Yöntem makalesi

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

DOI:

10.3791/62902

⸱

13 Ağustos 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal substrat akısı her hücre tipinin ayırt edici bir özelliğidir ve taşıyıcılar, kanallar veya enzimler gibi bileşenlerindeki değişiklikler birkaç hastalığın patogenezinde rol oynar. Mitokondriyal substrat akısı bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondri kullanılarak incelenebilir. Sağlam hücrelerin araştırılması, farklı substratların eşzamanlı oksidasyonu nedeniyle çeşitli sorunlarla karşılaşır. Ayrıca, birkaç hücre türü, sonuç yorumlamayı zorlaştıran farklı substratların iç depolarını içerir. Mitokondriyal izolasyon veya permeabilize edici ajanlar kullanma gibi yöntemler kolayca tekrarlanamaz. Saf mitokondrilerin küçük örneklerden yeterli miktarda bozulmamış zarlarla izole edilmesi sorunludur. Seçici olmayan permeabilizatörlerin kullanılması, çeşitli derecelerde kaçınılmaz mitokondriyal membran hasarına neden olur. Rekombinant perfringolysin O (rPFO), mitokondriyal bütünlüğü etkilemeden plazma membranını seçici olarak permeabilize etme yeteneği sayesinde daha uygun bir permeabilizatör olarak sunuldu. Mikro plaka respirometrisi ile birlikte kullanıldığında, birkaç mitokondriyal substratın akısının en az sayıda hücre kullanırken bir deneyde yeterli çoğaltma ile testine izin verir. Bu çalışmada, protokol iki farklı hücresel fenotip veya genotipin mitokondriyal substrat akısını karşılaştırmak için bir yöntem açıklar ve çeşitli mitokondriyal substratları veya inhibitörleri test etmek için özelleştirilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro plaka bazlı respirometri, küçük bir örneklem boyutunun hücresel solunumunun incelenmesini sağlayarak mitokondriyal araştırmalarda devrim yaptı1. Hücresel solunum genellikle mitokondriyal fonksiyonun veya 'işlev bozukluğunun' bir göstergesi olarak kabul edilir, ancak mitokondriyal fonksiyon aralığı enerji üretiminin ötesine uzanır2. Aerobik koşullarda mitokondriler, bu substratları parçalayarak ve sitrik asit döngüsünü körükleyebilecek metabolik ara parçalara dönüştürerek farklı substratlarda depolanan enerjiyi çıkarır3 (Şekil 1). Substratların sürekli akışı, sitrik asit döngüsünün akışının, iç mitokondriyal membran boyunca proton gradyanı üreten elektron taşıma zincirine elektronlar sağlayan ve ATP-synthase'in ADP'yi ATP4'efosforilasyon yapmasını sağlayan yüksek enerjili 'elektron donörleri' üretmesi için gereklidir. Bu nedenle, mitokondriyal solunumu test etmek için deneysel bir tasarım, örnek doğayı (bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondriler) ve mitokondriyal substratları içermelidir.

Hücreler yerli substratların bir deposu tutar5ve mitokondri aynı anda çeşitli substrat türlerini oksitler6, bu da sağlam hücreler üzerinde yapılan deneylerden elde edilen sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Seçilen bir substratı oksitlemek için mitokondriyal yeteneği araştırmak için yaygın bir yaklaşım mitokondri izole etmek veya araştırılan hücrelerin dengesini sağlamaktır5. İzole mitokondri nicel çalışmalar için ideal olsa da izolasyon süreci zahmetlidir. Büyük numune boyutu ihtiyacı, verimin saflığı ve tekniğin tekrarlanabilirliği gibi teknik zorluklarla karşıkarşıyadır 5. Permeabilize hücreler mitokondriyal izolasyonun dezavantajları için bir çözüm sunar; bununla birlikte, deterjan doğasının rutin permeabilize edici ajanları spesifik değildir ve mitokondriyal membranlara zarar verebilir5.

