Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

15.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62876

⸱

7 Ekim 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Özet

Fare beyinlerinin immünohistokimyasal lekelenimi, enerji metabolizmasının ve diğer nörobiyolojik süreçlerin düzenlenmesinin altında kalan merkezi mekanizmaları araştırmak için sinirbilimde yaygın olarak kullanılan rutin bir tekniktir. Bununla birlikte, beyin histolojisi sonuçlarının kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği laboratuvarlar arasında değişebilir. Her boyama deneyi için, türler, dokular, hedeflenen proteinler ve reaktiflerin çalışma koşullarındaki farklılıklara göre temel prosedürleri optimize etmek gerekir. Bu makale, bu alandaki araştırmacılar tarafından kolayca takip edilebilen aort içi perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere güvenilir bir iş akışını ayrıntılı olarak göstermektedir.

Ayrıca, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için bu prosedürlerin nasıl değiştirilacağı tartışılmaktadır. Bu protokolün güvenilirliğini ve verimliliğini göstermek için perineuronal ağlar, fare beyninde bir anti-AVP antikoru ile biyotin etiketli Wisteria florbunda agglutinin (WFA) ve arginin vazopressin (AVP) ile boyandı. Son olarak, tüm prosedür için kritik ayrıntılar ve bu protokolün diğer protokollere kıyasla avantajları ele alınmıştır. Birlikte ele alındığında, bu makale fare beyin dokusunun serbest yüzen immünostaining için optimize edilmiş bir protokol sunar. Bu protokolün ardından, hem genç hem de üst düzey bilim adamlarının immünostaining çalışmalarının kalitesini, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmaları için bu süreci kolaylaştırır.

Giriş

Obezite ve buna bağlı komorbiditelerin yaygınlığı salgın boyutlara ulaşmış ve muazzam bir sosyoekonomik yüke neden olmuştur1,2. Obeziteden sorumlu biyolojik süreçleri daha iyi anlamak için çeşitli fare modelleri geliştirilmiştir3,4. Bu hayvan modellerinde enerji homeostazının düzenlenmesi için merkezi mekanizmalar önemli olduğundan, fare beyinlerinin nöroanatomik çalışmaları bu alanda gerekli bir teknik haline gelmiştir. Bununla birlikte, beyin histolojisi tekniklerinin kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, çeşitli nedenlerle (örneğin antikorlar, dokular, tedaviler, türler, araştırma hedefleri) aynı laboratuvardaki laboratuvarlar ve hatta araştırmacılar arasında önemli ölçüde değişmektedir. Bu nedenle, fare beyninin histolojik çalışmaları için perfüzyon, beyin kesiği, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere genel bir protokol oluşturmak gerekir. Bu arada, yeni başlayanlar bu protokolü bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için hızlı bir şekilde öğrenebilir, ustalaşabilir ve ayarlayabilir.

İmmünistokimyasal boyama, çeşitli dokularda (örneğin beyin ve periferik dokular) belirli hücre tiplerini, mRNA'ları ve proteinleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan yerleşik bir yöntemdir 5,6. Daha spesifik olarak, ilgi çekici bir antijen, belirli bir birincil antikor ve bir enzime (örneğin, kromojenik immünhistokimya) veya floresan bir boyaya (floresan izotiyosiyanat) bağlı ikincil bir antikor ile etiketlenebilir 6. Bu tekniklerin faydasına örnek olarak, β-endorfin [pro-opiomelanocortin (POMC) ile kodlanmış bir peptit] ve c-fos (nöronal aktivitenin bir belirteci) arcuate çekirdeğinde lekelendi. Dorsal raphe çekirdeğinde triptofan hidroksilaz 2'nin (serotonin sentezine entegre bir enzim) silinmesinin, arcuate çekirdeğindeki POMC nöronlarında c-fos ekspresyonunun azaldığı gösterilmiştir7. Ek olarak, D vitamini reseptör mRNA'nın dağılımı in situ hibridizasyon (RNAscope)8 ile fare beyninde haritalandı. Bu makale, fare beyninin histolojik çalışmalarının kalitesini ve tekrarlanabilirliğini artırmayı amaçlayan, serbest yüzen immünostaining için adım adım bir iş akışı ile güvenilir ve verimli bir yöntem sunun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada her iki cinsiyette (8-16 haftalık) C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Tüm hayvanların bakımı ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.

