Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) tohumlarının yüzey sterilizasyonu için yüksek verimli bir protokol sağlanır ve sıvı taşıma adımlarını vakum pompası ile inşa edilmiş basit bir emiş cihazı ile optimize eder. Bir günde yüzlerce tohum örneği yüzey sterilize edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Arabidopsis, fonksiyonel çalışmalar için en yaygın kullanılan bitki modeli türüdür. Arabidopsis tohumlarının yüzey sterilizasyonu bu amaçla gerekli olan temel bir adımdır. Bu nedenle, aynı anda onlarca ila yüzlerce örneği (örneğin transgenik çizgiler, ekotipler veya mutantlar) işlemek için yüksek verimli Arabidopsis tohum yüzey sterilizasyon yöntemleri oluşturmak çok önemlidir. Bu çalışmada, ortak bir vakum pompasından üretilen ev yapımı bir emme cihazı ile tüplerdeki sıvının verimli bir şekilde ortadan kaldırılmasına dayanan bir tohum yüzey sterilizasyon yöntemi sunulmuştur. Bu yöntemle emek yoğun uygulamalı zamanı önemli ölçüde azaltarak, bir günde birkaç yüzlerce numuneyi işlemek çok az çabayla mümkündür. Seri zaman seyri analizleri, yüksek çimlenme oranlarını koruyarak yüzey sterilizasyonunun son derece esnek bir zaman aralığına işaret etti. Bu yöntem, tohum boyutuna göre emme cihazının basit bir şekilde özelleştirilmesi ve sıvının ortadan kaldırılması için istenen hız ile diğer küçük tohum türlerinin yüzey sterilizasyonu için kolayca uyarlanabilir.
Giriş
Arabidopsis, Brassicaceae familyasına ait bir diploid bitki türüdür. Nispeten kısa yaşam döngüsü (uzun gün yetiştirme koşullarında nesil başına iki ay), küçük bitki büyüklüğü ve bitki başına yüzlerce tohum üretimi ile kendi kendine tozlaşması onu ilk temel bitki modeli türü1,2yaptı. Buna ek olarak, genomu tamamensıralanmıştır 3, kapsamlı ters genetik araçları (doymuş T-DNA, transposon ve kimyasal olarak mutajened popülasyonlar)mevcuttur 4,5,6ve etkili Agrobacteriumaracılı dönüşüm, daha fazla aşağı akış çalışması için yeterli transgenik çizgi elde etmek için iyi kurulmuştur7 . Bu nedenle, son yirmi yıl boyunca, arabidopsis'i, doğal, genetik ve fenotipik varyasyon8,9dahil olmak üzere moleküler düzeyde bitki biyolojisinin çeşitli yönlerini parçalamak için bir model tür olarak kullanarak büyük ilerlemeler elde edilmiştir.
Arabidopsis'e ilgi genlerini işlevsel olarak karakterize etmek için, mantar ve bakteriyel kirleticileri ortadan kaldırmak için tohum yüzey sterilizasyonu, aksinik kültürler gerektiren birçok aşağı akış protokolü için ön koşul adımıdır. Gen fonksiyonunun aşırı ekspresyonu10, devirme (RNA-I11)veya nakavt (genom düzenleme12,13),hücre altı lokalizasyonu14, promotör aktivitesi15 , 16,protein-protein17ve protein-DNA etkileşimi18için genetik dönüşüm , sadece en yaygın uygulamalardan alıntı yapmak için, hepsi bir tohum yüzey sterilizasyonu adımı gerektirir. Bu nedenle, göreceli basitliğine rağmen, tohum yüzey sterilizasyonu birçok fonksiyonel analizde temel bir rol oynar.
Şimdiye kadar, gaz veya sıvı fazlı sterilizasyon19temel alınarak iki ana tohum yüzey sterilizasyonu yöntemi kategorisi geliştirilmiştir. Gaz fazlı tohum yüzey sterilizasyonunun verimi orta ila yüksek olsa da, tehlikeli reaktif klor gazını yüzey sterilizasyon maddesi olarak kullanmak geniş uygulamasını engellemiştir. Sıvı fazlı sterilizasyona dayanan yöntemler, aksine, yüzey sterilizasyonu için etanol ve çamaşır suyu çözeltileri gibi daha hafif kimyasallara dayanır ve doğal olarak klor fümigasyonundan daha düşük verime sahip olmalarına rağmen daha yaygın olarak kullanılırlar. Genel olarak, sıvı reaktifleri kullanan iki farklı yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyük ölçüde kullanılan bir yöntem, farklı konsantrasyonlarda etanol ve çamaşır suyu ile farklı sürelerde yıkamaya dayanır20,21. Başka bir yöntem çamaşır suyu uygulamasına dayanır sadece21,22. Her iki yöntem de esas olarak küçük ölçekli tohum yüzey sterilizasyonu için uygulanmaktadır. Bununla birlikte, birçok deneyde, bir dönüşümden türetilen birçok Arabidopsis transgenik çizginin taranması gerekir15,23 veya ekran paralel olarak farklı dönüşümlerden oluşturulan birçok transgenik çizgi 24,25. Bilgimiz dahilinde, yüksek verimli tohum yüzey sterilizasyonu için sıvı bazlı bir yöntem yayınlanmamıştır, bu da çok az tanınmasına rağmen, fonksiyonel genomik yaklaşımlar için önemli bir darboğaz oluşturmaktadır. Bu nedenle, tohum yüzey sterilizasyonu için güvenli, sağlam ve yüksek verimli yöntemler geliştirmek, birçok genin aynı anda fonksiyonel karakterizasyonunun başarısı için gerekli ve kritik bir adımdır.
