Method Article

Ek Oksijenin Kistik Fibrozis Hava Yolu Mikrobiyomu Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Modelin Tasarımı ve Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/62888

⸱

August 3rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı hiperoksinin kistik fibrozis hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi için bir model sistemi geliştirmektir. Yapay balgam ortamı balgam bileşimine öykünür ve hiperoksik kültür koşulları ek oksijenin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkilerini modeller.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hava yolu mikrobiyal topluluklarının kistik fibrozis (CF) ve diğer kronik pulmoner hastalıkların ilerlemesinde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Mikroplar geleneksel olarak oksijen kullanma veya tolere etme yeteneklerine göre sınıflandırılmıştır. Ek oksijen kistik fibrozis (pwCF) olan kişilere uygulanan yaygın bir tıbbi tedavidir; bununla birlikte, oksijen ve hava yolu mikrobiyomu üzerinde yapılan mevcut çalışmalar, hiperoksi (yüksek oksijen) yerine hipoksinin (düşük oksijen) ağırlıklı olarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik akciğer mikrobiyal topluluklarını nasıl etkilediğine odaklanmıştır. Bu kritik bilgi açığını gidermek için, bu protokol pwCF'den balgam bileşimini taklit eden yapay bir balgam ortamı kullanılarak geliştirilmiştir. Şeffaf bir ortam sağlayan filtre sterilizasyonunun kullanımı, optik yöntemlerin süspansiyon kültürlerinde tek hücreli mikropların büyümesini takip etmesini sağlar. Hiperoksik koşullar yaratmak için, bu model sistemi hiperoksik koşulları incelemek için yerleşik anaerobik kültleme tekniklerinden yararlanır; oksijeni çıkarmak yerine, serum şişelerinin sıkıştırılmış oksijen ve hava karışımı ile günlük olarak parçalanarak kültürlere oksijen eklenir. 50 pwCF'den balgam, bu modelin diferansiyel oksijen koşullarını koruma yeteneğini doğrulamak için 72-h süre boyunca günlük sparging geçirdi. Kistik fibrozis balgamında yaygın olarak bulunan kommensal ve patojenik mikropların büyümesini desteklemek için bu ortamın yeteneğini doğrulamak için 11 pwCF'den kültürlü ve kültürsüz balgam örneklerine av tüfeği metagenomik dizilemesi yapıldı. Bu yapay balgam ortamının yaygın kistik fibrozis patojenlerinin büyümesini destekleme yeteneğini doğrulamak için pwCF'den elde edilen 112 izolattan büyüme eğrileri elde edildi. Bu modelin CF balgamında çok çeşitli patojenleri ve kommensalları kültüre edebildiğini, normoksik koşullar altında kültürsüz balgama çok benzeyen bir topluluğu kurtardığını ve değişen oksijen koşullarında farklı kültür fenotipleri oluşturduğunu görüyoruz. Bu yeni yaklaşım, pwCF'de oksijen kullanımının hava yolu mikrobiyal toplulukları ve yaygın solunum yolu patojenleri üzerinde neden olduğu beklenmedik etkilerin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kistik fibrozis (CF), akciğerlerden kalın mukusu temizleyememe ile karakterize genetik bir hastalıktır ve sıklıkla akciğer nakli veya ölüm ihtiyacı ile sonuçlanan tekrarlayan enfeksiyonlara ve ilerleyici akciğer fonksiyon düşüşüne yol açar. Kistik fibrozis (pwCF) olan kişilerin hava yolu mikrobiyomu hastalık aktivitesini izler1, olumsuz uzun vadeli sonuçlarla ilişkili mikrobiyal çeşitlilikte bir azalmaile 2,3. PwCF'nin klinik çalışmalarında, ek oksijen tedavisi daha ileri hastalık4,5ile ilişkilendirilmiştir , geleneksel olarak, oksijen tedavisinin kullanımı sadece hastalık şiddeti için bir belirteç olarak açılmıştır6. Solunum yetmezliği olan hastaların klinik çalışmalarından elde edilen son çalışmalar, daha yüksek hasta oksijen seviyelerinin paradoksal olarak ciddi bakteriyel enfeksiyonlardaki artış ve daha yüksek mortalite7ile ilişkili olduğunu göstermiştir Ek oksijenin hastalık patogenezine katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Ek oksijenin kistik fibrozis akciğer mikrobiyomu ve ilişkili akciğer ve hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi iyi incelenmemiştir.

