Nano Ölçekli Malzemelerin Zaman-Evrimini Durdurulmuş Akış ve Küçük Açılı Nötron Saçılması ile Ölçme

Summary

Bu protokol, küçük açılı nötron saçılma ölçümü sırasında birden fazla sıvı çözeltisini yerinde hızlı bir şekilde karıştırmak ve nanometre uzunluk ölçeklerinde ve ikinci zaman ölçeklerinde kinetik süreçleri incelemek için durdurulmuş akışlı bir numune ortamının kullanımını sunar.

Abstract

Bu makale, sıvı numuneleri hızlı bir şekilde karıştırmak ve nano ölçekli kinetik süreçleri saniyeler ila dakikalar arasındaki zaman ölçeklerinde incelemek için durdurulmuş akışlı küçük açılı nötron saçılması (SANS) numune ortamının kullanımını sunmaktadır. Durdurulmuş akışlı numune ortamı, istenen hacimlerde sıvı numuneleri karıştırmak için piyasada satılan şırınga pompalarını kullanır ve bunlar daha sonra dinamik bir karıştırıcıdan yaklaşık 1 sn içinde bir kuvars cam hücresine enjekte edilir. Zaman çözümlü SANS veri toplama, karıştırmadan sonra çözeltideki nanoyapının evrimini takip etmek için numune karıştırma ile senkronize edilir.

Nötron ışını zamanını en verimli şekilde kullanmak için, ölçümler arasında hücreyi otomatik olarak yüklemek, durulamak ve kurutmak için bir dizi akış seçici valf kullanıyoruz ve bu da birden fazla numune enjeksiyonu boyunca tekrarlanan veri toplanmasına izin veriyor. Yeterli nötron saçılma istatistikleri toplanana kadar numune enjeksiyonları tekrarlanır. Karıştırma kurulumu, farklı karıştırma oranlarında, numune konsantrasyonlarında, katkı konsantrasyonlarında ve sıcaklıklarda kinetiği ölçmek için koşulları sistematik olarak değiştirecek şekilde programlanabilir. Enjeksiyon başına gereken minimum numune hacmi, kuvars hücresinin yol uzunluğuna bağlı olarak yaklaşık 150 μL'dir.

Bu durdurulmuş akışlı numune ortamını kullanan temsili sonuçlar, bir katkı maddesi, siklodekstrin varlığında hızlı lipit değişim kinetiği için sunulmuştur. Veziküller, dış broşür (dış) lipitleri saniyeler içinde değiştirir ve saatler içinde hem iç hem de dış lipitleri tamamen değiştirir. Lipid değişim kinetiğinin ölçülmesi, daha hızlı (saniye) ve daha yavaş (dakika) süreçleri yakalamak ve kinetik hız sabitlerini çıkarmak için yerinde karıştırma gerektirir. Aynı numune ortamı, lipit nanopartikülleri, proteinler, yüzey aktif maddeler, polimerler, emülsiyonlar veya inorganik nanopartiküller gibi diğer sıvı numune türlerinde moleküler değişimi araştırmak için de kullanılabilir. Nano ölçekli yapısal dönüşümleri ve değişim veya reaksiyona giren sistemlerin kinetiğinin ölçülmesi, nano ölçekte gelişen süreçlere yeni bakış açıları sağlayacaktır.

Introduction

Küçük açılı nötron saçılması (SANS), çeşitli malzemelerin boyutlarını, şekillerini, etkileşimlerini ve organizasyonlarını ≈1 nm ila ≈100 nm ^1,2,3 arasındaki uzunluk ölçeklerinde ölçmek için benzersiz bir yol sağlar. Odaklama aynalı VSANS (çok küçük açılı nötron saçılımı) cihazları da dahil olmak üzere yeni cihazlar, ≈1000 nm ^4,5'e kadar daha büyük uzunluktaki ölçekleri ölçmeye yönelik sınırları zorlamaktadır. Genel olarak, nötron saçılma yöntemlerine özgü benzersiz saçılma kontrastı, farmasötik formülasyonlardaki bileşenlerin toplanması⁶, polimer sistemlerde çapraz bağlanma ve jelasyon reaksiyonları^7,8, membran proteinlerinin mezo kristalizasyonunda ^9,10, proteinlerin parçalanması ve açılması^11,12 gibi nano ölçekli yapıların zaman evrimini ölçmede çeşitli avantajlar sunar ve silika bazlı malzemelerin büyümesi^13,14,15. Benzersiz saçılma kontrastı, zaman çözümlü SANS'I (TR-SANS) diğer durdurulmuş akış tabanlı ölçümler için kullanışlı bir tamamlayıcı haline getirir.

Durdurulmuş akışlı karıştırma yöntemleri genellikle küçük açılı X-ışını saçılması (SAXS)16,17,18,19,20,21, floresan spektroskopisi 22,23,24,25,26 ve ışık saçılması ^27,28,29,30, Kinetik süreçleri milisaniye zaman ölçeklerinde incelemek için ^31,32 deney. SANS ve SAXS arasındaki önemli bir fark, nötron saçılmasının tahribatsız bir karakterizasyon tekniği olmasıdır ve bu nedenle, SANS, aynı numuneyi, numuneye iyonlaştırıcı radyasyon hasarı vermeden saatlerce hatta günlerce ölçmek için kullanılabilir; bu, daha yüksek akılı X-ışını saçılma deneyleri sırasında meydana gelebilir³³. Tekrarlanan SANS ölçümleri prob molekülünün veya numunenin kimyasal yapısını değiştirmeyeceğinden, zaman evrimi, örneğin floresan^23,24'e dayanan kinetik ölçümleri zorlaştırabilecek fotobeyazlatmanın etkileri olmadan incelenebilir. Dahası, SANS, dinamik ışık saçılması gibi ışığa dayalı tekniklerle karakterize edilmesi genellikle zor olan yüksek konsantrasyonlu ve optik olarak opak numuneleri ölçmek için kullanılabilir.

