Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

3.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

20 Eylül 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Bu makalede

Özet

Multipleks in situ hibridizasyon (ISH), yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki G protein bağlantılı reseptör ve bir transkripsiyon faktörü için transkriptleri aynı anda görselleştirmek için kullanıldı. Bu protokol, vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.

Özet

Bu çalışmada, fare juguler-nodose gangliyonunun multipleks in situ hibridizasyonu (ISH) için bir protokol açıklanmaktadır ve özellikle G protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) ekspresyonunu tespit etmeye vurgulanmaktadır. Formalin-sabit juguler-nodose gangliyonları, iki temsili GPCR'nin (kolesistokin ve ghrelin reseptörleri) ifadesini nodose (eşleştirilmiş homeobox 2b, Phox2b) veya juguler afferent nöronların (PR etki alanı çinko parmak proteini 12, Prdm12) bir işaret geni ile birlikte aynı anda tespit etmek için RNAscope teknolojisi ile işlendi. Etiketli gangliyonlar, yukarıda belirtilen transkriptlerin dağılım ve ifade kalıplarını belirlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Kısaca, Phox2b afferent nöronların kolesistokinin reseptörü (Cck1r) bolca ifade edildiği, ancak ghrelin reseptörü (Ghsr) ifade etmediği bulunmuştur. Prdm12 afferent nöronlarının küçük bir alt kümesinin de Ghsr ve/veya Cck1r'i ifade ettiği bulunmuştur. Bu makalede açıklanan yaklaşım, bilim adamlarının vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmalarına yardımcı olabilir.

Giriş

Vagal afferentlerin hücre gövdeleri juguler, petrosal ve nodose gangliyon1,2,3'te bulunur. Aksonları vagus sinirinin birkaç dalı aracılığıyla kraniyoserikal, torasik ve abdominal bölgelere birlikte seyahat eder4,5,6,7. İçsel uçlarından, vagal afferentler çok çeşitli fizyolojik ve zararlı uyaranlara yanıt verebilir8,9,10. Bununla birlikte, vagal algılamada yer alan sinyal moleküllerinin ve reseptörlerin dağılımı kötü karakterize olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni kısmen vagal gangliyonların, küçük boyutlarına rağmen, çok sayıda GPCR 8 , 11 , 12,13dahil olmak üzere geniş bir reseptör spektrumunu ifade etmeleridir. Ayrıca, vagal afferent nöronlar doğası gereği heterojendir ve farklı moleküler profiller görüntüler14. Konuyu karmaşıklaştırmak için, juguler, petrosal ve nodose gangliyonları fareye bağlanır ve böylece tek bir gangliyonik kütle oluşturur. Son olarak, hayvanların bir alt kümesinde, nodose ganglionu sempatik üstün servikal ganglion15'e bağlanır.

Geçmişte, araştırmacılar vagal afferent nöronların nörokimyasal makyajını incelemek için immünhistokimyaya başvurdular16,17,18. Doğrulanmış antikorların kullanılması immünostokimya yararlı olmakla birlikte, immünohistokimyasal çalışmaların sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. Örneğin, GPCR'lere karşı spesifik antikorları tanımlamaya yönelik çok sayıda çaba başarısız oldu19,20,21 , 22,23,24,25, araştırmacıların GPCR'lere karşı antikorların çoğunluğunun güvenilmez olduğu sonucuna varmasına yol açtı. Bu sorunları atlatmak için, kemirgen vagal gangliyonik kütle26 , 27 , 28,29gen ekspresyonini değerlendirmek için nicel PCR (qPCR) yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, qPCR kullanılarak gen ekspresyonunun incelenmesi, mekansal bilgi kaybı pahasına gerçekleşir. Özellikle, kaç hücrenin veya hangi hücre tiplerinin belirli bir ilgi genini (örneğin, nodose ve juguler hücreler) ifade ettiği tahmin edilemez. Tekrarlayan sorunlar ayrıca bitişik dokularla kontaminasyon ve diseksiyon sırasında vagus sinirinin değişken uzunluklarının, üstün servikal ve juguler gangliyonların dahil edilmesini içerir15. Yukarıdaki zorlukların bir sonucu olarak, tartışmalar vagal afferent nöronlarda birkaç GPCR'nin ekspresyon ve dağılımını çevreler. Özellikle şaşırtıcı bir örnek ghrelin reseptörü (Ghsr) ile ilgilidir. Bazı çalışmalar vagal afferent nöronlarda bu reseptörün yaygın ekspresyonunun30,31,32, diğerleri Ghsr mRNA'nın nodose ganglion 11,14'teneredeyse tespit edilemediğini bulmuşlardır. Bu nedenle vagal gangliyonik kütlede Ghsr mRNA'nın ayrıntılı haritalandırılması garanti edilir.