Mekanistik çalışmalar genellikle lojistik zorluklar ve bilinmeyen tıbbi fayda veya zarar müdahaleleriyle ilişkili potansiyel etik sorunlar nedeniyle doğrudan insan denekler üzerinde yapılamamaktadır. İnsan biyospepsimenlerini model sistemlerine entegre eden çeviri yaklaşımları bu durumlarda önemli biyolojik içgörüler sunabilir. Oksijen kullanma veya tolere etme yeteneği geleneksel olarak mikrobiyal sınıflandırmanın önemli bir bileşeni olsa da, ek oksijenin çevreye terapötik olarak tanıtılmasının hava yolu mikrobiyal topluluklarını nasıl bozabileceği hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek oksijenin pwCF'nin hava yolu mikrobiyomları üzerindeki bilinmeyen etkilerine ışık tutmak için iki büyük zorluğu ele almamız gerekiyordu; birincisi, fizyolojik olarak CF balgamının bileşimine yakın bir kültür ortamının oluşturulması; ikinci olarak, kültürdeki yüksek oksijen konsantrasyonlarının uzun süreler boyunca korunmasına izin veren bir model sisteminin oluşturulması.

Yapay balgam ortamı (ASM), akciğer balgam ex vivo8 , 9,10' u taklit etmek için yaygın olarak kullanılır, ancak belirli bir tarif üzerinde net bir fikir birliği yoktur. Bu protokol, pwCF'den fizyolojik olarak balgam hakkında dikkatlice tasarlanmış yapay bir balgam ortamı tarifi ve hazırlama stratejisini açıklar. Tablo 1, yayınlanan literatüre göre seçilen tarif değerlerini özetlemektedir. Temel kimyasal bileşenler ve pH, insan CF balgam11 , 12,13çalışmaları ile tanımlanan değerlerle eşleştirildi. Düşük konsantrasyonda fizyolojik besinler, son hacim10'un%0.25'i olarak dahil edilen yumurta sarısı kullanılarak eklenmiştir vitamin ve eser metal karışımları14,15. Balgam16'nınanahtar bileşeni olan Mucin, %1 w/v14'te dahil edildi. Daha emek yoğun olmasına rağmen, temel ortam bileşenlerinin ısı kaynaklı denatürasyonundan kaynaklanan potansiyel sorunları azaltmak için daha geleneksel ısı sterilizasyonu uygulaması yerine filtre sterilizasyonu seçilmiştir10. Filtre sterilizasyonunun ek bir yararı, şeffaf ortamlar üretmesidir (ısı sterilizasyonu, tuzların ve proteinlerin yağması ve pıhtılaşması nedeniyle bulanık ortam oluşturabilir), bu yapay balgam ortamlarının bulanıklıktaki artışlara dayalı mikrobiyal büyümeyi takip etmek için kullanılmasına izin verir.

Hiperoksik kültür için bu model sistemi, pwCF için ek oksijen kullanımının etkisi için bir model oluşturarak oksijenin çıkarılması yerine eklendiği anaerobik kültleme tekniklerine dayanmaktadır. Şekil 1 ve ilgili oksijen sparging protokolü, genel laboratuvar ve hastane tedarikçilerinden düşük maliyetle elde edilebilen bir oksijen sıçrama sisteminin bileşenlerini özetlemektedir. Bu sistem basınçlı oksijen ve havanın %21-%100 oksijen arasında değişen sabit konsantrasyonlara karıştırılmasını sağlar. Bir oksijen sensörünün entegrasyonu, çıkış gazı karışımının konsantrasyonunun doğrulanmasının yanı sıra, oksijen koşullarının istenen aralıkta korunduğunu doğrulamak için daha önce sıçramış serum şişelerinin çıkış gazı bileşimini kontrol etmeyi sağlar.