Nano ölçekte yapısal bilgi sağlamanın yanı sıra, SANS, nötron saçılma uzunluğu yoğunluk kontrastındaki varyasyon yoluyla bu yapıların yerel bileşimini araştırmak için kullanılabilir. Farklı elementlerin saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) periyodik tablo boyunca rastgele değişir ve aynı elementin farklı izotoplarına göre değişir. Yaygın olarak kullanılan bir örnek, çok farklı nötron saçılma uzunluklarına sahip olan hidrojen (¹H veya H) ve döteryumdur (²H veya D). Bu nedenle, yüzey aktif maddeler, lipitler, proteinler, RNA, DNA ve diğer polimerler gibi hidrojen bakımından zengin malzemeler, sistemin fiziksel özelliklerini önemli ölçüde değiştirmeden SANS kullanılarak deuterated çözücülerden ayırt edilebilir. Bununla birlikte, H / D değişiminin numunedeki yoğunluğu, hidrojen bağını ve faz geçiş sıcaklıklarını etkileyebileceğini belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, SANS'ın hidrojen bakımından zengin malzemelere karşı benzersiz duyarlılığı, özellikle ilgilenilen numunelerin SAXS gibi X-ışını tabanlı tekniklerde daha düşük saçılma kontrastına ve sinyaline sahip olduğu yumuşak madde araştırmalarında yararlıdır. İzotopik ikame aynı zamanda SANS'ı, H etiketli ve D etiketli molekülleri karıştırarak hidrojen bakımından zengin malzemelerdeki moleküler değişim kinetiği incelemek için güçlü bir araç haline getirir. İzotopik ikame, hacimli floresan boyaların ilgilenilen yüzey aktif madde veya lipit moleküllerinden daha büyük olduğu ve değişim kinetiğini etkileyebileceği sistemlerde özellikle yararlıdır^34,35.

Zaman çözümlü SANS ölçümleri avantajlıdır çünkü ölçülen yoğunluk zaman, uzunluk ölçeği ve SLD kontrastının bir fonksiyonudur. Bu nedenle, TR-SANS deneyleri, mekansal dağılımlardaki ve örneklerin kompozisyonlarındaki zamana bağlı değişiklikleri araştırmak için tasarlanabilir. SANS'ın bu benzersiz avantajları, yüzey aktif maddeler 36,37,38, emülsiyonlar^39,40,41, lipitler 34,42,43,44,45,46,47,48,49 gibi birçok yumuşak malzeme sisteminde kinetik süreçler hakkında önemli bilgiler edinmiştir ^,50 ve polimerler 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. TR-SANS çalışmalarının çoğu, dakikalar ila saatler arasındaki zaman ölçeklerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, ilgilenilen birçok kinetik süreç ikinci zaman ölçeğinde meydana gelir ve altta yatan mekanizmaları anlamak için gereklidir. Bu erken zaman noktalarının yakalanması, çözeltilerin hızlı bir şekilde karıştırılmasını ve yerinde ölçülmesini gerektirir; burada karıştırma, durdurulmuş akışlı ışık saçılması 27,28,29,30,31,32, floresan ^{22,23,24,25,26} ve X-ışını ^{sırasında veri toplama ile senkronize edilir} 16,17,18,19,20,21 deney. Bu çalışma, TR-SANS ölçümleri için birden fazla sıvı numuneyi hızlı bir şekilde karıştırmak ve karışımı bir kuvars cam hücresine enjekte etmek için tasarlanmış bir numune ortamının kullanımını açıklamaktadır. Karıştırma cihazı, yakın zamanda geliştirilen kılcal reoSANS cihazı^63'ün bir uyarlamasıdır ve numune karıştırmayı kontrol etmek ve hücre temizliğini otomatikleştirmek için birden fazla şırınga pompası ve valfi kullanır. Şırınga pompalarını bir dizi akış seçici vanaya bağlayarak, TR-SANS ölçümlerini saniye zaman ölçeğinde kolaylaştırmak için birden fazla giriş akışı tekrar tekrar karıştırılabilir, ölçülebilir, durulanabilir ve kurutulabilir.

Mevcut prosedür, ilgilenilen örneklerin tanımlandığını ve hazırlandığını varsaymaktadır. TR-SANS verilerini toplamak için yerinde karıştırma kurulumuna ve yöntemlerine odaklanıyoruz. Nötron saçılma verileri, NIST Nötron Araştırma Merkezi'ndeki (NCNR) VSANS cihazında toplandı; ancak, prosedür diğer SANS cihazlarına uygulanabilir olmalıdır. Benzer protokolleri diğer SANS cihazlarına uygulamak isteyen okuyucular, ilgilenilen kinetik süreçlerle en alakalı istenen uzunluk ölçeğinde ve zaman ölçeğinde nötron akısını en üst düzeye çıkarmak için en uygun cihaz konfigürasyonunu belirlemek için yerel cihaz bilim insanlarına danışmalıdır. Burada sunulan veriler, uzamsal çözünürlük⁵ kaybında nötron sayımlarını en üst düzeye çıkarmak için VSANS üzerindeki yüksek akı 'beyaz ışın' konfigürasyonu kullanılarak toplanmıştır. Dedektör taşıyıcıları, ≈130 nm ila ≈13 nm uzunluk ölçeklerine karşılık gelen 0,005 Å-1 < q < 0,5 ^Å-1 aralığındaki bir dizi saçılma vektörünü (q) kapsayacak şekilde konumlandırılmıştır. Saçılma vektörü, q = 4π / λ günah (θ / 2) olarak tanımlanır; burada λ, nötron dalga boyu ve θ, saçılma açısıdır.