Rekombinant perfringolysin O (rPFO) seçici plazma membran permeabilizasyon ajanı7olarak sunuldu ve çeşitli çalışmalarda hücre dışı bir akı analizörü ile birlikte başarıyla kullanıldı 7,8,9,10. XFe96 hücre dışı akı çözümleyicisi kullanarak mitokondriyal substrat akısını taramak için rPFO kullanarak bir protokol değiştirdik. Bu protokolde, iki hücresel fenotipte dört farklı substrat oksitleyici yol, test edilen her malzeme için yeterli çoğaltma ve uygun kontrole sahipken karşılaştırılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Testden bir gün önce

  1. Reaktiflerin ve substratların hazırlanması.
    1. Mitokondriyal test çözümü (MAS): Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm reaktiflerin stok çözümlerini hazırlayın. Mannitol ve sakkaroz stoklarını tamamen çözünmesi için 37 °C'ye ısıtın. 2x MAS hazırlamak için reaktifleri karıştırın, ardından karışımı 37 ° C'ye ısıtın. pH'ı 5N KOH ile 7,4 (~7 mL) olarak ayarlayın, ardından hacmi 1 L'ye kadar getirmek için su ekleyin.
    2. Sığır serum albümini (%5 BSA): 5 g BSA'yı 90 mL önceden ısıtılmış steril suda manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün ve titremekten kaçının. 5 N KOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından hacmi 100 mL'ye çıkarmak için su ekleyin. Aliquotları ölçüm gününe kadar -20 °C'de filtreleyin ve saklayın.
    3. Mitokondriyal substratlar: Steril suda sodyum süksinat, sodyum piruvat ve sodyum glutamat 1 M stok çözeltileri hazırlayın. Steril suda 100 mM sodyum malat stok çözeltisi hazırlayın ve palmitoil karnitin 10 mM stok çözeltisi hazırlamak için önceden ısıtilmiş steril su kullanın. Her çözeltinin pH'ını 7,4'e 5 N KOH'a ayarlayın ve filtre sterilize edin. Substratları 2-8 °C'de saklayın. Kullanım sırasında, herhangi bir çökeltmeyi çözmek için 37 ° C'ye ılık palmitoil karnitin. Daha sonra kullanmak için, piruvat hariç tüm substratların aliquotlarını -20 °C'de saklayın.
    4. Mitokondriyal inhibitörler: 25 mM oligomisin, 50 mM karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) fenilhidrozon (FCCP), 20 mM rotenon ve 20 mM antimisin A stok çözeltileri hazırlamak için dimetil sülfit (DMSO) kullanın.
  2. Hücrelerin tohumlama ve tedavi: Şekil 2'degösterildiği gibi, hücreleri sütun 2-11'de tohumlama. Arka plan kuyuları olarak hizmet vermek için sütun 1 ve 12 boş bırakılmalıdır. Bu çalışmada HepG2 ve A549 hücreleri kullanılmıştır.
    1. Hücreleri kuyu başına 20.000 hücre yoğunluğunda tohumla. Tohumlama için 50-80 μL hücre kültürü ortamı kullanın.
    2. Boş kuyuları eşit hacimli hücre kültürü ortamıyla doldurun ve hücreleri% 5 CO2ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın. Hücrelerin 3-4 saat boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından tüm kuyulara 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin.
    3. Bu son orta ilave ile tedaviyi 7-11 kolonlarında uygulayın. Bu çalışmada deney grubuna 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür, kontrol grubuna ise araç kontrolü olarak eşit hacimde steril damıtılmış su arıtılmış.
  3. Sensörlerin nemlendirilmesi: Pipet 200 μL kuyu başına steril su şebeke plakasına, ardından sensörleri suya batırırken sensör kartuşunu dikkatlice geri verin. Kartuşu ertesi güne kadar 37 °C'de CO2içermeyen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
  4. Tahlil protokolü şablonu: Çözümleyiciyi (bkz. Malzeme Tablosu)ve denetleyici ünitesini açma. Cihaz kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın ve tablo 2'deaçıklandığı gibi test protokolünü tasarlayın. Grup Tanımlarıaltında, A Bağlantı Noktasının enjekte edilen substrata göre farklılık gösterdiği dört enjeksiyon stratejisi oluşturun (Şekil 3). Stratejileri alt tabakalardan veya kısaltmalarından sonra adlandırın.
  5. B, C ve D bağlantı noktalarına sırasıyla oligomisinin, FCCP'nin ve rotenon/antimisinin A bileşiklerini atayın. Sekiz grup oluşturun ve şekil 4'tegösterildiği gibi adlandırın. Plaka Haritası altında grupları ilgili kuyulara atayın, ardından protokolü kullanıma hazır şablon olarak kaydedin. Sıcaklığın gece boyunca dengelenmesi için analizörü açık bırakın. Ani sıcaklık değişikliklerini önlemek için analizörü sabit bir sıcaklığa sahip bir yerde tutun.