Bu protokol, yapay bir balgam ortamı oluşturma prosedürlerini, bir oksijen sıçrama sisteminin inşasını ve kullanımını ve her ikisinin de diferansiyel oksijen koşulları altında kültür CF balgamının uygulanmasını özetlemektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ortaklar Kurumsal İnceleme Kurulu'ndan onay almıştır (Protokol # 2018P002934). İnklüzyon kriteri, çalışma için yazılı bilgilendirilmiş onay sağlayan kistik fibrozisli yetişkin hastaları içeriyordu. Dışlama kriteri yoktu. Protokol yönergelerine göre, tüm balgam örnekleri klinik sağlayıcıları ile planlanan bir ayaktan ziyaret sırasında kistik fibrozisli hastalardan toplanmıştır.

1. Yapay Balgam Orta Hazırlık

NOT: Burada listelenen miktarlar 1 L nihai yapay balgam ortamının üretimi içindir ve Malzeme Tablosundalistelenen belirli reaktifleri varsayar. Sayılar, aynı nihai ürünü sağlamak için diğer hacimler veya farklı reaktiflerin kullanımı için ayarlanmalıdır. Hedef konsantrasyonlar için Tablo 1'e bakın.

  1. Yapay balgam kimyasal karışımı (ASCM)
    NOT: ASCM son orta hacmin %25'ini oluşturur. Rafa sabittir ve toplu olarak veya önceden hazırlanabilir. Daha sonra kullanılmak üzere hazırlanıyorsa, kimyasal karışımı otoklavlayın ve oda sıcaklığında güvenle saklayın.
    1. Kurucu kimyasal stok çözeltilerini karıştırın.
      1. 1 M NaCl stoğu hazırlayın: Litre steril su başına 58,44 g NaCl ekleyin.
      2. 1 M KCl stoğu hazırlayın: Steril suyun litresi başına 74,55 g KCl ekleyin.
      3. 1 M MgSO4 stok hazırlayın: Steril su litresi başına 246,47 g MgSO4·7H 2O veya steril su litresi başına 120,37 g susuz MgSO4 ekleyin.
      4. 1 M glikoz stoğu hazırlayın: Steril suyun litresi başına 180,16 g glikoz ekleyin.
    2. Otoklav, kimyasal stok çözeltilerini ve boş bir 250 mL şişeyi sterilize eder. 30 dakika boyunca en az 121 °C ve 15 PSI standart değerlere otomatik engelleme adımlarını gerçekleştirin.
    3. Boş 250 mL şişeye 80,59 mL steril su ekleyin.
    4. Karışıma 152,30 mL 1 M NaCl stoğu ekleyin.
    5. Karışıma 15,8 mL 1 M KCl stok ekleyin.
    6. Karışıma 610 μL 1 M MgSO4 stok ekleyin.
    7. Karışıma 700 μL 1 M glikoz stoğu ekleyin.
  2. Yapay balgam mucin karışımı (ASMM)
    NOT: ASMM, son orta hacmin %50'sini oluşturur. Son orta parti ile aynı gün hazırlandığından emin olun.
    1. Boş bir 1 L şişeye 450 mL steril su ekleyin.
    2. Şişeye 50 mL 10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ekleyin.
    3. Şişeye tek kullanımlık bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin.
    4. PBS ve karıştırma çubuğunu içeren şişeyi otoklavlayın.
    5. 10 g mucin toz ölçün ve PBS'ye ekleyin.
    6. Ön karıştırma için şişeyi kuvvetlice çalkalayın.
    7. Şişeyi manyetik karıştırıcı ile sıcak bir tabağa yerleştirin. Isıyı orta-yüksek hedefleme 50 °C'ye ve karıştırma hızını 1100 rpm'ye ayarlayın. Çubuğun mıknatıstan uçmaması için hızı kademeli olarak artırın.
      1. 15 dakika boyunca ısıtmaya ve karıştırmaya bırakın.