TR-SANS ölçümleri için kullanılan durdurulmuş akışlı karıştırma cihazı, Şekil 1'de görüldüğü gibi birden fazla pompa, durulama şırıngası, numune şırıngası, akış seçicilerin yanı sıra adinamik karıştırıcı, numune hücresi ve karışık numune kabından oluşmaktadır. Tüm sızdırmaz sıvı yolları, şırıngaları, vanaları, bağlantı borularını, dinamik karıştırıcıyı ve numune hücrelerini içeren klimalı bir muhafazanın içine yerleştirilmiştir. Muhafaza sıcaklığını ±1 °C içinde 10 °C ila 50 °C aralığında kontrol etmek için programlanabilir bir termoelektrik klima kullanılır. Cihazın çalışan parçalarını göstermek için muhafaza yalıtımının bir kısmının kaldırıldığını unutmayın. Ana karıştırma cihazı muhafazası, NCNR'deki NG3 VSANS ışın hattındaki bir çeviri aşamasına yerleştirilmiştir. Muhafaza konumu, numune hücresini nötron ışınının yoluna (sarı kesikli çizgi) yerleştirmek için çeviri aşaması kullanılarak ayarlanır.

Şekil 1: NIST Nötron Araştırma Merkezi'ndeki VSANS ışın hattında durdurulmuş akışlı karıştırma ve küçük açılı nötron saçılma ölçümlerini birleştirmek için örnek bir kurulum. Kurulumda dört şırınga pompası, solvent durulama için iki şırınga ve numune enjeksiyonu için iki şırınga, dört pompa seçici valf, iki karıştırıcı seçici valf, bir dinamik karıştırıcı, bir akışlı kuvars hücresi ve bir karışık numune kabı bulunur. Gelen nötronlar, numune hücresinin içinde bulunan karışık numuneyi saçar. Kuvars pencereli yalıtımlı bir muhafaza ve termoelektrik klimalı bir ünite, numuneyi ve tüm ekipmanı sabit bir sıcaklıkta kontrol etmek için kullanılır. Sarı kesikli çizgi nötron ışını yolunu gösterir. Ölçek çubuğu = 10 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 1'de gösterilen cihaz, iki numune şırıngası, iki durulama şırıngası ve bir numune hücresi ile yapılandırılmıştır. Protokolün farklı adımları için karşılık gelen akış diyagramları Şekil 2'de gösterilmiştir. İki farklı numunenin istenilen hacimleri miksere ve numune hücresine enjekte edilir (Şekil 2A). Numune hücresi doldurulduktan sonra, numune hücresini dinamik karıştırıcıdan izole etmek ve TR-SANS veri toplama sırasında numunenin hücreye geri difüzyonunu önlemek için Giriş Anahtar Vanası (ISV) ve Çıkış Anahtar Vanası (OSV) kapatılır (Şekil 2B). Dinamik karıştırıcıdan önce, bağlantı borusunun uzunluğu 10 cm ila 1 m arasında değişir ve karıştırma gecikme süresini etkilemez. Bununla birlikte, dinamik karıştırıcı ile numune hücresi arasındaki boru bağlantıları, karıştırma gecikme süresini ve gerekli numune enjeksiyon hacmini etkileyecektir. Dinamik karıştırıcıyı, Mikser Seçici Vanaları (MSV1 ve MSV2) ve ISV ve OSV'yi bağlamak için 0,04 inç (1 mm) iç çapa ve 100 mm uzunluğa sahip önceden kesilmiş paslanmaz çelik borular kullanılır. ISV ve OSV'yi (veya dinamik karıştırıcı çıkışını) numune hücresine bağlamak için 1 mm iç çapa ve 115 mm uzunluğa sahip florlu boru kullanılır. Karıştırma gecikme süresini etkileyen toplam boşluk hacmi, mikser boşluk hacmini (0,15 mL), karıştırıcı çıkışı ile numune hücresi girişi arasındaki boruyu (0,09 mL) ve numune hücresi hacmini (0,16 mL) içerir. Bu örnekte, toplam boşluk hacmi 0,4 mL'dir. Vanaların iç boşluk hacimleri, boru, karıştırıcı ve numune hücresi boşluk hacimlerine kıyasla ihmal edilebilir. Örneğin, kullanılan düşük basınçlı seçici valfler (0,75 mm delik çapı) yaklaşık 4 μL'lik boşluk hacimleri içerirken, yüksek basınçlı seçici valfler ve anahtar valfleri (0,25 mm delik çapı) yaklaşık 0,5 μL'lik boşluk hacimleri içerir.