1. Perfüzyon

NOT: Adım 1.1 - 1.6 duman kaputunda gerçekleştirilir.

  1. Anestezi
    1. Bir kurutucunun altına yerleştirilmiş bir kağıt havluya 5 mL izofluran ( Bkz. Malzeme Masası) dökün. Fareyi kurutucunun içindeki delikli bariyere sokun ve solunum belirtileri kaybolana kadar bekleyin.
      NOT: Solunum olmadan, fare hala kısa bir süre için kalp atışına sahiptir ve kalp atışı kaybolmadan önce perfüzyona maruz kalacaktır.
    2. Devam etmeden önce, bir parmak sıkışması refleksi olmadığını onaylayın.
    3. Her ayağın içinden bir pim sürerek fareyi bir köpük tahtaya sabitle. Sıvı dökülmesini toplamak için köpük tahtanın bir tepsiye yerleştirildiklarından emin olun.
  2. Kalbi açığa çıkarmak
    1. Toraks ve karın üzerinde orta hat boyunca uzunlamasına yüzeysel bir kesi yapın, ardından toraks ve karın kas duvarını ortaya çıkarmak için cildi bir kenara hareket ettinin. Daha sonra, karaciğeri ve bağırsağı ortaya çıkarmak için kas tabakasında bir kesi yapın. Son olarak, göğüs kafesini makasla keserek toraksı açın ve kalbi ve akciğerleri açığa çıkarın. Çalışma alanını genişletmek için göğüs kafesini kenara çekmek için hemostatik toparlama kullanın.
  3. Terminal kanının toplanması (isteğe bağlı)
    1. Ucu tamamen gömülene kadar kalbin sağ kulakçıklarına 1 mL şırınna ( Bkz. Malzeme Masası) dikkatlice yerleştirin. Şırınnayı sabit tutun ve istenen hacme ulaşılana kadar yavaşça kan çekin.
      NOT: Doğru atriyumdan geçmemeye özen göster; Yetişkin fare başına 300-400 μL kan toplanması elde edilebilir. Kan alma amacına bağlı olarak pıhtı hızlandırıcı veya antikoagülan gibi katkı maddeleri kullanılabilir.
  4. Perfüzyon kanüllerinin yerleştirilmesi
    1. Yeni başlayanlar için, kalbin sol karıncığından makasla küçük bir delik (<1 mm) kesin ve sol ventrikülden yükselen aorta künt bir kanül (genç fareler için 18 G iğne ve yaşlı fareler için 21 G iğne) yerleştirin. Alternatif olarak, deneyimli deneyciler için, sol kalp ventrikülüne doğrudan kör bir kanonülle nüfuz edin ve yükselen aorta dikkatlice yerleştirin.
    2. Perfüzyon sırasında hareketi önlemek için kanül ve bağlı boruların birleşiminin etrafına pimler yerleştirin. Alternatif olarak, hemostatik tokaları kullanarak henulayı yerinde sabitleyebilirsiniz. Kan akışının dolaşımdan çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu kesmeye devam edin.
      NOT: Perfüzyon kanülü ve bağlantılı boru perfüzyon pompasına bağlanır.