      2. Şişeyi ısıya dayanıklı eldivenlerle alın. Mucin tozunun çözeltinin dışına yerleşip yerleşmey olduğunu kontrol etmek için gözlemleyin.
      3. Mucin tozu tam olarak çözülmemişse, şişeyi tamamen çözünene kadar 5 dakikalık aralıklarla ısıya / karıştırıcıya geri döndürün.
    8. Mücin karışımının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  3. Yapay balgam biyolojik karışımı (ASBM)
    NOT: ASBM son orta hacmin %25'idir. Son orta parti ile aynı gün hazırlayın ve diğer karışımların aksine, bileşenlerini herhangi bir ısıya maruz bırakmayın.
    1. 100x vitamin stoğunu 4 °C'lik bir buzdolabında veya buzda çözün.
      NOT: Donma/çözülme döngülerinin sayısını en aza indirmek için vitamin stoğunu 10 mL aliquots içine ön porsiyon.
    2. Boş otoklavlı 250 mL şişeye 124,24 mL steril su ekleyin.
    3. Karışıma 25,76 mL 50x esansiyel amino asit stoğu ekleyin.
    4. Karışıma 80,14 mL 100x esansiyel olmayan amino asit stoğu ekleyin.
    5. Karışıma 10 mL (çözülmüş) 100x vitamin stoğu ekleyin.
    6. Karışıma 1 mL 1000x iz metal stoğu ekleyin.
    7. Karışıma 8.33 mL% 30 yumurta sarısı emülsiyon ekleyin.
    8. Karışıma 400 μL 10 g/L ferritin stoğu ekleyin.
    9. Çözeltiyi manuel sallama ile iyice karıştırın.
  4. Yapay balgam ortamı (ASM)
    1. ASMM içeren 1 L şişeye 250 mL ASCM ekleyin.
    2. Orta şişeye 250 mL ASBM ekleyin.
    3. Ortamı, dar aralıklı pH kağıdında 6,3 pH'a ulaşmak için temel MOPS tamponu (1 M) ile titratın. Titrasyondan önce, orta karışım çok asidik olacaktır.
    4. Elde ettiği suni balgam ortamını filtrasyona hazır olana kadar 4 °C'de soğutun.
    5. Filtrasyon işlemini başlatmak için, 200 mL filtresiz suni balgam ortamını 0,22 μm gözenek boyutu filtresine sahip bir vakum filtrasyon sistemine aktarın.
    6. Filtrasyon sistemini vakum pompasına bağlayın, vakum pompasını açın, 70 mbar'a ayarlayın ve ardından odayı 4 °C'de soğuk bir odada 90 rpm'de sallanan bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin.
      1. Kayda değer bir miktar filtrelendikçe ortamın ek 150 mL'si ile üst üste yerleştirin. 1 L ortamın tamamen filtrelenerek 1-2 gün sürer.
      2. Tüm ortam filtrelenene kadar ek bölmelerle tekrarlayın.
        NOT: Mucin filtreyi zamanla takacağından, ortamın 350 mL'den fazlasını aynı 0,22 μm filtreden filtrelememeye çalışın.
    7. Filtrelenmiş yapay balgam ortamını kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de soğutun. En iyi sonuçlar için hazırlık aşamasından sonraki bir ay içinde ASM'i kullanın.

2. Oksijen Sıçraması

  1. Spagep istasyonu kurulumu
    NOT: Bu protokolün yalnızca bir kez tam olarak yapılması gerekir, bu noktadan sonra kurulum gerektiğinde basit bakım yoluyla sürdürülebilir. Oksijen sıçrama sisteminin görsel şeması için Şekil 1'e bakın.
    1. Basınçlı hava ve oksijen tanklarını elde edin ve uygun şekilde sabitleyin.
      DİkKAT: Yüksek basınç, yanlış işlendiğinde tankları son derece tehlikeli hale getirir. Tankların tamamen kapalı ve emniyetli olduğundan, tank kapatıldığında sızıntı olmadığından ve tüm taşıma personelinin kullanımlarında tam olarak eğitildiğinden emin olun.