TR-SANS ölçümü tamamlandıktan sonra, numune çözücü ile hücre dışına itilir ve artık numuneyi çıkarmak ve numune hücresini temizlemek için durulama çözücüsü hücre içinden tekrar tekrar pompalanır (Şekil 2C). Durulama şırıngalarının, ölçüm çalışmaları arasında numune hücresini temizlemek için yeterli çözücü hacminin mevcut olduğundan emin olmak için pompa seçici değerleri aracılığıyla daha büyük çözücü rezervuarlarına (örn. su ve etanol) bağlandığını unutmayın. Solvent kaynakları, numune kaynakları ve yanıcı sıvılar içeren karışık numune kapları, olası tüm ateşleme kaynaklarını ortadan kaldırmak için elektrikli ekipman içermeyen ayrı bir muhafazaya yerleştirilir. Ek olarak, yanıcı buharları ve çözücü buharlaşmasını en aza indirmek için buhar kilitlemeli şişe kapakları kullanılır. Son olarak, artık durulama çözücüsünü uzaklaştırmak için numune hücresi bir azot gazı akışı ile kurutulur (Şekil 2D). Karıştırıcı seçici vanasına giriş azot gazı basıncı, azot gazı silindiri üzerinde bulunan manuel bir basınç regülatörü kullanılarak yaklaşık 2 bar'a (0,2 MPa, gösterge basıncı) ayarlanır. Numune hücresi yeterince temizlendikten ve kurutulduktan sonra, bir sonraki ölçüm döngüsü için numune hücresine yeni karıştırılmış bir numune enjekte edilir ( Şekil 2A'daki akış diyagramında gösterilen karıştırma ve enjeksiyonu tekrarlayarak).

Şekil 2: Bir numune hücresi, iki numune karıştırma ve temizlik için iki durulama çözücüsü kullanan örnek akış diyagramı . (A) Numune A (mavi) ve numune B'nin (kırmızı) karıştırılması ve daha sonra karıştırılan numunenin (mor) numune hücresine akıtılması. (B) Veri toplama sırasında, numune hücresini izole etmek ve veri toplama sırasında numunenin geri yayılmasını önlemek için ISV ve OSV anahtar valflerinin kapatıldığı durdurulmuş akışlı cihaz durumu. (C) Veri toplandıktan sonra numune hücresinin SS1'den (yeşil) durulama çözücüsü ile durulandığı temizleme adımları. (D) Numune hücresinin azot gazı (turuncu) ile kurutulduğu kurutma adımı. Kısaltmalar: PSV = pompa seçici valf; MSV = mikser seçici vana; OSV = çıkış anahtar valfi; ISV = giriş anahtarı valfi; SS1 = çözücü kaynağı 1; SSA = örnek kaynak A; N2 = azot gazı kaynağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3, karıştırma kurulumunun aynı şalt vanalarına bağlı iki ayrı numune hücresiyle yapılandırıldığı biraz farklı bir versiyon için akış diyagramlarını göstermektedir (Şekil 3A). TR-SANS verileri Örnek Hücre 1'de toplanırken, Örnek Hücre 2 durulanır (Şekil 3B) ve kurutulur (Şekil 3C). Örnek Hücre 1 için veri toplama tamamlandığında, Giriş Anahtar Vanası yeni karıştırılmış bir numuneyi veri toplama için Örnek Hücre 2'ye yönlendirir (Şekil 3D). TR-SANS verileri Örnek Hücre 2'de toplanırken, Örnek Hücre 1 durulanır ve kurutulur (Şekil 3E). İki numune hücresi arasındaki bu alternatif, paralel işlem, sonraki numune enjeksiyonları arasındaki süreyi en aza indirir ve nötron ışını zamanının kullanımını en üst düzeye çıkarır.

Şekil 3: İki numuneli hücre, iki numune karıştırma ve temizlik için iki durulama çözücüsü kullanan örnek akış diyagramı. (A) Numune A (mavi) ve numune B'nin (kırmızı) karıştırılması ve daha sonra karıştırılan numunenin (mor) numune hücre 1'e akıtılması. (B) Numune hücresi 2, SS1'den (yeşil) çözücü ile durulanırken, numune hücresi 1'de veri toplama sırasında durdurulan akış cihazı durumu. (C) Numune hücresi 1'de veri toplanması sırasında durdurulan akış cihazı durumu, numune hücresi 2 ise azot gazı (turuncu) ile kurutulur. (D) Örnek hücre 1'in veri toplanması tamamlandıktan sonra, yeni bir numune (mor) derhal karıştırılır ve numune hücresi 2'ye akar. (E) Numune hücresi 1, SS1'den (yeşil) çözücü ile durulanırken, numune hücresi 2'de veri toplama sırasında durdurulan akış cihazı durumu. Bir örnek hücre ölçülürken, diğer örnek hücre temizlenir ve kurutulur. Durdurulmuş akış ölçüm prosesi, sonraki numune karıştırma enjeksiyonları arasındaki süreyi en aza indirmek için iki numune hücresi arasında geçiş yapar. Kısaltmalar: PSV = pompa seçici valf; MSV = mikser seçici vana; OSV = çıkış anahtar valfi; ISV = giriş anahtarı valfi; SS1 = çözücü kaynağı 1; SSA = örnek kaynak A; N2 = azot gazı kaynağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Pompaların ve boru hatlarının bağlanması, sistemin astarlanması, numune hücresinin durulanması ve kurutulması ve karışık numunenin enjekte edilmesi için adım adım bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Tek hücreli konfigürasyon basitlik için gösterilse de (Şekil 2), esnek modüler kurulum, protokol ve komut dosyaları, Şekil 3'te gösterilen iki örnekli hücre konfigürasyonu gibi daha fazla şırınga pompası, vana, karıştırıcı veya numune hücre konfigürasyonu uygulamak için kolayca değiştirilebilir. Karıştırma ve temizleme enjeksiyon döngüleri boyunca toplanan temsili ham nötron sayım oranı verileri Şekil 4'te gösterilirken, 3 farklı sıcaklıkta ölçülen lipit değişim kinetiği ve değiştirilen lipitlerin fraksiyonuna karşılık gelen ekstrakte edilmiş normalize dağılmış yoğunluk sırasıyla Şekil 5 ve Şekil 6'da gösterilmiştir.