In situ hibridizasyon (ISH) vagal gangliyonik kütle7, 11 ,12,33,34,35gen ekspresyon kalıplarını değerlendirmek için de kullanılmıştır. RNA tabanlı teknikler çoğu durumda antikor bazlı tekniklerden daha güvenilir ve spesifik kaldığından36,37, ISH çalışmaları vagal afferent nöronların nörokimyasal kodlamasının daha iyi anlaşılması için değerli olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, geleneksel ISH tekniklerinin kendileri uyarı olmadan değildir. Radyoaktif ISH hassastır, ancak arka plan oluşturur ve hantalkalır 38. Radyoaktif olmayan ISH daha az karmaşık ama aynı zamanda daha az hassas38. Buna karşılık, son zamanlarda geliştirilen RNAscope ISH yöntemi son derece hassastır ve en az arka planoluşturur 39. Mevcut çalışma, farenin vagal afferent nöronlarında GPCR'lerin tespitine multipleks floresan RNAscope uyguladı. Ghsr'nin dağılımını haritalamaya odaklandık ve dağıtımını nodose ganglion34'teifade edildiği bilinen başka bir GPCR olan kolesistokinin reseptörü (Cck1r) ile karşılaştırdık. Son olarak, eşleştirilmiş homeobox 2b (Phox2b) ve PR etki alanı çinko parmak proteini 12 (Prdm12) olmak üzere iki transkripsiyon faktörü, nodose ve juguler afferent nöronlar için seçici belirteçler olarak kullanılmıştır, sırasıyla14. Phox2b veya Prdm12'yi görselleştirmeden, jugular vs. nodose afferentlerini kesin olarak tanımlamak zor olacaktır. Makale boyunca potansiyel teknik tuzaklar da tartışılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu çalışmada kullanılan fareler saf C57BL/6J arka plan üzerinde vahşi tip erkeklerdi. Multipleks ISH için toplam 4 fare kullanıldı. Tüm fareler kurban sırasında yaklaşık 8 haftalıktı. Yaşlanma ile ilişkili endojen floresan göstermek için bir erkek fare (yaklaşık bir yaşında) da kullanılmıştır. Hayvanlar, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan bir bariyer tesisi içinde havalandırmalı kafeslerde barındırıldı. UT Southwestern Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi aşağıda açıklanan prosedürleri gözden geçirdi ve onayladı. Reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosu 'ndabulunabilir.