    2. Basınçlı hava tankına bir İngiliz anahtarı ile bir hava regülatörü takın. Regülatörde optimum akış okuması için regülatörü mümkün olduğunca dik bir konuma takın.
    3. Sıkıştırılmış oksijen tankına bir oksijen regülatörü takın, dik konuma mümkün olduğunca yakın takın. Oksijen tankına bağlı olarak, sıkılaşmak için yönü tersine çevirmemiz gerekebilir.
    4. İki tanktan gelen gaz akışını birleştirmek için boruyu regülatörlerden bir Y konektörüne bağlayın.
    5. Y konnektörünün çıkışını merkezi T bağlantı valfine bağlayın.
    6. Merkezi T-junction vanasının bir tarafını bir gaz basınç göstergesine bağlayın.
    7. Gaz basıncı göstergesinin diğer tarafını 0,22 μm gözenek boyutuna sahip 25 mm çapında steril şırınna filtresine bağlayın.
    8. Spagepleme sırasında gaz salınımı olarak kullanılacak pistonsuz bir şırındıya ikinci bir 25 mm çapında şırıng filtresi takın.
    9. Merkezi T bağlantı vanasının son tarafını oksijen monitörü için ikinci bir T-bağlantı valfine bağlayın.
    10. 25 mm çapında bir şırınga filtresini bu ikinci T-bağlantı valfinin bir tarafına bağlayın ve 18 G iğne takmak için boru takın.
    11. İkinci T-junction vanasının son tarafını oksijen izleme cihazına bağlayın.
    12. İzleme sırasında gaz salınımı olarak kullanılacak oksijen izleme cihazının diğer tarafına bir kesme tüpü bağlayın.
      DİkKAT: Oksijen sıçrama sistemini test ederken/kullanırken, T bağlantılarının konumunu dikkatlice not alın ve sistem boyunca hedeflenen yola eşleştiğinden emin olun. Bunun yapılmaması, sistem içinde basınç birikmesine neden olur ve bileşenlerin başarısız olmasına ve parçalanmasına neden olur.
    13. Sistemin bakımı ve optimum performansta çalışmasını sağlamak için aşağıdaki uygulamalar faydalıdır.
      1. Sızdırmazlıklarını büyük ölçüde iyileştirmek ve bileşenlerin iç basınçtan ayrılma olasılığını azaltmak için liberal miktarlarda Teflon bantla bağlantıları güçlendirin.
      2. Maksimum basıncı azaltmak ve arızaları önlemek için birleşik akış hızını 10 L/dk'nın altında tutun.
      3. Bir sızıntıdan şüphelenilirse, herhangi bir gaz sızıntısının üzerinde kabaracağından, konumunu kolayca tanımlamak için ticari olarak mevcut sıvı sızıntı dedektörleri gibi bir deterjan çözeltisi kullanın. Polytetrafloroetilen bant (örneğin, Teflon) kullanılarak yama sızıntıları.
      4. Oksijen sıçrama sistemindeki 25 mm çapındaki şırıng filtrelerini iki haftada bir değiştirin, ancak bu kullanım sıklığına göre değişir. Zamanla, filtreye takılan parçacıklar gaz akış hızını azaltır ve basınç birikmesine neden olur.
      5. Ölçümleri yapmadan önce oksijen monitörünü %21 oksijen basınçlı havaya kalibre edin.
      6. Sistem kullanımının tamamlanmasından sonra, tankları kapatın ve akış tamamen durana kadar regülatörlerden fazla gazın kanını akıtın.
  2. Serum şişe kültürü sparging
    1. Örnek tanımlayıcıları, aşılama tarihi/saati ve hedef oksijen yüzdesi ile 500 mL otoklavlı serum şişelerini etiketle.
    2. Biyolojik bir kaputta, kurulan her serum şişesine 24 mL yapay balgam ortamı ekleyin.
    3. Her serum şişesine 18-G iğne ile homojenize edilmiş 1 mL hasta balgamı ekleyin (her kültür durumu için yeterli miktarda örnek elde etmek için gerekirse steril salin ile seyreltilir).
