E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Summary

Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Abstract

Ubiquitin, ubiquitin-proteazom sisteminin temel bir bileşeni olan küçük bir 8.6 kDa proteinidir. Sonuç olarak, yüksek özgüllüğe ancak düşük benzeşime sahip çeşitli proteinler dizisine bağlanabilir. Faj ekranı sayesinde, ubiquitin varyantları (UbV'ler) wildtype ubiquitin üzerinde gelişmiş benzeşim gösterecek ve hedef proteinlere bağlayıcı özgüllüğü koruyacak şekilde geliştirilebilir. Faj ekranı, filamentli bir M13 bakteriyofajının pIII kat proteininin (faj yüzeyinde harici olarak görüntülendiği için seçilir) UbV'lerle kaynaştırıldığı bir fajmid kütüphanesi kullanır. İnsan wildtype ubiquitin'in spesifik kalıntıları yumuşak ve randomizedir (yani, yerel wildtype dizisine karşı bir önyargı vardır), böylece hedef proteinle yeni etkileşimleri teşvik etmek için gerekli çeşitliliği tanıtırken protein uyumundaki zararlı değişikliklerden kaçınılır. Faj görüntüleme işlemi sırasında, bu UbV'ler faj kat proteinleri üzerinde ifade edilir ve görüntülenir ve ilgi çekici bir proteine karşı tavalanır. Hedef proteinle olumlu bağlayıcı etkileşimler gösteren UBV'ler korunurken, zayıf bağlayıcılar yıkanır ve kütüphane havuzundan çıkarılır. UbV'nin karşılık gelen fajmidini içeren faj parçacığına bağlı tutulan UbV'ler, başka bir faj ekranında aynı hedef proteine karşı panned edilebilmeleri için eluted, amplified ve konsantre edilir. Tipik olarak, beş adede kadar faj ekranı gerçekleştirilir ve bu sırada zayıf ve/veya karışık bir şekilde bağlanan UBV'lere karşı güçlü bir seçim baskısı uygulanır, böylece daha yüksek yakınlıkları olanlar konsantre edilir ve zenginleştirilir. Sonuç olarak, hedef protein için wildtype meslektaşlarından daha yüksek özgüllük ve/veya benzeşim gösteren UbV'ler izole edilir ve daha fazla deneyle karakterize edilebilir.

Introduction

Protein-protein etkileşimlerinin moleküler ayrıntılarını anlamak, özellikle klinik olarak önemli hastalıklara katkıda bulunan biyolojik süreçlerin sinyal transdüksiyon mekanizmalarını suçlu bulmak için kritik öneme sahiptir. Son yıllarda, faj görüntüleme, protein-protein etkileşimlerinin hücre içi probları olarak kullanılabilen istenen bir hedef proteine çok daha iyi bağlanmış proteinleri / peptitleri izole etmek için pratik ve erişilebilir bir yöntem olarak ^{kullanılmaktadır1,2,3,4}.

Ubiquitination, ubiquitin'i (Ub) bozulma veya hücre sinyal değişikliklerine aracılık etmek için protein substratlarına kovalent olarak eşleyen enzimatik faaliyetlerin (E1 aktive enzim → E2 konjugating enzimi → E3 ligazyonları) bir çağlayanıdır. Ek olarak, deubiquitinases, ubiquitin'in proteinlerden uzaklaştırılmasını katalİze eder. Bu nedenle, hücrelerde, büyük çoğunluğu büyük ve çeşitli yüzeylerde zayıf etkileşimlere izin vermek için düşük benzeşimli ancak yüksek özgüllüğe sahip ortak bir yüzeyi tanıyan binlerce Ub bağımlı protein-protein etkileşimi vardır.

Ernst ve arkadaşları, Ub'in bilinen bağlayıcı bölgelerine mutasyonlar getirdi ve hala yüksek seçiciliği korurken ilgi çekici bir protein için bağlayıcı yakınlığı artırıp artıramayacağını görmek ^için5. Bilinen Ub-protein etkileşimlerine aracılık eden Ub yüzeyindeki pozisyonlarda mutasyonlara sahip 10 milyardan fazla (7,5 x ¹⁰¹⁰) Ub varyantından (UbV) oluşan bir kombinatoryal kütüphane geliştirildi. Bu kütüphane, çeşitlendirilmiş UbV'lere kaynaşmış M13 bakteriyofaj pIII kat proteinini ifade eden fajmidlerden oluşuyordu. Bu nedenle, bireysel UbV'ler ifade üzerine kat proteini aracılığıyla faj yüzeyinde görüntülenebilir. Seçim sürecinde, hedef proteinle önemli bağlayıcı etkileşimlere sahip UbV'leri görüntüleyen fajlar sonraki faj görüntüleme turlarında tutulacak ve zenginleştirilecek, hedef proteine zayıf bağlanan UbV'leri gösteren faj ise yıkanarak faj havuzundan çıkarılacaktır. Tutulan faj parçacıkları, görüntülenen UbV'lerine karşılık gelen fajmidi içerir ve izole edildikten sonra sıralanmalarını ve daha fazla karakterize olmalarını sağlar.