  5. Tuzlu su ile perfüzyon
    1. Salin basınç anahtarını açın ve fareyi transkardiyöz olarak 40-60 mL salin (%0,9 NaCl: 25 °C, pH 7,4) ile kullanın. Sağ kulakçıktan çıkışı ve karaciğerin rengini yakından gözlemleyin.
      NOT: Kanı 1-2 dakika içinde yıkamak için otomatik bir perfüzyon pompası ( Bkz. Malzeme Masası) kullanılır. Pompanın basınç aralığı 1-300 mmHg olduğundan, hız buna göre ayarlanabilir. Burundan salin sızıyorsa ve/veya akciğer şişirilmişse, basıncı azaltın ve kanamayı ayarlayın. Çıkış artık kan içermediği zaman, beyin yeterince tuzlu su ile yıkanır. Bu arada, karaciğer kandan yoksundur ve kahverengimsi gri renge dönüşür.
  6. Formalin ile perfüzyon
    1. Salin basınç anahtarını kapatın ve fareyi % 10 nötr tamponlu formalin 40 mL ile boğmak için formalin basınç anahtarını açın (%10 NBF: 25 °C, pH 6.8-7.2, Malzeme Tablosuna bakın). Titreme kanıtı için hayvanın uzuvlarını gözlemleyin.
      NOT: %10 NBF infüzyondan sonra kuyruk hareketi de gözlenebilir. DİkKAT: NBF tehlikeli olduğundan, araştırmacıların prosedür boyunca kişisel koruyucu ekipman (örneğin, uygun solunum cihazı, yüz kalkanı) giymeleri önerilir.
  7. Beyin izolasyonu9
    1. Başı çıkarmak için makas kullanın. Kafatasını ortaya çıkarmak için tümgüme boyunca bir orta çizgi kesiği yapın. Deri ve kas bağlanmasını makasla kesin.
    2. Yörüngesel sırtta bir kesik yapın ve sonra iris makasının keskin ucunun foramen magnum'una yerleştirin. Makası kafatasının iç yüzeyi boyunca ilerletin, beyne zarar vermemek için yukarı doğru basıncı koruyun. Parietal/frontal kemikleri ve menenjitleri dikkatlice çıkarın. Son olarak, beyni açılan kafatasından nazikçe çıkarın.
  8. Sabitleme sonrası
    1. Beyni 4 °C'de gece fiksasyonu için 10 mL 5 NBF ve% 15 sakkaroz ile dolu 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
      NOT: %5 NBF ve %15 sakkarozun 10 mL'sini hazırlamak için% 10 NBF'nin 5 mL'sini ve % 30 sakkarozun 5 mL'sini birleştirin (w/v, fosfat tamponlu saline (PBS) çözünmüş), Malzeme Tablosuna bakın. Sabitleyici arabelleğin hacminin numunenin kendisinden en az 10 kat daha büyük olduğundan emin olun. Başlangıçta, beyin tamponda yüzecek ve gece sabitlemeden sonra dibe batacaktır.
  9. Dehidratasyon
    1. Beyin örneğini batana kadar 4 °C'de dehidrasyon için %30 sakkarozun 10 mL'si ile dolu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.