    4. Steril cımbız kullanarak, otomatik kapatılmış kauçuk durdurucuları her serum şişesinin üstüne yerleştirin.
    5. Lastik stoperlere bastırın, stoperin altına ellerle dokunmamaya dikkat edin.
    6. Şişeleri kaputtan çıkarın, alüminyum contaları uygulayın ve kıvrın. Orta parçayı contalardan çıkarın.
    7. Şişelerin üst kısmını alkol silme ile silin ve Bir Bunsen brülörü alevinden geçirin.
    8. Filtreli pistonsuz bir şırıngaya steril 18-G iğne yapıştırın. Bu gaz salınımını önce şişeye yerleştirin.
    9. Sistemden gaz çıkışına steril bir 18-G iğne yapıştırın ve gaz çıkış iğnesini de şişeye yerleştirin.
    10. Tanklardaki T bağlantılarını oksijen monitöründen geçirin. Hedef oksijen konsantrasyonun sistemden aktığını doğrulayın. Hedef yaklaşık 5 L/dk gaz akışı.
    11. T bağlantılarını tanklardan gaz çıkışına yönlendirin. Gaz serum şişesinin içinden akmaya başlar.
      DİkKAT: Oksijen sıçraması sırasında basınç göstergesine çok dikkat edin. Basınç beklenmedik şekilde artarsa, sistemi hemen kapatın.
    12. Serum şişesinin içinden 1 dakika boyunca oksijen sparge çalıştırın. 5 L/dk'da bu, 10 hava değişimine izin verir ve iç atmosferin istenen kısmi basınca ulaşmasını sağlar.
    13. Gaz salınımını 18-G iğnesi çıkarın.
    14. Serum şişeslerindeki basıncın +1 atmosfere (deniz seviyesinde 2 atmosfer) inşa etmesine izin verin ve ardından gaz çıkış iğnesini hemen çıkarın.
      NOT: Basınç, hiperoksik koşulların zaman içinde tutulmasına yardımcı olur.
    15. Serum şişesini 150 RPM'de 37 °C inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin. Örnekleri üç 24 saat aralıklarla kuluçkaya yatır. Her 24 saat aralıkta, aşağı akış analizi için bir aliquot alın, örnekleri yeniden sparge edin ve toplam 72 saat kuluçka süresi için inkübasyona geri döndürün.
  3. Çıkış oksijen ölçümü
    1. Oksijen ölçeri %21 basınçlı havaya kalibre edin ve ardından tankı kapatın.
    2. Serum şişesi alımını oksijen monitöründen geçirin ve sonuna steril bir iğne yapıştırın.
    3. İğneyi lastik durdurucudan serum şişesine yerleştirin.
    4. Çıkış okumasının dengelenmesi için bekleyin. Serum şişelerinden düşük bir akış hızı, bunun 2 dakika kadar sürebileceği anlamına gelir. Oda havasından en yüksek farkı bildirin (%21'den en uzak sayı).
    5. Birden fazla okuma yapıyorsanız, sistemi okumalar arasında basınçlı hava ile yıkayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoller, Boston, Massachusetts'teki Massachusetts General Hospital'daki bir ayakta kistik fibrozis kliniğine rutin bakım için başvuran pwCF'den 50 balgam söktürücü numuneye uygulandı. Her hastanın balgamı yapay balgam ortamı kullanılarak !, P ve 0 oksijen koşullarının altında kültürlendi ve her kültürden 24 saat, 48 saat ve 72 saat kültür süresi ile 0,5 mL aliquot alındı. Görsel değişiklikleri izlemek için ekstraksiyonlar yapıldığında kültürler fotoğraflandı. Ek olarak, kültlemeden önce her birincil balgam örneğin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada hiperoksinin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisini incelemek için bir in vitro model geliştirilmiştir. Serum şişelerinin yapay balgam ortamına ve günlük spargingine dayanan bu model, yüksek oksijen konsantrasyonlarını korur ve pwCF'den balgamda tanımlanan mikropların büyümesini destekler.