2. Tahlil günü

  1. Suyun kalibrantla değiştirilmesi: Suyu şebeke plakasından ve pipetten 200 μL önceden uyarılmış kalibrantın kuyu başına yardımcı plakaya atın. Kartuşu test zamanına kadar CO2içermeyen inkübatöre geri verin. Kalibratörün hızlı buharlaşmasını önlemek için, inkübatörün içinde bir nem kaynağı sağlayın ve fan hızını kapatın veya minimuma küçümseyin.
  2. Çalışma çözümlerinin hazırlanması: 2x MAS, %5 BSA ve steril suyu 37 °C'ye ısıtarak başlayın. Bu arada, inhibitör stoklarının oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Tablo 3'teaçıklandığı gibi substratların ve inhibitörlerin çalışma konsantrasyonunun 5 mL'sini hazırlamak için ılık 2x MAS ve steril damıtılmış su kullanın.
  3. Enjeksiyon portlarının yüklenmesi: Şekil 3'tegösterildiği gibi, substratların 20 μL'sini A limanına yükleyin. Tüm plaka için, 22 μL oligomicin preparatı ile B portu, 25 μL FCCP hazırlığı ile C limanı ve 27 μL rotenon / antimisicin A karışımı ile D bağlantı noktası yükleyin.
  4. Kalibrasyon adımını başlatma: Test Çalıştır sekmesi altında, tahlilleri başlatmak için Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Yüklü sensör kartuşunu takın ve kalibrasyon adımını başlatın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin.
  5. Tahlil ortamının hazırlanması (MAS-BSA-rPFO): Test ortamının 20 mL'sini hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüpte 10 mL 2x MAS, 9,2 mL steril su ve %5 BSA'nın 0,8 mL'sini karıştırın. 1 nM konsantrasyon elde etmek için 2 μL 10 μM rPFO ekleyin ve karışımı hafif pipetleme ile yeniden dürt. Titremekten kaçının ve karıştırmak için bir girdap karıştırıcı kullanmayın. Tüpü kullanım zamanına kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. Hücrelerin yıkanması: Hücreleri ve boş boş kuyuları çok kanallı pipet kullanarak önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. Hücre kültürü ortamını atmak ve PBS eklemek için aynı ipuçlarını yeniden kullanmaktan kaçının. Hücrelerin hava akımı tarafından kurumasını korumak için laminar akışının dışında bu adımı gerçekleştirin.
  7. Test ortamında hücre permeabilizasyonu: Çok kanallı pipet kullanarak PBS'yi atın ve önceden ısınmış test ortamının (MAS-BSA-rPFO) 180 μL ile değiştirin.
  8. Ölçüme başlama: Permeabilizasyondan hemen sonra, kalibre edilmiş sensör kartuşunun ana plakasını hücre plakasıyla değiştirin ve ölçüme başlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Değerleri oksijen tüketim oranı yüzdesi (OCR%) olarak göstermek için sonuçları ikinci taban çizgisi solunum ölçümüne normalleştirerek başlayın. Tahlil sonuçları Şekil 5, Şekil6 , Şekil 7ve Şekil 8 'de gösterilmiştir. Her grup için uygun arka plan kuyularını atamak ve diğer grupların arka plan kuyularını devre dışı bırakmak önemlidir. Şekil 5,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, daha