Bu amaçla, mevcut çalışmada, Arabidopsis tohumlarının yüzey sterilizasyonu için geliştirilmiş bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem güvenli, düşük maliyetli, son derece sağlam ve yüksek verime sahiptir ve tohum yüzey sterilizasyonunun başlangıcından Petri kaplarında tohum ekiminin sonuna kadar bir saat içinde 96 bağımsız hattın işlenmesine izin verir. Gösterilen yöntem, vakum pompası, sarf malzemesi züccaciye ve plastik gereçler gibi yaygın olarak bulunan temel laboratuvar araçlarına dayanmaktadır. Bu geliştirilmiş yöntem, arabidopsis ve diğer model olmayan bitki türlerinde modern fonksiyonel genomik yaklaşımlara yeterli bir verimle tohum yüzey sterilizasyonunu kolaylaştırmak için bilim topluluğuna güvenli, basit ve uygun fiyatlı bir yaklaşım sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tüm tohum sterilizasyon prosedürü için gereken süreyi değerlendirmek için, mevcut protokoldeki 96 numunenin sıvı elleçlenmesi için zaman farkları hesaplandı ve geleneksel pipetleme yöntemleri ile karşılaştırıldı. Sonuç, mevcut protokolün zaman kazandırdığını ve geleneksel protokollerle sıvı taşıma süresini bunun dörtte birine düşürdüğünü gösterir (Tablo 1). Tablo ayrıca, mevcut protokoldeki sıvı çıkarma süresinin, genel olarak sekiz kat azaltma ile geleneksel yöntemlerden daha fazla zaman tasarrufu yaptı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tohumların sterilizasyonu Arabidopsis'te fonksiyonel çalışmalar için temel adımdır. Birçok farklı amaç için sıkça yapılmasına rağmen Arabidopsis'te yüksek verimli tohum yüzey sterilizasyonu ile ilgili sınırlı çalışmalar mevcuttur.
Şimdiye kadar, en yüksek verime sahip yöntemlerden biri, çamaşır suyunu konsantre HCl ile karıştırarak üretilen klor gazı kullanmaktır. Bu yöntem sınırlı uygulamalı zaman gerektirmesine rağmen, insanlar için oldukça zehirli bir gaz kullanır27....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Bu araştırma, Fondazione E. Mach'in Ecogenomics grubunun temel finansmanı yoluyla Trento Özerk Eyaleti tarafından finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Akvaryum vanası | Amazon | B074CYC5SD | 2 valf ve ince duvarlı hortumlar içeren kit. Valf, sıvıların steril uca geri dönmesini önler |
| Arabidopsis Col-0 yabani tip tohumlar | Nottingham Arabidopsis Stok Merkezi | N1093 | Yabani tip tohumlar (kanamisine duyarlı) |
| Arabidopsis transgenik hat AdoIspS-79 tohumlar | NA | NA | Transgenik hat, Col-0 arka planında dönüştürülen Arundo donax'tan bir izopren sentaz genini aşırı eksprese eder, kanamisine dirençli (Li ve ark. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Yazarların isteği üzerine temin edilebilir |
| Mikrosantrifüj | Eppendorf | EP022628188 | |
| Murashige & Vitaminleri içeren Skoog ortamı | Duchefa | M0222 | Bitki steril kültürü için standart ortam |
| Pipet kontrolörü | Marka | 26300 | Serolojik pipeti çalıştırmak için kullanılır |
| Polietilen tüp 1 | Roth | 9591.1 | Vakum pompasından dekantasyon şişesine bağlantı için tüp (iç çap: 7 mm; dış çap: 9 mm) |
| Polietilen tüp 2 | Roth | 9587.1 | Dekantasyon şişesinden akvaryum vanasına bağlantı için tüp (iç çap: 5 mm; dış çap: 7 mm) |
| Konnektörlü vidalı kapak | Roth | PY86.1 | Şişeyi boşaltmak için polipropilen 2 dağıtıcı vidalı kapak GL45 |
| Serolojik pipet | Marka | 27823 | Dereceli cam (yeniden kullanılabilir) serolojik pipet. Bunun yerine tek kullanımlık pipetler kullanılabilir |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II boncuk değirmeni. Tüplere boncuk ilavesi yapılmadan çalkalayıcı olarak çalışır. |
| Teknik etanol | ITW Reaktifleri (Nova Chimica Srl) | 212800 | Etanol %96 v/v kısmen denatüre teknik sınıf |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Yüzey aktif madde görevi gören iyonik olmayan deterjan |
| Üniversal boru konektörleri | Roth | Y523.1 | Boru bağlantılarını iyileştirmek/basitleştirmek için kullanılabilir |
| Vakum pompası | Merck Millipore | WP6222050 | için kullanılır Aspirasyon cihazının yapılması |
Kaynaklar
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408(2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587(2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