Bu yaklaşımın birkaç kritik adımı vardır. Birincisi, yapay balgam ortamının ısı sterilizasyonu yerine filtre sterilizasyonu kullanma seçimidir. Filtre sterilizasyonu, ortam...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın bir kısmı Deniz Biyolojik Laboratuvarı, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (hibe numarası 5600373) ve Simons Vakfı'nın hediyesi ile Deniz Biyolojik Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BME Vitaminleri (100x) ÇözeltisiMilliporeSigmaB6891Konsantre ek vitamin çözeltisi.
Crimper, 30 mmDWK Yaşam Bilimleri224307Serum şişelerine alüminyum contalar takmak için Crimper.
D- (+) - GlikozMilliporeSigmaG7021Katı glikoz tozu (dekstrorotatör izomer).
Diyaframlı Pompa ME 2 NTVACUUBRAND20730003Vakum filtrasyonu için vakum pompası.
Yumurta Sarısı EmülsiyonuHiMediaFD045Tuzlu suda %30 yumurta sarısının steril emülsiyonu.
Ferritin, At DalağıMilliporeSigmaF7879Ferritin (demir depolama proteini) çözeltisinden
FIREBOY plus Safety Bunsen BurnerIntegra Biosciences144000Kullanıcı arayüzü ve güvenlik özelliklerine sahip Bunsen brülörü.
Hydrion pH Kağıdı (1.0– 14.0)Micro Essential Laboratory941.0– 14.0 aralığı için pH test kağıdı.
Hydrion pH Kağıdı (4.0– 9.0)Micro Essential Laboratory55pH test kağıdı 4.0– 9.0 aralığı için.
Hydrion pH Kağıdı (6.0– 8.0)Micro Essential Laboratory345pH test kağıdı 6.0– 8.0 aralığı için.
Hipodermik İğne-Pro EDGE Güvenlik Cihazı, 18 GSmiths Medical40181518 G güvenlik kapaklı iğneler.
Sıralı Basınç GöstergesiMilliporeSigma20469Şişe basıncını izlemek için gaz basınç göstergesi.
Innova 42 İnkübe ÇalkalayıcıEppendorf2231000756Kombinasyon inkübatör/orbital çalkalayıcı.
Ekli İğneli Luer-Lok ŞırıngaBecton Dickinson309580Kombinasyon 3 mL şırınga ve 18 G iğne.
Luer Vana ÇeşitleriWorld Precision Instruments14011Gaz akış boruları için vanalar.
LSE Orbital ÇalkalayıcıThermoFisher Scientific6780-NPFiltrasyon sırasında ortamı çalkalamak için orbital çalkalayıcı.
Magnezyum Sülfat HeptahidratMilliporeSigmaM2773Katı epsom tuzu (magnezyum sülfat heptahidrat).
Debimetreli Tıbbi Hava Tek Kademeli RegülatörWestern EnterprisesM1-346-15FM15 L / dak metre ile hava akış hızı regülatörü.
MEM Amino Asitler (50x) ÇözeltisiMilliporeSigmaM5550Esansiyel amino asitlerin konsantre çözeltisi.
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (100x) ÇözeltisiMilliporeSigmaM7145Esansiyel olmayan amino asitlerin konsantre çözeltisi.
Millex-GP Filtre, 0.22 & mMilliporeSigmaSLMP25SS0.22 & M polietersülfon membran steril şırınga filtresi.
Milli-Q AcademicMilliporeSigmaZMQS60E01Milli-Q steril su filtrasyon sistemidir.
MiniOX 3000 Oksijen MonitörüMSA814365Gaz akışı oksijen yüzdesi monitörü.
MOPS Tamponu (1 M, pH 9.0)Boston BioProductsBBM-90Ortam pH'ını ayarlamak için MOPS tamponu.
Domuz Midesinden MüsinMilliporeSigmaM2378Müsin (glikosile jel oluşturan protein) tozu.
Doğal Polipropilen Dikenli BağlantıKiti Harvard Aparatı72-1413Gaz akış boruları için konektörler.