Protocol

1. Durdurulan akış sistemini kurun ve başlatın.

1. Güç düğmesini kullanarak tüm pompa güç kaynaklarını ve dinamik karıştırıcıları açın.
2. Durdurulan akış sistemi kontrol grafik kullanıcı arabirimindeki (GUI) tüm pompa ve vanaları, cihaz yapılandırma yolunu girerek ve bus=qmixbus komutlarını kullanarak başlatın. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable() ve valve=ViciMultiposSelector() (çevrimiçi açık kaynak deposu^64'te bulunan örnek başlatma koduna bakın).
3. Şırıngaları takmadan önce pump.calibrate() komutunu kullanarak pompaları kalibre edin.
4. Valflerin başlatıldığını onaylayın ve valve.setPort() ve valve.getPort() komutlarını kullanarak komutta doğru seçici bağlantı noktasına gidin.
5. A'nın şırınga namlusu iç çapı (mm) ve B'nin şırınga maksimum piston strok mesafesi (mm) olduğu pump.set_syringe_param(A, B) komutunu kullanarak her pompa için kullanılacak şırınga tipini atayın.
6. Numune şırıngalarını şırınga pompalarına bağlayın.
   1. Pompaların kalibre edildiğinden emin olduktan sonra, temiz şırınga varillerini pompanın üstündeki bağlantıya (şırınga montaj kafası) vidalayın.
   2. Cam şırıngalar kullanırken, dolum hacmini dağıtmadan önce şırınga montaj kafasının gevşetildiğinden emin olun, böylece cam şırınga, şırınga pistonundan gelen aşırı kuvvet nedeniyle kırılmaz.
   3. Şırınga pistonunu pompanın altındaki bağlantıya vidalayın (şırınga montaj kuyruğu).
   4. Şırınga namlusu ve şırınga pistonu pompaya bağlandıktan sonra, şırınga pistonunu şırınga kovanının üstüne taşıyan pump.empty() komutunu kullanarak şırınga tipinin dolum hacmini dağıtın.
   5. Cam şırıngalar kullanırken, piston hareketi durduktan sonra şırınga montaj kafasını sıkın.
7. Boruyu numune ve çözücü kaynaklarına, şırıngalara, vanalara, karıştırıcılara, numune hücrelerine ve karışık numune kabına bağlayın.
   1. Şırınga pompası borusunu pompa seçici vanalara bağlayın.
   2. Pompa seçici valf borusunu numune kaynaklarına bağlayın.
   3. Pompa seçici valf borusunu durulama çözücü kaynaklarına bağlayın.
   4. Pompa seçici valf borusunu mikser seçici vana borusuna bağlayın.
   5. Mikser seçici valf borusunu azot gazı kaynağına bağlayın.
   6. Mikser seçici valf borusunu mikser girişlerine bağlayın.
   7. Mikser çıkışını giriş anahtarı vanasına bağlayın.
   8. Giriş anahtarı valfini numune hücresi girişine bağlayın.
   9. Örnek hücre çıkışını çıkış anahtarı vanasına bağlayın.
   10. Çıkış anahtarı vanasını karışık numune kabına bağlayın.
8. Durdurulan akışlı sistem kontrol GUI'sinde yapılan tüm boru ve valf bağlantılarını tanımlayın (Adım 1.7), her bir vanaya yapılan ilgili bağlantı noktası numarası bağlantılarını yazarak (çevrimiçi açık kaynaklı depo^64'teki örnek kontrol koduna bakın).
9. Her ölçüm için numune hücresini doldurmak için gereken minimum numune miktarını tanımlayan karıştırıcı girişi ile numune hücresi çıkışı arasındaki borunun boşluk hacmini hesaplayın.

2. Numuneyi yükleyin.

1. İstenilen sayıları yazarak durdurulan akış sistemi kontrol GUI'sinde istenen numune dolum hacmini ve çözücü dolum hacmini ayarlayın (çevrimiçi açık kaynaklı depo^64'teki örnek kontrol koduna bakın).
2. İstenilen numune ve çözücü hacimlerini pompa seçici vanalar aracılığıyla kaynaklarından numune şırıngalarına çekmek (aspire etmek) için pump.aspirate() komutunu kullanın.
   NOT: Boş bir şırıngayı ilk kez yüklerken, şırınganın üst kısmında, 3. adımda sistemi numune ve çözücü ile astarlamak için temizlenmesi gereken hava bulunacaktır.

3. Sistemi astarlayın.

1. Şırıngalardan, boru hatlarından ve vanalardan gelen tüm havayı dışarı itmek (dağıtmak) için pump.dispense() komutunu kullanın. Şırıngalardan, borulardan ve vanalardan tüm havayı tamamen çıkarmak için her şırıngadan yeterli sıvı hacminin dağıtıldığından emin olun. Herhangi bir borunun içinde hava kabarcıkları görülebiliyorsa, kabarcıklar çıkarılana kadar çözücü veya numune dağıtmaya devam edin.
2. Hava sistemden temizlendikten sonra, en az bir numune enjeksiyonu ve durulama prosedürü uygulayın (nötron saçılma verileri toplanmadan).
   1. Kontrol GUI'sinde Karıştırma deneyini başlat etiketli hücreyi seçmek için tıklatın.
   2. Bu hücre etkin bir şekilde seçiliyken, kontrol GUI'sinin üst kısmında bulunan Çalıştır düğmesine (sağ üçgen) tıklayın veya klavyede Shift ve Enter tuşlarına birlikte basın.
   3. Hava kabarcıklarının mevcut olmadığını doğrulamak için numune hücresini görsel olarak inceleyin.
      1. Hava kabarcıkları varsa, boru hatlarındaki havayı daha fazla temizlemek için protokol adımları 3.1 ve 3.2'yi tekrarlayın.
      2. Örnek hücrede hava kabarcıkları yoksa, kalan deney protokolü adımlarını tanımlamak için adım 4'e geçin.