2. Kriyoseksiyon (koronal bölümler)

  1. Hazırlık
    1. Kayan bir mikrotomun yükseklik ayarlama plakasının üzerine kuru buz yerleştirin ve beyaz don görünene kadar bekleyin. Sakkaroz çözeltisi tamamen dondurulduktan sonra sağlam bir tabanın tabakasını oluşturmak için plakanın üzerine 5 mL% 30 sakkaroz dikkatlice yayın. Tüm beyin örneklerini (bir partide 5 beyin örneğine kadar) sakkarozun üstündeki bir çizgiye yatay olarak yerleştirin ve ardından her beynin dibine% 30 sakkarozun 0,5 mL'sini ekleyin.
      NOT: Beyin hemen donmuş sakkaroz tabanına yapışır ve yavaş yavaş aşağıdan yukarıya donar. Kesmek için daha sağlam bir taban oluşturmak için beynin monte edilmiş kısmının etrafına ek sakkaroz yerleştirin.
  2. Bölümleme
    1. 5-10 dakikalık donmadan sonra, beyin sert ve beyaz hale geldiğinde, istenen katmana / bölgeye ulaşılana kadar beyni kırpın.
      NOT: Sıcaklığı kontrol etmek için plakadaki kuru buz miktarını ayarlayın. Beynin yüzeyinde buz kristalleri göründüğünde sıcaklık çok düşüktür. Beyin yumuşadığında ve artık beyaz olmadığında sıcaklık çok yüksektir.
    2. Kırpma modundan Besleme moduna ve bölüm beyin dokusundan 25 μm kalınlıklara geçin. 1x PBS ile dolu 48 kuyulu bir plaka hazırlayın ve bir fare beyni için beş kuyu işaretleyin. Her bölümü bir fareden toplamak ve bir kuyuya yerleştirmek için bir boya fırçası kullanın. Aynı farenin sonraki bölümünü toplayın ve 2.
    3. 5. kuyuya ulaşılana kadar 2.2.2'yi tekrarlayın, bölümleri 1.-5. Aynı prosedürü beynin geri kalanı için aynı anda tekrarlayın. Bir fareden tüm bölümler anatomik sırayla 5 kuyuya toplanana kadar tekrarlayın.
      NOT: Bu işlemi takiben, her fareden beyin bölümleri, 5 farklı histolojik çalışma için kullanılabilecek 5 seriye aliquoted edilir.
  3. Depolama
    1. Bölümleri her kuyudan kriyoprotektan tampon (%20 gliserol, %30 etilen glikol ve %50 PBS) dolu 1,5 mL mikrotüpe aktarmak için bir boya fırçası kullanın ve numuneleri -20 °C'de saklayın.
      NOT: Küçük tüplerde (1,5 mL) depolanan bu bölümler dondurucuda fiziksel alandan tasarruf edebilir ve bölümlerin bütünlüğü birkaç ay boyunca korunabilir.

3. Serbest yüzen WFA boyama ve anti-AVP immünostaining

  1. PBS ile dolu 6 kuyulu bir hücre kültür plakasının kuyusuna bir hücre süzgeci yerleştirin ve bir dizi beyin bölümünü hücre süzgecine aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Hücre süzgecini PBS ile dolu başka bir kuyuya aktararak PBS'deki bölümleri durulayın. Kriyoprotektan tamponda depolanan bölümler için bir çalkalayıcı üzerinde 6 x 10 dakika ve taze kesilmiş bölümler için 3 x 10 dakika durulayın.
    NOT: Tüm yıkama işlemleri, her kuyunun içinde bir hücre süzgeci bulunan 6 kuyulu bir hücre kültürü plakasında gerçekleştirilir ( Bkz. Malzeme Tablosu). Her süzgeç, her farenin ilgi alanlarını tutar. Reaktifleri kurtarmak için, aşağıda açıklanan tüm inkübasyon prosedürleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde gerçekleştirilir. Yıkama ve kuluçka prosedürleri arasında, beyin bölümlerini her hücre süzgeci ve her tüp arasında aktarmak için bir boya fırçası kullanın. PBS ile yıkamak için her kuyu için 12 mL yeterlidir.
  2. PBT'de 1 mL biyotin etiketli WFA (1:1.000) çözeltisi (1.5 mL PBS'de çözünmüş 2,5 mL Triton X-100) tamponu 1,5 mL tüpte hazırlayın. Beyin bölümlerini hücre süzgecinden tüpe aktarın ve bir gecede ~50 rpm sallanan bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
  3. Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika boyunca durulayın.
  4. PBT'de 1,5 mL'lik bir tüpte 1 mL streptavidin-Dylight 488 (1:500) çözeltisi hazırlayın. Beyin bölümlerini tüpe aktarın ve ~50 rpm'de sallanan bir platformda 2 saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Bu adımdan itibaren ışığa maruz kalmamak için plakayı folyo ile örtün.
  5. Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika durulayın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke tamponunda beyin bölümlerini (%3 normal eşek serumu PBT ile seyreltilmiş) kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bloke serum seçimi, ikincil antikorun üretildiği türler tarafından belirlenir. örneğin, ikincil antikor keçiden geliyorsa, normal keçi serumu kullanılmalıdır.
  6. Birincil antikordaki beyin bölümlerini (tavşan anti-AVP, 1:500) bir gecede ~50 rpm'de sallanan bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    NOT: Blokaj tamponunda hem birincil hem de ikincil antikorları hazırlayın. Pilot çalışmalarda inkübasyon konsantrasyonu, kuluçka süresi ve inkübasyon sıcaklığı optimize edilmelidir.
  7. Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika durulayın. İkincil antikordaki beyin bölümlerini (Alexa Flour 594 eşek anti-tavşan IgG (H+L), 1:500) oda sıcaklığında ~50 rpm'de sallanan bir platformda 2 saat kuluçkaya yaslayın. Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika durulayın.