1. Örnek toplama

  1. Kurban gününde, farelere aşırı dozda kloral hidrat (500 mg / kg, yani) sürün. Derin uyuşturulmuş fareleri, 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından oda sıcaklığında% 10 formalin 50 mL ile peristaltik bir pompa kullanarak transkardiyöz olarak perfüzyona maruz kalın.
    NOT: Bu, formalinin solunmasını önlemek için duman kaputunda yapılır.
  2. Nodose, petrosal ve juguler gangliyonlar farede tek bir gangliyonik kütle oluşturmak için kaynaştıkça15, tüm vagal gangliyonik kütleyi bir diseksiyon kapsamı ve ince yay makası ve forseps yardımıyla her iki taraftan (sol ve sağ) dikkatlice toplayın (Bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Farenin kafasını bir çift büyük makasla kıtırken (Malzeme Tablosunabakın), beyin sapının ezilmemesi gerekir.
  4. Sıçanda daha önce açıklanan bir diseksiyon yaklaşımını takiben40, oksipital kemiği ortaya çıkarmak için sternohyoid ve omohyoid kasları küçük önpslerle(Malzeme Masası)nefes borusuna yanal olarak çıkarın. Şahdamar, vagus siniri, hipoglossal sinir ve foramen magnum görünene kadar tüm bölgeyi kas, yağ dokusu ve konjonktif dokudan temizleyin. Tüm hipoglossal siniri küçük yay makası(Malzeme Masası)ile kesin.
  5. Nodose ganglion'un foramen magnum15'eyakın yarı saydam bir kütle olarak arayın. Küçük makas kullanarak (Malzeme Masası), juguler ganglionu daha fazla ortaya çıkarmak için oksipital kemiği dikkatlice kırın. Görsel bir dönüm noktası olarak şahdamarının yüzeyinde siyah melanositler arayın.
  6. Vagal gangliyonik kütle arasındaki sinir bağlantılarını kesin ve küçük yay makası(Malzeme Masası)ile beyin sapına doğru şahdamarını keserken vagus sinirinin periferik ucunun üzerine hafifçe çekerek tüm gangliyonik kütleyi çıkarın.
  7. Vagus sinirine ve gangliyonik kütleye yapışan konjonktürel dokuyu ve yağı mümkün olduğunca çıkarın.
  8. Bir tüpten diğerine transfer sırasında bir ganglionu kaybetmek kolay olduğundan, numunelerin işlenmesini ve lokalizasyonunu kolaylaştırmak için vagus sinirinin ~ 0,5 cm'ini saklayın.
  9. Gangliyonları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ince forseps yardımıyla yerleştirin ve formalin içinde 4 °C'de 24 saat ve 24 saat boyunca% 30 sakkarozla kuluçkaya yatırın.
  10. Gangliyumu bir parça alüminyum folyo üzerine optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamının küçük bir damlasının (~4 mm Ø) içine yerleştirin. Ardından, numuneyi kuru buz yatağında dondurun.
  11. Örnekleri -20 °C'de kriyostatla 14 μm kalınlığında bölümlere kesin ve cam mikroskop slaytlarında 3 seri 42 μm aralıklarla toplayın.
    NOT: Bölümleri slaydın kenarlarına yakın yerleştirmekten kaçının. Reaktifleri kaydetmek için, doku bölümlerini mümkün olduğunca sıkı bir şekilde paketlenin, ancak üst üste binmeden tutun.
  12. Numuneleri -80 °C dondurucuda en az 6 ay boyunca ISH için gerekli olana kadar saklayın.
    NOT: Endojen floresan sorunlarını gidermek için Şekil 1'e bakın.

