Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Mikro plaka bazlı respirometri, küçük bir örneklem boyutunun hücresel solunumunun incelenmesini sağlayarak mitokondriyal araştırmalarda devrim yaptı¹. Hücresel solunum genellikle mitokondriyal fonksiyonun veya 'işlev bozukluğunun' bir göstergesi olarak kabul edilir, ancak mitokondriyal fonksiyon aralığı enerji üretiminin ötesine uzanır². Aerobik koşullarda mitokondriler, bu substratları parçalayarak ve sitrik asit döngüsünü körükleyebilecek metabolik ara parçalara dönüştürerek farklı substratlarda depolanan enerjiyi çıkarır³ (Şekil 1). Substratların sürekli akışı, sitrik asit döngüsünün akışının, iç mitokondriyal membran boyunca proton gradyanı üreten elektron taşıma zincirine elektronlar sağlayan ve ATP-synthase'in ADP'yi ATP^4'efosforilasyon yapmasını sağlayan yüksek enerjili 'elektron donörleri' üretmesi için gereklidir. Bu nedenle, mitokondriyal solunumu test etmek için deneysel bir tasarım, örnek doğayı (bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondriler) ve mitokondriyal substratları içermelidir.

Hücreler yerli substratların bir deposu tutar⁵ve mitokondri aynı anda çeşitli substrat türlerini oksitler⁶, bu da sağlam hücreler üzerinde yapılan deneylerden elde edilen sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Seçilen bir substratı oksitlemek için mitokondriyal yeteneği araştırmak için yaygın bir yaklaşım mitokondri izole etmek veya araştırılan hücrelerin dengesini sağlamaktır⁵. İzole mitokondri nicel çalışmalar için ideal olsa da izolasyon süreci zahmetlidir. Büyük numune boyutu ihtiyacı, verimin saflığı ve tekniğin tekrarlanabilirliği gibi teknik zorluklarla karşı^{karşıyadır 5}. Permeabilize hücreler mitokondriyal izolasyonun dezavantajları için bir çözüm sunar; bununla birlikte, deterjan doğasının rutin permeabilize edici ajanları spesifik değildir ve mitokondriyal membranlara zarar verebilir⁵.

Rekombinant perfringolysin O (rPFO) seçici plazma membran permeabilizasyon ajanı⁷olarak sunuldu ve çeşitli çalışmalarda hücre dışı bir akı analizörü ile birlikte başarıyla kullanıldı 7^,8,9,10. XFe96 hücre dışı akı çözümleyicisi kullanarak mitokondriyal substrat akısını taramak için rPFO kullanarak bir protokol değiştirdik. Bu protokolde, iki hücresel fenotipte dört farklı substrat oksitleyici yol, test edilen her malzeme için yeterli çoğaltma ve uygun kontrole sahipken karşılaştırılır.