4. Program betiğinde durdurulmuş akış karıştırma protokolünü tanımlayın (çevrimiçi açık kaynak deposu^64'teki kod örneğine bakın).

1. Durdurulan akış cihazını çevreleyen yalıtımlı muhafazanın sıcaklığını kontrol eden programlanabilir klima (AC) ünitesinin sıcaklık ayar noktasını girin.
   1. AC kontrol ünitesindeki yıldız düğmesini basılı tutarken, ayar noktası sıcaklığını değiştirmek için yukarı ve aşağı oklara basın. Alternatif olarak, kontrol GUI'sine istediğiniz sıcaklık ayar noktasını yazın ve Çalıştır'a tıklayın.
   2. Kinetik deneylere başlamadan önce muhafaza içinin istenen sıcaklıkta dengelenmesine izin vermek için 15-30 dakika bekleyin.
      NOT: Erişilebilir sıcaklık aralığı şu anda 10 °C ile 50 °C arasındadır ve sıcaklık kararlılığı ± 1 °C'dir.
2. Kontrol GUI'sine uygun hacimleri, akış hızlarını, süreleri ve tekrarlama sayısını yazarak tüm durulama sırası adımlarını girin.
   1. Enjekte edilecek her numunenin hacmini tanımlayın, bu da toplam akış hızını (Q) tanımlar.
   2. Durulama prosedürü sırasında enjekte edilecek her çözücünün hacmini tanımlayın.
   3. Her durulama alt adımı arasındaki kuruma süresini tanımlayın (t_kuru).
   4. Durulama alt adımlarının sayısını tanımlayın.
   5. Sonraki durulama adımları için farklı çözücüler tanımlayın.
   6. Her ölçümden sonra gerçekleştirilecek durulama tekrarlarının sayısını tanımlayın (n_durulama).
   7. Numune hücresinin ve mikserin tamamen kuruması için gereken süreyi tanımlayın ve sonraki numune enjeksiyonu için temiz bir numune hücresi sağlayın (t_{dry_final}).
3. Durdurulan akış sistemi kontrol GUI'sine uygun hacimleri, akış hızlarını ve zamanları yazarak tüm numune enjeksiyon sırası adımlarını tanımlayın.
   1. Enjekte edilecek her numunenin hacmini ve akış hızını tanımlayın.
   2. Boşluk hacminden (V_boşluk) gecikme süresini (t gecikmesi) ve toplam akış hızını (t_gecikmesi = V_boşluk/ Q) hesaplayın.
      NOT: Gecikme süresi, numune hücresini karışık numuneyle doldurmak için gereken süredir.
   3. TR-SANS verileri için istenen edinme zamanını, ilgilenilen tüm kinetik sürecin (t_scatt) gerçekleşeceği şekilde tanımlayın.
   4. Saçılma deneyinin sonu ile durulama döngülerinin başlangıcı arasındaki bekleme süresini ayarlayın (t_bekleyin).
      NOT: Numune nötron iletimi hücreden durulanmadan önce ölçülecekse, bu bekleme süresi en az 100 s olmalıdır. Verileri mutlak yoğunluğa düşürmek için veri işleme sırasında numune iletimi gereklidir.
   5. Adım 4.2'de (n_döngüsü) tanımlanan her enjeksiyon arasında çalışan durulama sekansları ile gerçekleştirilecek enjeksiyon döngülerinin sayısını tanımlayın.
4. Denklemi (1) kullanarak tek bir durdurulmuş akış veri toplama döngüsünün (t_döngüsü) toplam süresini hesaplayın.
   t_döngüsü = n_durulama × (t gecikmesi + t_kuru) + t_{dry_final} + t_gecikmesi + t_scatt (1)
   n_{durulama = durulama} tekrarlarının sayısı (adım 4.2.6); t_delay = durdurulan akış cihazının gecikme süresi (adım 4.3.2); t_kuru = her durulama alt adımı arasındaki kuruma süresi (adım 4.2.3); t_{dry_final} = numune hücresinin ve mikserin tamamen kuruması için gereken süre (adım 4.2.7); t_scatt = İstenilen TR-SANS veri toplama süresi (adım 4.3.3)

5. SANS cihaz kontrol GUI'sinde küçük açılı nötron saçılma parametrelerini tanımlayın.

1. Her numune için uzunluk ölçeklerini ve ilgilenilen q-aralığını belirleyin.
2. Numunedeki nötron akısını en üst düzeye çıkarırken, istenen q-aralığını kapsayacak şekilde cihaz konfigürasyonunu tanımlayın.
3. SANS cihaz kontrol GUI'sindeki toplam VSANS veri toplama süresini, adım 4.4'teki hesaplanan döngü süresine ayarlayın (nötron saçılma veri toplama süresi = t_döngüsü).
4. SANS cihaz kontrol GUI'sinde numune iletim ölçüm süresini 100 sn olarak ayarlayın.
5. SANS enstrüman denetimi GUI'sini kullanarak, komut satırına GenerateEventModeData true yazarak olay modu veri toplamayı açın.

6. TR-SANS verilerini işlemek için durdurulmuş akış deneyine başlamadan önce veri azaltma için standart saçılma ölçümlerini toplayın.