2. Ön işlem ve ISH

  1. Deneyler gününden önce, bulaşıkları boyamak ve tampon kavanozları yıkamak da dahil olmak üzere ISH için kullanılacak laboratuvar camlarını otoklavlayın.
    NOT: RNase içermeyen koşullar altında çalışmak kritik olmasa da, her zaman eldiven giyin. Kontaminasyondan şüphelenilme durumunda RNase dekontaminasyon çözelti şişelerini(Malzeme Masası)ulaşılabilecek bir yerde tutun.
  2. İlk gün, slaytları özellikle ISH'ye adanmış bir bankta oda sıcaklığına getirin. Slaytları 1x PBS'de durulayın ve bir fırın fırınında(Malzeme Masası)60 °C'de 30 dakika pişirin.
  3. Slaytları 4 °C'de 15 dakika boyunca % 4 formalin olarak sabitleyin.
  4. Multipleks kitteki reaktifleri(Malzeme Masası)oda sıcaklığına getirin.
  5. Slaytları her biri 5 dakika boyunca% 50, % 70 ve% 100 etanolde susuz bırakır. Numunelere10dakika boyunca H 2 O2 çözeltisi uygulayın ve ardından çift damıtılmış suda durulayın (ddH2O).
  6. Numuneleri hedef alma reaktifi ile 5 dakika boyunca tedavi edin, ddH2O'da durulayın ve ardından% 100 etanol ve hava kuru. Hidrofobik bir kalem kullanarak, numunelerin etrafında bir bariyer oluşturun.
    NOT: Hidrofobik bariyeri doku bölümlerine çok yakın uygulamayın.
  7. Bir hibridizasyon fırınına(Malzeme Masası)40 °C'de 30 dakika proteaz uygulayın.
  8. Bu arada, probları 40 °C'de önceden ısıtın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Bir hibridizasyon fırınında 40 °C'de 2 saat boyunca hedef probların (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; veya Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) istenen kombinasyonuyla slaytları kuluçkaya yatırın.
  9. Hibridizasyon fırınında 40 °C'de 2 saat boyunca dihidrodipikolinat redüktaz (DapB) hedef C1 probu ile negatif kontrol dokusunu kuluçkaya yatırın.
  10. Slaytları yıkama tamponunda durulayın ve oda sıcaklığında 5x salin sodyum sitrat (SSC) içinde gece boyunca saklayın. Kolaylık sağlamak için deneyi iki güne bölün. Ertesi gün, slaytları yıkama tamponu ile durulayın ve aşağıda listelenen amplifikasyon reaktifleriyle kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosu'ndakikullanım kılavuzuna bakın).
  11. AMP1 (40 °C'de 30 dk), AMP2 (40 °C'de 30 dk) ve AMP 3 (40 °C'de 15 dk) uygulayın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  12. Her Opalboyasını( Malzeme Masası ) dimetil süloksit içinde çözün ve çözeltileri ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
  13. Kanal 1 için, slaytları HRP-C1 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 520 (yeşil renk; seyreltme 1/1.500; 40°C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  14. Kanal 2 için, slaytları HRP-C2 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 570 (sarı renk; seyreltme 1/1.500; 40 °C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  15. Kanal 3 için, slaytları HRP-C3 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 690 (uzak kırmızı renk; seyreltme 1/1.500; 40 °C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  16. Slaytları yıkayın ve 30 s için 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) maruz.
  17. Her kaydırağa hemen montaj ortamı uygulayın ve doku bölümünün üzerine bir kapak kılıfı yerleştirin.
  18. Görüntülemeye kadar dokuları 4 °C'de bir slayt tutucuda yatay tutun.

3. Mikroskopi ve veri analizi

NOT: Multipleks ISH verileri, uygun filtrelere sahip çok çeşitli araçlarla görüntülenebilir. Bununla birlikte, tercih edilen bir görüntüleme yöntemi 20x ve 63x (yağ) hedeflerine sahip konfokal mikroskopidir; nedenlerle tartışmaya bakın. En uygun sinyal-gürültü oranının belirlenmesi için Şekil 2'ye bakın.

  1. 488, 561 ve 633 nm lazer hatları ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın. Aşağıdaki alma parametrelerini kullanın (bkz: Tablo 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, algılama aralığı 668-696 nm, güç 2.0, kazanç 724); Opal 570 (DPSS lazer 561 nm, algılama aralığı 579-627 nm, < güç 15.0,
  2. Görüntülerin kalitesini artırmak için, ortalama 4 çizgi ve en az 1024 x 1024 piksel boyutu elde edin.
    NOT: Yukarıdaki parametreler sadece örnek olarak sağlanmıştır ve değişiklikler bir alete, büyütmeye (20x veya 63x), ifade seviyelerine ve herhangi bir doku için endojen floresan seviyelerine bağlı olarak önerilir.
  3. Edinme parametrelerinden memnun olduktan sonra, aynı ayarları kullanarak görüntüleri toplayın. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için her kanala yanlış renkler atfin.
    NOT: Örneğin, kırmızı (Phox2b veya Prdm12), siyan (Cck1r), sarı (Ghsr) ve gri (DAPI).
  4. Dapi ile hafifçe boyanmış bir çekirdekle RNAscope pozitif profillerin ana hatlarını tanımlayarak dijital görüntüleri kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. Her transkripti ifade eden RNAscope pozitif profillerin yüzdesini hesaplayın [Şekil 3A-C].
  5. Tahminlerin titizliğini ve doğruluğunu artırmak için, en az 4 farklı hayvandan en az 2.000 nöronal profil sayın. Sayım işlemi soldan ve sağdan gangliyonlardan ayrı ayrı gerçekleştirin.
  6. Verileri, toplam sayılan profil sayısıyla bir pasta grafiğe girin.
  7. Görüntüleri elde etmek ve 20x görüntüleri bir araya getirmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Son plakaları oluşturmak için ImageJ-Fiji ve başka bir fotoğraf ve tasarım yazılımı kullanın. Kontrast ve hafiflik ayarlamalarını tüm görüntülere eşit şekilde uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