Nextera XT DNA Kütüphanesi HazırlamaKiti IlluminaFC-131-1096Dizileme sırasında tanımlama için kütüphane hazırlığı.
NovaSeq 6000 Sıralama SistemiIllumina770-2016-025-NÖrnek okumalar oluşturmak için av tüfeği sıralama platformu.
Debimetreli Oksijen Tek Kademeli RegülatörWestern EnterprisesM1-540-15FM15 L/dk metre ile oksijen debi regülatörü.
2 Standart Konnektörlü Oksijen TüpüSunMed2001-01Gaz sistemi bileşenlerini bağlamak için boru.
Fosfat tamponlu tuzlu su, 10x, pH 7.4Moleküler Biyolojikler UluslararasıMRGF-6235Konsantre fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi.
PC 420 Sıcak Plaka/KarıştırıcıMarshall ScientificCO-PC420Kombinasyon sıcak plaka/karıştırıcı.
Potasyum KlorürMilliporeSigmaP9541Katı potasyum klorür tuzu.
PTFE Tek Kullanımlık Karıştırma ÇubuklarıThermoFisher Scientific14-513-95Tek kullanımlık manyetik karıştırma çubukları.
PTFE İplik Contası Teflon BantVWR470042-938Gaz sistemi bağlantılarını güçlendirmek için Teflon bant.
Q-Gard 2 Arıtma KartuşuMilliporeSigmaQGARD00D2Milli-Q sistemi için arıtma kartuşu.
Yeniden Kullanılabilir Medya Saklama ŞişeleriThermoFisher Scientific06-423AKültür ortamını karıştırmak ve saklamak için şişeler.
Kauçuk Tıpa, 30 mm, Gri BromobütilDWK Yaşam Bilimleri224100-331Serum şişeleri için kauçuk tıpalar.
Kalıplanmış Dereceli Serum Şişesi, 500 mLDWK Yaşam Bilimleri223952Kapalı kültür için cam serum şişeleri.
Küçük Çaplı Uzatma SetiBraun Medical471960Luer kilit konektörlü boru uzatması.
Sodyum KlorürMilliporeSigmaS3014Katı sodyum klorür tuzu.
Spike-in Kontrolü I (Yüksek Mikrobiyal Yük)ZymoBIOMICSD6320Mutlak mikrobiyal yük hesaplamaları için spike-in mikroplar (I. halotolerans ve A. halotolerans)
Stericup Quick Release Steril Vakum Filtrasyon SistemiMilliporeSigmaS2GPU02RE250 mL 0.22 & mikro; m vakumlu filtrasyon odası.
Süper Sani-Bez Antiseptik Tek Kullanımlık MendillerProfesyonel Tek Kullanımlık UluslararasıH04082Sterilizasyon için tek kullanımlık antiseptik mendiller.
İz Metaller Karışımı, 1000xThermoFisher ScientificNC0112668Fizyolojik eser metallerin konsantre çözeltisi.
Astarsız Alüminyum Conta, 30 mmDWK Yaşam Bilimleri224187-01Alüminyum contalar, kauçuk tıpaların üzerine kıvrılmış.
USP Tıbbi Sınıf Hava TankıAirgasAI USP200Serpme sistemine giriş için basınçlı hava tankı.
USP Tıbbi Sınıf Oksijen TankıAirgasOX USP200Serpme sistemine giriş için basınçlı oksijen tankı.
katyonlaştırılmıştır.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060(2018).
  2. Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
  3. Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798(2018).
  4. Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
  5. Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
  6. Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
  7. Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
  8. Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532(2017).
  9. Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , Version 1 (2010).
  10. Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857(2012).
  11. Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423(2017).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938(2015).
  14. Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846(2016).
  15. Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
  16. Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
  17. Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953(2020).
  18. McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
  19. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
  20. Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28(2016).
  21. Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
  22. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  23. Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
  24. Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390(2017).
  25. Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
  26. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cystic Fibrosis MicrobiomeSupplemental OxygenArtificial Sputum MediumAirway Microbial CommunitiesOxygen SpargingSerum Bottle CultureMetagenomic SequencingMicrobial Community CompositionLung PathogensFilter Sterilization

Related Articles