1. Arka plan saçılımını ölçün.
   1. Yerel enstrüman deklanşörünün kapalı olduğundan emin olun.
   2. Bloke edilmiş ışın örneğini numune açıklığının arkasına takın, yerel enstrüman ortamını sabitleyin ve yerel enstrüman deklanşörünü açın.
   3. Yazılımda engellenen ışın saçılma veri toplama süresini tanımlayın ve en uzun saçılma veri toplama süresi (t_scatt) ile aynı süre boyunca sayarak engellenen ışın saçılma verilerini toplayın.
   4. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, cihaz deklanşörünü kapatın ve bloke edilmiş ışın örneğini numune açıklığından çıkarın.
2. Boş hücre saçılımını ölçün.
   1. Numune hücresinin iyice durulandığından ve kurutulduğundan emin olun.
   2. Yerel enstrüman deklanşörünü açın.
   3. 100 sn için boş hücre iletim ölçümünü toplayın.
   4. En azından en uzun edinme süresi (t_scatt) için sayarak boş hücre saçılma ölçümünü toplayın.

7. Durdurulmuş akış deneyine başlayın.

1. VSANS saçılma veri toplamayı olay modunda başlatın.
   1. Yerel enstrüman alanının güvenli olduğundan emin olun ve ardından yerel enstrüman ışını deklanşörünü açın.
   2. Cihaz bilgisayarındaki SANS cihaz kontrol yazılımını kullanarak, istenen çalıştırmaları cihaz kuyruğuna sürükleyip bırakarak SANS veri toplamaya başlayın.
      NOT: En erken zaman noktalarının ölçüldüğünden emin olmak için, durdurulmuş akışlı karıştırma deneyine başlamadan önce veri toplamaya başlayın. Veriler, gecikme süresini (t_gecikmesi) hesaba katmak için daha sonraki bir adımda sonradan işlenecektir.
2. Kontrol GUI'sinde durdurulmuş akış karıştırma deneyini başlatın.
   1. Durdurulan akış sistem denetimi GUI'sinde Karıştırma deneyini başlat etiketli dizüstü bilgisayar hücresini seçin.
   2. Bu hücre etkin bir şekilde seçiliyken, durdurulan akışlı aygıt kontrol programının üst kısmında bulunan Çalıştır düğmesine (sağ üçgen) tıklayın veya klavyede Shift ve Enter tuşlarına birlikte basın.
   3. Bölüm 4'te tanımlanan durdurulmuş akış karıştırma protokolünün çalışmaya başladığını onaylayın.
   4. SANS cihaz kontrol GUI'sini kullanarak saçılma çalışmasından sonra VSANS cihaz kuyruğuna 100 s iletim ölçümünü ekleyin.
   5. SANS cihaz kontrol GUI'sinde kalan her durdurulmuş akışlı karıştırma döngüsü (n_döngüsü - 1, adım 4.3.5) için cihaz kuyruğuna bir saçılma ölçüm çalıştırması ve bir iletim ölçüm çalıştırması ekleyin.

8. Tüm arka planları kaldırmak, dedektör hassasiyeti için doğru ve numune iletimi için doğru olmak üzere verileri işleyin ve azaltın.

1. Dağılım veri dosyalarını ve ilişkili olay dosyalarını sunucudan indirin.
   NOT: Her VSANS ölçümünden sonra ayrı dedektör olay dosyaları, her aktif dedektör taşıyıcısı için bir olay dosyası (ör. ön, orta ve/veya arka dedektör) oluşturulur.
2. Events=Rebin(filename) komutunu kullanarak saçılma verilerini istenen zaman kutularına saçın ve ardından e vents.do_rebinning(timebins) komutunu kullanın, burada giriş dosyası adı istenen SANS veri dosyasının adına karşılık gelir vetimebins saniye cinsinden istenen zaman kutusu sınırlarının bir listesidir.
   NOT: Giriş zaman kutuları liste yerine tek bir sayı olarak girilirse, veriler eşit zaman genişliklerine sahip N sayıda bölmeye bağlanır, burada N giriş zaman kutularıdır (bkz. ışın çizgisi tarafından sağlanan yazılım komut dosyaları ve mevcut çevrimiçi açık kaynaklı depo⁶⁴).
3. Beamline⁶⁵ yazılımı kullanarak ciltlenmiş saçılma verilerini azaltın.

9. TR-SANS verilerini analiz eder.

1. Denklemi (2) kullanarak ölçüm sürelerinden ilgilenilen işlem süresini (t _süreci) hesaplayın.
   t_işlemi = t_i - t_durdurma + t_gecikme (2)
   Burada t_i , akış durdurulduktan sonra başlayan ölçüm zaman kutularıdır, t_durdurma , akış durdurulduğunda hemen ölçüm süresidir ve t_gecikmesi , gecikme süresidir.
2. Adım 8.2'de tanımlanan zaman kutularını ve adım 9.1'de hesaplanan t_işlemini kullanarak q'ya bağımlı yoğunluk I(q)'yi işlem süresinin bir fonksiyonu olarak çizin.
   NOT: Erişilebilir en erken işlem süresi t_gecikmesi ile sınırlıdır. Daha önceki proses zaman noktalarını ölçmek için toplam akış hızını (Q) artırın veya toplam boşluk hacmini (V_boşluğu) azaltın.
3. İşlem süresinin bir fonksiyonu olarak I(q)'daki değişiklikten ilgilenilen kinetik parametreleri ayıklayın.

10. Denemeyi sonlandırın.

1. Yerel enstrüman deklanşörünü kapatarak nötron ışınını kapatın.
2. Herhangi bir parçanın, borunun bağlantısını kesmeden veya numuneleri veya karışık numune kaplarını boşaltmadan önce ışın hattı tarafından sağlanan bir radyasyon monitörünü kullanarak radyasyon kontrolü yapın.
3. Şırıngaları, tüpleri ve karışık numune kabını sağlık fiziği bölümüne aktarın.
4. Sağlık fiziği formlarını doldurun ve sağlık fiziği personeli tarafından değerlendirilmesini bekleyin.