4. Montaj

  1. her biri 1x PBS'den oluşan 100 mL ile iki Petri kabı (150 mm çapında) doldurun. Tüm beyin bölümlerini bir süzgeçten ilk yemeğe aktarın ve beyin bölümlerini nöroanatomik sırayla kaudalden rostral'a hizalayın.
    NOT: Farklı hayvanlardan bölümlerin karıştırılmasını önlemek için, aynı anda bir hayvandan bir dizi beyin bölümü monte edin.
  2. Tüm beyin bölümleri ilk tabakta hizalandıktan sonra, bir slaytı ikinci tabağa bir ucu bir standla hafifçe eğik olarak batırın (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2). Hava tamponu arayüzünün hemen altındaki bir beyin bölümünü eğik kaydırağa hafifçe yerleştirmek için ince bir boya fırçası kullanın. Aynı işlemi başka bir beyin bölümü ile tekrarlayın ve ilk bölümle yan yana monte edin.
  3. Her iki beyin bölümü de hava tamponu arayüzünün tamamen üzerinde olana kadar seviyesini düşürmek için tamponu yavaşça ve nazikçe çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın.
    NOT: Tampon yüzeyin bozulmasını en aza indirmeye özen edin, aksi veya beyin bölümleri yüzebilir. Kuru olduğunda, bu beyin bölümleri sırası slayda sıkıca yapışır. Gerekirse, bölümler hala ıslakken dokuda kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olmak için slayttaki bölümleri hafifçe ayarlayın.
  4. Slaydın altına ulaşılana kadar bu işlemi yineleyin. Tüm bölümler slaytlara takılana kadar yinelemeye devam edin.

5. Kapak kaplaması

  1. Tüm bölümler kuruduktan sonra (oda sıcaklığında 1-24 saat), slayta DAPI ile 80-100 μL solmaya karşı montaj ortamı yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve numuneleri örtmek için hafifçe bir cam kapakçık uygulayın.
    NOT: Kabarcıkları önlemek için cam kapak kapağını dikkatli ve yavaş bir şekilde uygulayın.
  2. Slaytları bir mikroskop slayt kutusuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: Floresan solmasını ve otofluoresans gelişimini önlemek için tüm bölümleri 1-3 gün içinde görüntüleyin.