önce yayınlanan7,8,9,10 çalışmalarının ve ürün kullanım kılavuzunun bir modifikasyonudur. Üreticinin protokolünün aksine, 3x MAS yerine 2x MAS kullanılır, çünkü 2× MAS'ın çözülmesi daha kolaydır ve donma sonrasında yağış oluşturmaz. Dondurulmuş 2x MAS aliquots altı aya kadar saklanabilir ve tutarlı sonuçlar gösterebilir. Diğer bir fark, ADP'yi 2x MAS bileşenlerine dahil etmek ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Hradec Králové Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü ve Üçüncü Tıp Fakültesi Patofizyoloji Bölümü personeline kimyasallar ve numunelerin hazırlanması konusundaki yardımlarından dolayı teşekkür ediyor. Bu çalışma Charles Üniversitesi hibe programları PROGRES Q40/02 tarafından desteklenmiştir, Çek Sağlık Bakanlığı hibe NU21-01-00259, Çek bilim vakfı hibe 18-10144 ve INOMED projesi CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı ve Avrupa Birliği tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Adenozin 5 & asal; -difosfat monopotasyum tuzu dihidratMerckA5285-20 ° C'de saklayın; C
Antimisin AMerckA8674mağazası -20 &°C'de; C
Sığır serum albüminiMerckA3803mağazası 2 - 8 &°C; C
Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazonMerckC2920-20 ° C'de saklanır; C
Dimetil sülfoksitMerckD8418RT'de mağaza
D-MannitolMerck63559
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suGibco14190-144'temağaza RT
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N ve prime;-tetraasetik asitMerck03777
HEPESMerck'te mağazaH7523RT
L(-)Malik asit disodyum tuzuMerck'teM9138hidrat'ta saklayın
MerckG5889RT'de saklayın
Magnezyum klorür hekzahidratMerckM2670RT
Oligomisin'deMerckO4876mağazası -20 derece; C
Palmitoil-DL-karnitin klorürMerckP4509-20 ° C'de saklayın; C
Potasyum hidroksitMerck484016RT'de mağaza
Potasyum fosfat monobazikMerckP5655
RotenoneMerckR8875'temağaza -20 &° 'de; C
Denizatı Dalga Masaüstü YazılımıAgilent teknolojileri
Seahorse XFe96 AnalizöründenAgilent teknolojileri
Denizatı XFe96 FluxPakAgilent teknolojileri102416-100XFe96 sensör kartuşları ve XF96 hücre kültürü mikroplakaları
Sodyum piruvatMerckP22562 - 8 ° C'de saklayın; C
Sodyum süksinat dibazik hekzahidratMerckS2378RT'de mağaza
SükrozMerckS7903RT Water'da mağaza
MerckW3500RT'de mağaza
XF kalibrantAgilent teknolojileri100840-000RT XF'de mağaza
Plazma membran geçirgenleştiriciAgilent teknolojileri102504-100Rekombinant perfringolizin O (rPFO) - Aliquot ve -20 ° C'de saklayın; Ç
RT RT saklayın RT L-Glutamik asit sodyum tuzu saklayın RT www.agilent.com indirin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Perfringolizin O PermeabilizasyonuH cre PermeabilizasyonuSeahorse XF Analiz rMikroplaka RespirometrisiMitokondriyal SolunumSubstrat Kaynakl SolunumMetformin UygulamasA549 H creleri

İlgili makaleler