Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mitokondriyal substrat akısı her hücre tipinin ayırt edici bir özelliğidir ve taşıyıcılar, kanallar veya enzimler gibi bileşenlerindeki değişiklikler birkaç hastalığın patogenezinde rol oynar. Mitokondriyal substrat akısı bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondri kullanılarak incelenebilir. Sağlam hücrelerin araştırılması, farklı substratların eşzamanlı oksidasyonu nedeniyle çeşitli sorunlarla karşılaşır. Ayrıca, birkaç hücre türü, sonuç yorumlamayı zorlaştıran farklı substratların iç depolarını içerir. Mitokondriyal izolasyon veya permeabilize edici ajanlar kullanma gibi yöntemler kolayca tekrarlanamaz. Saf mitokondrilerin küçük örneklerden yeterli miktarda bozulmamış zarlarla izole edilmesi sorunludur. Seçici olmayan permeabilizatörlerin kullanılması, çeşitli derecelerde kaçınılmaz mitokondriyal membran hasarına neden olur. Rekombinant perfringolysin O (rPFO), mitokondriyal bütünlüğü etkilemeden plazma membranını seçici olarak permeabilize etme yeteneği sayesinde daha uygun bir permeabilizatör olarak sunuldu. Mikro plaka respirometrisi ile birlikte kullanıldığında, birkaç mitokondriyal substratın akısının en az sayıda hücre kullanırken bir deneyde yeterli çoğaltma ile testine izin verir. Bu çalışmada, protokol iki farklı hücresel fenotip veya genotipin mitokondriyal substrat akısını karşılaştırmak için bir yöntem açıklar ve çeşitli mitokondriyal substratları veya inhibitörleri test etmek için özelleştirilebilir.
Giriş
Mikro plaka bazlı respirometri, küçük bir örneklem boyutunun hücresel solunumunun incelenmesini sağlayarak mitokondriyal araştırmalarda devrim yaptı1. Hücresel solunum genellikle mitokondriyal fonksiyonun veya 'işlev bozukluğunun' bir göstergesi olarak kabul edilir, ancak mitokondriyal fonksiyon aralığı enerji üretiminin ötesine uzanır2. Aerobik koşullarda mitokondriler, bu substratları parçalayarak ve sitrik asit döngüsünü körükleyebilecek metabolik ara parçalara dönüştürerek farklı substratlarda depolanan enerjiyi çıkarır3 (Şekil 1). Substratların sürekli akışı, sit....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Testden bir gün önce
- Reaktiflerin ve substratların hazırlanması.
- Mitokondriyal test çözümü (MAS): Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm reaktiflerin stok çözümlerini hazırlayın. Mannitol ve sakkaroz stoklarını tamamen çözünmesi için 37 °C'ye ısıtın. 2x MAS hazırlamak için reaktifleri karıştırın, ardından karışımı 37 ° C'ye ısıtın. pH'ı 5N KOH ile 7,4 (~7 mL) olarak ayarlayın, ardından hacmi 1 L'ye kadar getirmek için su ekleyin.
- Sığır serum albümini (%5 BSA): 5 g BSA'yı 90 mL önceden ısıtılmış steril suda manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün ve titremekten kaçının. 5 N KOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından hacmi 100 mL'....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Değerleri oksijen tüketim oranı yüzdesi (OCR%) olarak göstermek için sonuçları ikinci taban çizgisi solunum ölçümüne normalleştirerek başlayın. Tahlil sonuçları Şekil 5, Şekil6 , Şekil 7ve Şekil 8 'de gösterilmiştir. Her grup için uygun arka plan kuyularını atamak ve diğer grupların arka plan kuyularını devre dışı bırakmak önemlidir. Şekil 5,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, daha önce yayınlanan7,8,9,10 çalışmalarının ve ürün kullanım kılavuzunun bir modifikasyonudur. Üreticinin protokolünün aksine, 3x MAS yerine 2x MAS kullanılır, çünkü 2× MAS'ın çözülmesi daha kolaydır ve donma sonrasında yağış oluşturmaz. Dondurulmuş 2x MAS aliquots altı aya kadar saklanabilir ve tutarlı sonuçlar gösterebilir. Diğer bir fark, ADP'yi 2x MAS bileşenlerine dahil etmek .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Hradec Králové Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü ve Üçüncü Tıp Fakültesi Patofizyoloji Bölümü personeline kimyasallar ve numunelerin hazırlanması konusundaki yardımlarından dolayı teşekkür ediyor. Bu çalışma Charles Üniversitesi hibe programları PROGRES Q40/02 tarafından desteklenmiştir, Çek Sağlık Bakanlığı hibe NU21-01-00259, Çek bilim vakfı hibe 18-10144 ve INOMED projesi CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı ve Avrupa Birliği tarafından finanse edilmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Adenozin 5 & asal; -difosfat monopotasyum tuzu dihidrat | Merck | A5285 | -20 ° C'de saklayın; C |
| Antimisin A | Merck | A8674 | mağazası -20 &°C'de; C |
| Sığır serum albümini | Merck | A3803 | mağazası 2 - 8 &°C; C |
| Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon | Merck | C2920 | -20 ° C'de saklanır; C |
| Dimetil sülfoksit | Merck | D8418 | RT'de mağaza |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su | Gibco | 14190-144'te | mağaza RT |
| Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N ve prime;-tetraasetik asit | Merck | 03777 | |
| HEPES | Merck'te mağaza | H7523 | RT |
| L(-)Malik asit disodyum tuzu | Merck'te | M9138 | hidrat'ta saklayın |
| Merck | G5889 | RT'de saklayın | |
| Magnezyum klorür hekzahidrat | Merck | M2670 | RT |
| Oligomisin'de | Merck | O4876 | mağazası -20 derece; C |
| Palmitoil-DL-karnitin klorür | Merck | P4509 | -20 ° C'de saklayın; C |
| Potasyum hidroksit | Merck | 484016 | RT'de mağaza |
| Potasyum fosfat monobazik | Merck | P5655 | |
| Rotenone | Merck | R8875'te | mağaza -20 &° 'de; C |
| Denizatı Dalga Masaüstü Yazılımı | Agilent teknolojileri | ||
| Seahorse XFe96 Analizöründen | Agilent teknolojileri | ||
| Denizatı XFe96 FluxPak | Agilent teknolojileri | 102416-100 | XFe96 sensör kartuşları ve XF96 hücre kültürü mikroplakaları |
| Sodyum piruvat | Merck | P2256 | 2 - 8 ° C'de saklayın; C |
| Sodyum süksinat dibazik hekzahidrat | Merck | S2378 | RT'de mağaza |
| Sükroz | Merck | S7903 | RT Water'da mağaza |
| Merck | W3500 | RT'de mağaza | |
| XF kalibrant | Agilent teknolojileri | 100840-000 | RT XF'de mağaza |
| Plazma membran geçirgenleştirici | Agilent teknolojileri | 102504-100 | Rekombinant perfringolizin O (rPFO) - Aliquot ve -20 ° C'de saklayın; Ç |
Kaynaklar
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondria....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