6. Görüntüleme

  1. Tarayıcıyı ve bilgisayarı açın (bkz. Malzeme Tablosu). Slaytları yükleme cihazıyla slayt tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu tarayıcıya yerleştirin.
    NOT: Tarayıcı, aynı anda birden fazla kanalın (örneğin, 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), yeşil ve kırmızı kanallar) taranmasını sağlar. Tarayıcı slaytları yalnızca 20x büyütme ile tarar ve daha yüksek bir büyütmeye (örneğin, 40x) ihtiyaç duyulduğunda geleneksel bir floresan mikroskop (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılabilir.
  2. Tarayıcının yazılımını açın ( Bkz. Malzeme Tablosu). Uygun depolama konumunu ve tarama profilini seçin.
  3. Önizleme Taramasını Başlat düğmesine tıklayarak önizleme taramasını başlatın . Önizleme taramasından sonra doku algılama sihirbazını açın ve görüntüleme için ilgi çekici bölgeleri daire içine alıp daire içine alıp verin.
  4. Görüntüleme bölgelerini seçtikten sonra Taramayı Başlat düğmesine tıklayın. Makinenin taramayı bitirmesini bekleyin. Sonuç dosyasını denetleyin ve görüntüleri dışa aktarın.
    NOT: Profil slayt için uygun değilse, profili dokulara uyarlamak için pozlama süresini veya ışık gücünü yeniden odaklayarak ve değiştirerek ayarlayın. Daha fazla teknik ayrıntı için tarayıcının yönergelerine bakın (Malzeme Tablosu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralının akış şeması Şekil 1'de kısaca gösterilmiştir. Bu laboratuvarın kriyoseksiyon prosedürü, 5 beyin örneğinin aynı anda bölümlerek alındığı Şekil 2A'da gösterilmiştir. Beyin bölümlerinin montajı Şekil 2B'de gösterilmiştir ve beyin bölümleri ile tamamen monte edilmiş bir slayt Şekil 2C'de gösterilmiştir. Şekil 3'te Bregma-0.82 mm'de WFA ve AVP'nin daha düşü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, fare beyninin perfüzyon, doku kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere nöroanatomik çalışmaları için yerleşik bir yöntem sağlar. Ancak, tutarlı ve güvenilir sonuçlar için gerekli olan birkaç temel ayrıntı optimize edilmelidir.

Perfüzyon kalitesi başarılı boyama için kritik öneme sahiptir. Kan hücrelerinin (örneğin, kırmızı kan hücreleri) yapay bir 'pozitif' boyama üretebileceği göz önüne alındığında, beyinde kan kalırsa boyama sonuçları <...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Araştırmacılar NIH'den (K01DK119471'den CW'ye; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 ve R01DK120858'den YX'e), USDA/CRIS (51000-064-01S'den YX'e) ve Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (#829565) LT'ye.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Flour 594 eşek anti-tavşan IgG (H + L)InvitrogenA21207
  % 30 SükrozVWR47030230 g Sükroz 100 mL PBS'ye ayrıştırılır
. Nötr Tamponlu FormalinVWR16004-128%10, 25 & derece; C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q ŞırıngaBD309597
48 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıCorning3548
6 Kuyulu Hücre Kültürü PlakasıCorning3516
Vektör Laboratuvarlarıile solma önleyici montaj ortamıH-1200
Otoklavlanabilir plastik kurutucuThermo Scientific Nalgene5315-0150
AVP antikoruPhoenix PharmaceuticalsH-065-07
Hücre SüzgeciCorning431752
Kriyoprotektan tamponuKullanıcı tercihiUygulanamaz%20 gliserol, %30 etilen glikol ve %50 PBS
İzofluranCovetrus11695-6777-2
Leica DFC310FX mikroskobuLeicaUygulanamaz
Mikroskop Slayt Kutuları (50 yerli)VWRUygulanamaz
PBTKullanıcı tercihiUygulanamaz1000 mL PBS Perfüzyon içinde çözülmüş 2,5 mL Triton X-100
iki otomatik Perfüzyon SistemiLeica39471005
Fosfat tamponlu salin (PBS) 20xVWRVWRVE703-1L25 & derece; C, pH 7.3-7.5, 1x bileşim: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Fosfat tamponu
Kayar Mikrotom Mikrom HM450ThermoFisherMicrom HM450
Sodyum KlorürRICCA Chemical7220-32%0.9, 25 derece; C, pH 7.4
Streptavidin Proteini, DyLight 488ThermoFisher# 21832
Triton X-100Sigma-Aldrich089k01921
WFA antikoruSigma-AldrichL1516
Zeiss Axio Z1 TarayıcıZeissUygulanamaz
Zen 3.1 yazılımıtarayıcı yazılımı
DAPI

Kaynaklar

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare Beyni Boyamamm nohistokimyasal BoyamaBeyin Kesit Almantra Aortik Perf zyonDoku MontajFloresan G r nt lemePerin ronal A larWisteria Floribunda AgglutininArginin Vazopressin
Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.