1. Testden bir gün önce

1. Reaktiflerin ve substratların hazırlanması.
   1. Mitokondriyal test çözümü (MAS): Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm reaktiflerin stok çözümlerini hazırlayın. Mannitol ve sakkaroz stoklarını tamamen çözünmesi için 37 °C'ye ısıtın. 2x MAS hazırlamak için reaktifleri karıştırın, ardından karışımı 37 ° C'ye ısıtın. pH'ı 5N KOH ile 7,4 (~7 mL) olarak ayarlayın, ardından hacmi 1 L'ye kadar getirmek için su ekleyin.
   2. Sığır serum albümini (%5 BSA): 5 g BSA'yı 90 mL önceden ısıtılmış steril suda manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün ve titremekten kaçının. 5 N KOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından hacmi 100 mL'ye çıkarmak için su ekleyin. Aliquotları ölçüm gününe kadar -20 °C'de filtreleyin ve saklayın.
   3. Mitokondriyal substratlar: Steril suda sodyum süksinat, sodyum piruvat ve sodyum glutamat 1 M stok çözeltileri hazırlayın. Steril suda 100 mM sodyum malat stok çözeltisi hazırlayın ve palmitoil karnitin 10 mM stok çözeltisi hazırlamak için önceden ısıtilmiş steril su kullanın. Her çözeltinin pH'ını 7,4'e 5 N KOH'a ayarlayın ve filtre sterilize edin. Substratları 2-8 °C'de saklayın. Kullanım sırasında, herhangi bir çökeltmeyi çözmek için 37 ° C'ye ılık palmitoil karnitin. Daha sonra kullanmak için, piruvat hariç tüm substratların aliquotlarını -20 °C'de saklayın.
   4. Mitokondriyal inhibitörler: 25 mM oligomisin, 50 mM karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) fenilhidrozon (FCCP), 20 mM rotenon ve 20 mM antimisin A stok çözeltileri hazırlamak için dimetil sülfit (DMSO) kullanın.
2. Hücrelerin tohumlama ve tedavi: Şekil 2'degösterildiği gibi, hücreleri sütun 2-11'de tohumlama. Arka plan kuyuları olarak hizmet vermek için sütun 1 ve 12 boş bırakılmalıdır. Bu çalışmada HepG2 ve A549 hücreleri kullanılmıştır.
   1. Hücreleri kuyu başına 20.000 hücre yoğunluğunda tohumla. Tohumlama için 50-80 μL hücre kültürü ortamı kullanın.
   2. Boş kuyuları eşit hacimli hücre kültürü ortamıyla doldurun ve hücreleri% 5 CO₂ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın. Hücrelerin 3-4 saat boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından tüm kuyulara 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin.
   3. Bu son orta ilave ile tedaviyi 7-11 kolonlarında uygulayın. Bu çalışmada deney grubuna 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür, kontrol grubuna ise araç kontrolü olarak eşit hacimde steril damıtılmış su arıtılmış.
3. Sensörlerin nemlendirilmesi: Pipet 200 μL kuyu başına steril su şebeke plakasına, ardından sensörleri suya batırırken sensör kartuşunu dikkatlice geri verin. Kartuşu ertesi güne kadar 37 °C'de CO₂içermeyen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
4. Tahlil protokolü şablonu: Çözümleyiciyi (bkz. Malzeme Tablosu)ve denetleyici ünitesini açma. Cihaz kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın ve tablo 2'deaçıklandığı gibi test protokolünü tasarlayın. Grup Tanımlarıaltında, A Bağlantı Noktasının enjekte edilen substrata göre farklılık gösterdiği dört enjeksiyon stratejisi oluşturun (Şekil 3). Stratejileri alt tabakalardan veya kısaltmalarından sonra adlandırın.
5. B, C ve D bağlantı noktalarına sırasıyla oligomisinin, FCCP'nin ve rotenon/antimisinin A bileşiklerini atayın. Sekiz grup oluşturun ve şekil 4'tegösterildiği gibi adlandırın. Plaka Haritası altında grupları ilgili kuyulara atayın, ardından protokolü kullanıma hazır şablon olarak kaydedin. Sıcaklığın gece boyunca dengelenmesi için analizörü açık bırakın. Ani sıcaklık değişikliklerini önlemek için analizörü sabit bir sıcaklığa sahip bir yerde tutun.

2. Tahlil günü

1. Suyun kalibrantla değiştirilmesi: Suyu şebeke plakasından ve pipetten 200 μL önceden uyarılmış kalibrantın kuyu başına yardımcı plakaya atın. Kartuşu test zamanına kadar CO₂içermeyen inkübatöre geri verin. Kalibratörün hızlı buharlaşmasını önlemek için, inkübatörün içinde bir nem kaynağı sağlayın ve fan hızını kapatın veya minimuma küçümseyin.
2. Çalışma çözümlerinin hazırlanması: 2x MAS, %5 BSA ve steril suyu 37 °C'ye ısıtarak başlayın. Bu arada, inhibitör stoklarının oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Tablo 3'teaçıklandığı gibi substratların ve inhibitörlerin çalışma konsantrasyonunun 5 mL'sini hazırlamak için ılık 2x MAS ve steril damıtılmış su kullanın.
3. Enjeksiyon portlarının yüklenmesi: Şekil 3'tegösterildiği gibi, substratların 20 μL'sini A limanına yükleyin. Tüm plaka için, 22 μL oligomicin preparatı ile B portu, 25 μL FCCP hazırlığı ile C limanı ve 27 μL rotenon / antimisicin A karışımı ile D bağlantı noktası yükleyin.
4. Kalibrasyon adımını başlatma: Test Çalıştır sekmesi altında, tahlilleri başlatmak için Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Yüklü sensör kartuşunu takın ve kalibrasyon adımını başlatın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin.
5. Tahlil ortamının hazırlanması (MAS-BSA-rPFO): Test ortamının 20 mL'sini hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüpte 10 mL 2x MAS, 9,2 mL steril su ve %5 BSA'nın 0,8 mL'sini karıştırın. 1 nM konsantrasyon elde etmek için 2 μL 10 μM rPFO ekleyin ve karışımı hafif pipetleme ile yeniden dürt. Titremekten kaçının ve karıştırmak için bir girdap karıştırıcı kullanmayın. Tüpü kullanım zamanına kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
6. Hücrelerin yıkanması: Hücreleri ve boş boş kuyuları çok kanallı pipet kullanarak önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. Hücre kültürü ortamını atmak ve PBS eklemek için aynı ipuçlarını yeniden kullanmaktan kaçının. Hücrelerin hava akımı tarafından kurumasını korumak için laminar akışının dışında bu adımı gerçekleştirin.
7. Test ortamında hücre permeabilizasyonu: Çok kanallı pipet kullanarak PBS'yi atın ve önceden ısınmış test ortamının (MAS-BSA-rPFO) 180 μL ile değiştirin.
8. Ölçüme başlama: Permeabilizasyondan hemen sonra, kalibre edilmiş sensör kartuşunun ana plakasını hücre plakasıyla değiştirin ve ölçüme başlayın.