Results

Burada gösterilen temsili nötron verileri, veziküller arasındaki lipit değişimini (k_e) ^66,67 döviz kuru ile katalize eden bir katkı maddesi olan metil-β-siklodekstrin (mβCD) varlığında lipit değişim kinetiğini ölçer. Önceki floresan çalışmaları,_k'nin mβCD konsantrasyonuna bağlı olduğunu ve değişim işleminin yarı ömrünün^{dakika 68} mertebesinde olduğunu göstermiştir. Mevcut deneyler, saniye zaman ölçeğinde veziküller ara...

Discussion

Mevcut prosedür, karıştırma cihazını ve durdurulmuş akışlı TR-SANS ölçümlerini gerçekleştirme adımlarını açıklamaktadır. Cihaz ve protokol, ilgilenilen zaman ölçeklerinin ≈1 s ila 5 dakika olduğu düşük viskoziteli sıvı numuneler için optimize edilmiştir. 5 dakikadan daha uzun zaman ölçekleri için, numunelerin manuel olarak karıştırılması ve standart saçılma hücrelerine yüklenmesi, özellikle yüksek viskoziteli numuneler, jeller veya macunlar için daha kolay ve arzu edilebilir olabilir. 1 sn'den daha düşük zaman ölçeklerin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dinamik karıştırıcı	Analitik Bilimsel Cihazlar	462-0150A	Manyetik olarak bağlanmış rotor, ikili dinamik karıştırıcı tertibatı (üçlü tip mevcuttur), 0.15 mL ölü hacim (daha büyük ölü hacim mevcuttur)
Floropolimer boru	IDEX Sağlık ve Bilim	1507L	PFA Boru Doğal 1/16 inç OD x 0.040 inç ID x 50 ft
Floropolimer 1/4-28 flanşsız bağlantı parçaları	IDEX Sağlık ve Science	XP-245	PFA yüksüklü flanşsız bağlantı parçası, 1/4-28 diş açma, 1/16 inç OD boru
Cam şırıngalar	Hamilton Company	81660	Hamilton 1000 serisi şırıngalar, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4 "-28 diş sonlandırma, diğer hacimler mevcuttur
Yüksek basınçlı akış seçici valfler	Vici Valco	C85X-1570EUTB	Vici 10 konumlu seçici valfler, 15000 psi maks, 0,25 mm delik, 1/16 inç OD boru, 10-32 konik dişli bağlantı noktası, USB üniversal aktüatör
Yüksek basınç şalter valfleri	Vici Valco	C82X-1574EUHB	Vici 4 anahtar vanaları, 15000 psi maks, 0,25 mm delik, 1/16 inç OD boru, 10-32 konik dişli bağlantı noktası, USB üniversal aktüatör
Yüksek basınçlı şırıngalar	Cetoni	A2019000358	3 mL paslanmaz çelik şırınga, maksimum 510 bar, maksimum 21 mL/dk akış hızı Düşük
basınçlı akış seçici valfler	Vici Valco	C25-3180EUHB	Vici 10 konum seçici valfler, maksimum 250 psi sıvı, 0,75 mm iç çap, 1/16 inç OD boru, 1/4-28 dişli bağlantı noktaları, USB üniversal aktüatör
neMESYS yüksek basınçlı şırınga pompaları	Cetoni	A3921000103	Maksimum kuvvet 2600 N
neMESYS orta basınçlı şırınga pompaları	Cetoni	A3921000131	Maksimum kuvvet 1000 N
Güç kaynağı	Cetoni	A3921000127	Base 600, 4 adede kadar yüksek basınç pompası için güç sağlar
Kuvars akışlı numune hücresi	Starna Scientific	3-2.30-Q-1/TC	Kuvars mikro akış hücreleri, 2 mm tabaka derinliği (1 mm mevcuttur), 2 mm x 2 mm x 30 mm iç boyut
Kuvars pencereler	Teknik Cam Ürünleri	NA	GE 124 Şeffaf erimiş kuvars zemin ve cilalı plakalar, 11,75 inç x 23,75 inç x 0,375 inç kalınlığında
Paslanmaz çelik 10-32 konik sıkıştırma bağlantı parçaları	IDEX Health & Bilim	U-321X, U-320X	316 paslanmaz çelik yüksük (U-321X) ve somun (U-320X) -Valco tipi, 10-32 koni, 1/16 inç OD paslanmaz çelik boru için
Paslanmaz çelik boru	IDEX Sağlık & Bilim	U-102	Paslanmaz Çelik Boru 1/16 inç OD x 0.020 inç ID, 10 cm, çeşitli önceden kesilmiş uzunluklar mevcuttur
Şırınga pompası kontrol yazılımı	Cetoni	T6000000004	Nemesys pompaları için QmixElements yazılımı, QmixSDK yazılım geliştirme kiti
Termoelektrik klima	EIC Çözümleri	AAC-140C-4XT-HC	Pompayı, valfi, karıştırıcıyı ve numune sıcaklığını kontrol etmek için yalıtımlı muhafaza üzerine monte edilmiş termoelektrik klima
T-yuvası korkuluk	McMaster-Carr	47065T103	Alüminyum t-oluklu korkuluk (1,5 inç x 1,5 inç) çeşitli uzunluklarda kesilmiş
Buhar kilitli şişe kapakları	Cole-Parmer	EW-12018-02	Dört adet 304 SS bağlantı noktası eki, 1/4 "-28 dişli, GL45 şişe kapağı boyutu, PTFE gövde, SS dişleri, PP yaka