Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem

Summary

Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) tohumlarının yüzey sterilizasyonu için yüksek verimli bir protokol sağlanır ve sıvı taşıma adımlarını vakum pompası ile inşa edilmiş basit bir emiş cihazı ile optimize eder. Bir günde yüzlerce tohum örneği yüzey sterilize edilebilir.

Abstract

Arabidopsis, fonksiyonel çalışmalar için en yaygın kullanılan bitki modeli türüdür. Arabidopsis tohumlarının yüzey sterilizasyonu bu amaçla gerekli olan temel bir adımdır. Bu nedenle, aynı anda onlarca ila yüzlerce örneği (örneğin transgenik çizgiler, ekotipler veya mutantlar) işlemek için yüksek verimli Arabidopsis tohum yüzey sterilizasyon yöntemleri oluşturmak çok önemlidir. Bu çalışmada, ortak bir vakum pompasından üretilen ev yapımı bir emme cihazı ile tüplerdeki sıvının verimli bir şekilde ortadan kaldırılmasına dayanan bir tohum yüzey sterilizasyon yöntemi sunulmuştur. Bu yöntemle emek yoğun uygulamalı zamanı önemli ölçüde azaltarak, bir günde birkaç yüzlerce numuneyi işlemek çok az çabayla mümkündür. Seri zaman seyri analizleri, yüksek çimlenme oranlarını koruyarak yüzey sterilizasyonunun son derece esnek bir zaman aralığına işaret etti. Bu yöntem, tohum boyutuna göre emme cihazının basit bir şekilde özelleştirilmesi ve sıvının ortadan kaldırılması için istenen hız ile diğer küçük tohum türlerinin yüzey sterilizasyonu için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

Arabidopsis, Brassicaceae familyasına ait bir diploid bitki türüdür. Nispeten kısa yaşam döngüsü (uzun gün yetiştirme koşullarında nesil başına iki ay), küçük bitki büyüklüğü ve bitki başına yüzlerce tohum üretimi ile kendi kendine tozlaşması onu ilk temel bitki modeli türü^1,2yaptı. Buna ek olarak, genomu tamamen^{sıralanmıştır 3}, kapsamlı ters genetik araçları (doymuş T-DNA, transposon ve kimyasal olarak mutajened popülasyonlar)^{mevcuttur 4,5,6}ve etkili Agrobacteriumaracılı dönüşüm, daha....

Protocol

1. Reaktifler ve medya hazırlama

1. 
   
   
2. 
   
   

Results

Tüm tohum sterilizasyon prosedürü için gereken süreyi değerlendirmek için, mevcut protokoldeki 96 numunenin sıvı elleçlenmesi için zaman farkları hesaplandı ve geleneksel pipetleme yöntemleri ile karşılaştırıldı. Sonuç, mevcut protokolün zaman kazandırdığını ve geleneksel protokollerle sıvı taşıma süresini bunun dörtte birine düşürdüğünü gösterir (Tablo 1). Tablo ayrıca, mevcut protokoldeki sıvı çıkarma süresinin, genel olarak sekiz kat azaltma ile geleneksel yöntemlerden daha fazla zaman tasarrufu yaptı.......

Discussion

Tohumların sterilizasyonu Arabidopsis'te fonksiyonel çalışmalar için temel adımdır. Birçok farklı amaç için sıkça yapılmasına rağmen Arabidopsis'te yüksek verimli tohum yüzey sterilizasyonu ile ilgili sınırlı çalışmalar mevcuttur.

Şimdiye kadar, en yüksek verime sahip yöntemlerden biri, çamaşır suyunu konsantre HCl ile karıştırarak üretilen klor gazı kullanmaktır. Bu yöntem sınırlı uygulamalı zaman gerektirmesine rağmen, insanlar için oldukça zehirli bir gaz kullanır²⁷........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Akvaryum vanası	Amazon	B074CYC5SD	2 valf ve ince duvarlı hortumlar içeren kit. Valf, sıvıların steril uca geri dönmesini önler
Arabidopsis Col-0 yabani tip tohumlar	Nottingham Arabidopsis Stok Merkezi	N1093	Yabani tip tohumlar (kanamisine duyarlı)
Arabidopsis transgenik hat AdoIspS-79 tohumlar	NA	NA	Transgenik hat, Col-0 arka planında dönüştürülen Arundo donax'tan bir izopren sentaz genini aşırı eksprese eder, kanamisine dirençli (Li ve ark. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Yazarların isteği üzerine temin edilebilir
Mikrosantrifüj	Eppendorf	EP022628188
Murashige & Vitaminleri içeren Skoog ortamı	Duchefa	M0222	Bitki steril kültürü için standart ortam
Pipet kontrolörü	Marka	26300	Serolojik pipeti çalıştırmak için kullanılır
Polietilen tüp 1	Roth	9591.1	Vakum pompasından dekantasyon şişesine bağlantı için tüp (iç çap: 7 mm; dış çap: 9 mm)
Polietilen tüp 2	Roth	9587.1	Dekantasyon şişesinden akvaryum vanasına bağlantı için tüp  (iç çap: 5 mm; dış çap: 7 mm)
Konnektörlü vidalı kapak	Roth	PY86.1	Şişeyi boşaltmak için polipropilen 2 dağıtıcı vidalı kapak GL45
Serolojik pipet	Marka	27823	Dereceli cam (yeniden kullanılabilir) serolojik pipet. Bunun yerine tek kullanımlık pipetler kullanılabilir
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II boncuk değirmeni. Tüplere boncuk ilavesi yapılmadan çalkalayıcı olarak çalışır.
Teknik etanol	ITW Reaktifleri (Nova Chimica Srl)	212800	Etanol %96 v/v kısmen denatüre teknik sınıf
Tween 20	Merck Millipore	655205	Yüzey aktif madde görevi gören iyonik olmayan deterjan
Üniversal boru konektörleri	Roth	Y523.1	Boru bağlantılarını iyileştirmek/basitleştirmek için kullanılabilir
Vakum pompası	Merck Millipore	WP6222050	için kullanılır Aspirasyon cihazının yapılması