherD16-3
D-LaktozAlfa AesarJ66376
DTTThermoFisher15508013
Folinik AsitSigma-AldrichF7878-100MG
GliserolFisherBP229-1
GlisinSigma-AldrichG7126-100G
HEPESThermoFisher11344041
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
K (Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
K (OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
L-AlaninSigma-AldrichA7627-100G
L-ArgininSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparaginSigma-AldrichA0884-25G
L-AspartikAsit Sigma-AldrichA7219-100G
L-SisteinSigma-AldrichC7352-25G
L-GlutamikAsit Sigma-AldrichG1501-500G
L-GlutaminSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadinSigma-AldrichH8000-25G
L-İzolösinSigma-AldrichI2752-25G
L-LösinSigma-AldrichL8000-25G
L-LizinSigma-AldrichL5501-25G
L-MetioninSigma-AldrichM9625-25G
L-FenilalaninSigma-AldrichP2126-100G
L-ProlinSigma-AldrichP0380-100G
L-SerinSigma-AldrichS4500-100G
L-TreoninSigma-AldrichT8625-25G
L-TriptofanSigma-AldrichT0254-25G
L-TirozinSigma-AldrichT3754-100G
Luria SuyuThermoFisher12795027
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
Mikrofüj 20Beckman CoulterB30134
Moleküler Sınıf SuSigma-Aldrich7732-18-5
NaClAlfa AesarA12313
NADSigma-AldrichN8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R İnkübatörEppendorfM1335-0000
NH4 (Glu)Sigma-Aldrich09689-250G
NTP'lerThermoFisherR0481
Oksalik AsitSigma-AldrichP0963-100G
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
Potasyum Fosfat DibazikAkros, OrganiklerA0382124
Potasyum Fosfat MonobazikAkrolar, OrganiklerA0379904
PureLink HiPure Plazmid Hazırlık KitiThermoFisherK210007
PutresinSigma-AldrichD13208-25G
SpermidinSigma-AldrichS0266-5G
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
tRNASigma-Aldrich10109541001
TriptonFisher Biyoreaktifleri73049-73-7
Tunair 2.5L Şaşkın Sallama ŞişesiSigma-AldrichZ710822
Ultrasonik İşlemciQSonicaQ125-230V/50HZ
Maya Özü FisherBiyoreaktifleri1/2/8013

Kaynaklar

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663(2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Etiketler

E Coli EkstraktlarH creden Ba ms z EkspresyonProtein M hendisli iH cre LizisiSonikasyon Y ntemiFloresan KantifikasyonuS30 TamponuBiyoteknoloji E itimi
Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.