Değerleri oksijen tüketim oranı yüzdesi (OCR%) olarak göstermek için sonuçları ikinci taban çizgisi solunum ölçümüne normalleştirerek başlayın. Tahlil sonuçları Şekil 5, Şekil6 , Şekil 7ve Şekil 8 'de gösterilmiştir. Her grup için uygun arka plan kuyularını atamak ve diğer grupların arka plan kuyularını devre dışı bırakmak önemlidir. Şekil 5, tedavi edilen grubun süksinada indüklenen solunum oranının daha yüksek olduğunu göstermektedir. A549 hücrelerinin metformin tedavisine yanıtı (Şekil 5A) HepG2 hücrelerinden daha yüksekti (Şekil 5B). Arka plan kontrol kuyuları yalnızca karşılaştırılan grubun aynı sıralarından gelen kuyulardı, bu durumda A1, B1, A12 ve B12 kuyuları. Şekil 6'da piruvat/malat kaynaklı solunumdaki değişiklikler gösterlenmiş. Şekil 7 glutamat/malat kaynaklı solunumdaki değişiklikleri, Şekil 8 ise palmitoil karnitin/malat kaynaklı solunumdaki değişiklikleri göstermektedir.

Şekil 1: Sitrik asit döngüsünün şematik bir gösterimi. Mitokondriyal substrat akısını test etmek için kullanılan substratlar kırmızı rencidedir. Malat tek başına kullanılmaz, ancak piruvat, palmitoil karnitin ve glutamat ile birlikte kullanılır. Pyruvate/malat ve palmitoyl karnitin/malat kaynaklı solunumda malatın rolü, malat dehidrojenaz enziminin etkisiyle oksaloasetat sağlamaktır. Glutamat/malat kaynaklı solunumda, malat malat-aspartat mekiğinde yer alır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hücre kültürü mikro plakasındaki hücre tohumlama planının çizimi. 1 ve 12 sütunlarındaki boş kuyular hücresiz boş bırakılmalıdır. 7-11. sütunlar deney grubunu tedavi etmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Enjeksiyon stratejisinin çizimi. A ve B satırlarının A portu süksinit/rotenon karışımı ile yüklenir. C ve D satırlarının A portu piruvat/malat karışımı ile yüklenir. E ve F satırlarının A portları glutamat/malat karışımı ile yüklenir. G ve H sıralarının A portları palmitoil karnitin/malat karışımı ile yüklenir. Tüm plaka için B, C ve D portları sırasıyla oligomisin, FCCP ve rotenon/antimisin A ile yüklenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Grup adları ve plaka haritası. Her grup fenotipe (kontrol veya tedavi) ve solunumu teşvik etmek için kullanılan substrata göre adlandırılır. (S), süksinit kaynaklı solunum. (P/M), piruvat/malat kaynaklı solunum. (G/M), glutamat/malat kaynaklı solunum. (CP/M), palmitoil karnitin/malat kaynaklı solunum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Süksinit kaynaklı solunum. (A) A549 ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları A1, B1, A12 ve B12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Pyruvate/malate bağlı solunum. ( A )A549ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları C1, D1, C12 ve D12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Glutamat/malat kaynaklı solunum. ( A )A549ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları E1, F1, E12 ve F12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Palmitoyl karnitin/malat kaynaklı solunum. ( A )A549ve (B) HepG2. Test edilen gruba 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür uygulandı. Düzeltme için yalnızca arka plan kuyuları G1, H1, G12 ve H12 kullanılır. Sonuçlar SD'± ortalama OCR% olarak gösterilir. Grafik ve plaka ızgarası, test tasarımı, veri analizi ve dosya yönetimi yazılımı tarafından görüntü dosyaları olarak oluşturulmuş ve dışa aktarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Mitokondriyal test çözümü. Hazırlamak için her bileşen stok çözeltisinin belirtilen hacmini karıştırın (2x MAS). Çözeltiyi 37 °C'ye ısıtın, ardından 5 N KOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Hacmi 1 L'ye kadar getirmek için damıtılmış su ekleyin filtreleyin ve ardından aliquotları -20 °C'de saklayın. 2x MAS kullanarak mitokondriyal substratların ve inhibitörlerin tahlil orta ve çalışma çözümlerini hazırlayın.

Tablo 2: Test protokolünün komutları.

Tablo 3: Daha önce Şekil 3'teanlatıldığı gibi sensör kartuşlarının enjeksiyon portlarına yüklenecek mitokondriyal substratların ve inhibitörlerin listesi. Her bir substratın veya inhibitör karışımının çalışma konsantrasyonunun 5 mL'lik kısmını hazırlamak için stok çözeltilerinden, 2x MAS'tan ve damıtılmış sudan belirtilen hacimleri karıştırın. Enjeksiyon işleminden sonra kuyularda son konsantrasyon elde edilir.

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.