RNAScope herhangi bir yaştan, cinsiyette veya genetik kökenden hayvanlara uygulanabilirken, genç yetişkinlerle (<3 aylık) çalışmanız önerilir. Bunun nedeni, floresan eserlerin (örneğin lipofuscin) yaşlı hayvanların nöronlarında yaygın bulgular olmasıdır41. Yaşlı farelerden formalin-sabit gangliyon genellikle kolayca gerçek boyama ile karıştırılabilecek şaşırtıcı derecede yoğun endojen floresan içerir (Şekil 1A,B). Her durumda, işlemden önce dokudak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

ISH tekniği 1960'ların sonunda icat edildi42. Ancak, 1980'lerin ortalarına kadar merkezi ve periferik sinir sistemlerinde mRNA'ların tespiti için uygulanmadı43,44. Sinir sisteminin heterojenliği ve antikorlarla ilgili tekrarlayan sorunlar göz önüne alındığında, belirli bir transkriptin hücresel düzeyde lokalize edilmesi paha biçilmez bir araç olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, geleneksel ISH yöntemleri zahmetli ve değişken derecede...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH grant #5P01DK119130-02 tarafından finanse edilen Nöroanatomi/Histoloji/Beyin Enjeksiyon Çekirdeği tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi tarafından desteklenen Harold C. Simmons Kanser Merkezi'nin Ortak Kaynağı olan NIH Grant #1S10OD021684-01 tarafından desteklenen UT Southwestern Canlı Hücre Görüntüleme Tesisi (Dr. Phelps başkanlığındaki) ve personelinin (Abhijit Bugde ve Marcel Mettlen) yardımını kabul etmek istiyor. P30 CA142543.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10xPBS Fisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° C dondurucuPHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobefotoğraf ve tasarım yazılımı
Pişirme fırınıTermo BilimselModel:658
Konfokal mikroskopZeissLSM880 Airyscan
Kapak camıBeyin Araştırma Laboratuvarları2460-1.5D
KriyostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 ForsepsFST11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lmontaj ortamı
HybEZ fırınhibridizasyon fırını
Hidrofobik kalemVektör LaboratuvarlarıH-4000
ImageJ-FijiNIH
Büyük makasHenry Schein100-7561
Mikro santrifüj tüpleriVWR20170-333
Minipump değişken akışlıFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTFloresan biyobelirteç
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTFloresan biyobelirteç
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTFloresan biyobelirteç
ProLong Gold Floresan etiketli hücreler için
RNAscope Multipleks Floresan Reaktif Kiti v2ACD /Bio-Techne323100multipleks kiti
RNAscope probu Fare Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
RNAscope probu Fare DapBACD /Bio-Techne310043
RNAscope probu Fare GhsrACD /Bio-Techne
RNAscope probu Fare Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
RNAscope probu Fare Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase dekontamine edici solüsyon
Küçük diseksiyon makasıMillipore SigmaZ265977
Superfrost Plus slaytlarıFisherbrand1255015
Doku Tek OCT ortaSakura4583
Kullanım kılavuzuACD323100 USM
Vannas Yaylı MakasRobozRS 5620
ZEN Görüntüleme YazılımıZeiss
Antifade Mountant montaj ortamı426141

Kaynaklar

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

G Protein Kenetli Resept rlerMultipleks ISHJuguler Nodoz GanglionlarRNAscope TeknolojisiKonfokal MikroskopiKolesistokinin Resept rGhrelin Resept rPhox2b Mark r
Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.