Bu protein mühendisliği stratejisi kullanılarak, UbV inhibitörleri insan deubiquitinases5 ve viral proteazes6 için geliştirilmiştir. Daha da önemlisi, E2-bağlama sitesini ele geçirerek ve HECT etki alanında Ub bağlayıcı bir dış kaplamayı işgal eden UbV'leri etkinleştirerek insan HECT ailesi E3 bağları için inhibitör UbV'ler ^oluşturduk7. Ayrıca E2 bağlama bölgesini hedefleyerek monomerik RING ailesi E3'leri inhibe edebilir ve homodimerik RING E3s8'i etkinleştirmek için UbV dimerizasyonunu teşvik edebiliriz. Çok alt üne sahip RING E3'ler için, UbV'ler RING alt birimini (örneğin, APC/C ^kompleksi9 için) hedef alarak veya karmaşık oluşumu bozarak (örneğin, SCF ^E3s10 için) inhibisyon elde edebilir. Toplu olarak, UbV'ler, Ub-proteazom sistemindeki (UPS) protein-protein etkileşimlerini sistematik olarak sorgulamak için kullanılabilir, böylece UPS enzimlerinin biyokimyasal mekanizmalarını daha iyi deşifre edebilir ve terapötik müdahale için fonksiyonel bölgeleri belirleyebilir ve doğrulayabiliriz.

Aşağıdaki protokol, ilgi çekici bir proteini hedeflemek için daha önce oluşturulmuş bir faj görüntülenen UbV kütüphanesinin nasıl kullanılacağını ve ardışık faj görüntüleme turları aracılığıyla hedef proteinle etkileşime giren UbV bağlayıcılarının nasıl zenginleştirilerek zenginleştirilmeyi açıklar.

Protocol

1. Reaktif hazırlama

1. PBS (fosfat tamponlu salin): 50 mL 10x PBS çözeltiyi 450 mL ultra saf _H2O ile karıştırın.
2. BSA (sığır serum albümini): 7 mL ultra saf _H2O'ya yavaşça 1 g BSA ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). Son ses seviyesi 10 mL olana kadar ultra saf _H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
3. PB tamponu (%1 BSA ile desteklenmiş PBS): Yavaşça 400 mL ultra saf _H2O'ya 5 g BSA ve 50 mL PBS ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). Son ses seviyesi 500 mL olana kadar ultra saf _H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
4. PBT tamponu (PBS% 1 BSA ve% 0.05 Ara 20 ile desteklenmiş): Yavaşça 400 mL ultra saf _H2O'ya 5 g BSA ve 50 mL PBS ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). 250 μL ara 20 ekleyin. Son ses seviyesi 500 mL olana kadar ultra saf _H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
5. PT tamponu (PBS% 0.05 Ara 20 ile desteklenmiş): 1 mL Ara 20'yi 400 mL PBS ile karıştırın. Son ses seviyesi 2 L olana kadar ultra saf _H2O ile yükleme yapın, filtrasyonla sterilize edin ve 4 °C veya oda sıcaklığında (~20-25 °C) saklayın.
6. 2YT suyu: 800 mL ultra saf _H2O'ya 16 g tripon, 10 g maya özü ve 5 g NaCl ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). Son ses seviyesi 1 L olana kadar ultra saf _H2O ile yükleme yapın, otomatik olarak sterilize edin ve oda sıcaklığında (~20-25 °C) saklayın.
7. LB/karbonhidrat plakaları: 400 mL H2O'ya _12,5 g önceden yapılmış LB karışımı ve 7,5 g agar ekleyin. Agarın tamamen çözüldüğünden emin olun ve 60 ° C'nin altına soğumasını bekleyin. 500 μL 100 mg mL karbenisilin ekleyin, iyice karıştırın ve plakaya dökün. 4 °C'de saklayın.
8. LB/tet plakaları: 400 mL ultra saf _{H2O'ya 12,5} g önceden yapılmış LB karışımı ve 7,5 g agar ekleyin. Agar'ın tamamen çözüldüğüne emin olun ve 60 °C'nin altına soğumasını bekleyin. 500 μL 10 mg mL tetrasiklin ekleyin, iyice karıştırın ve tabağa dökün. 4 °C'de saklayın.
9. PEG (polietilen glikol)/2,5 M NaCl: 200 mL ultra _saf H2O'ya 50 g PEG-8000 ve 36,5 g NaCl ekleyin.
   NOT: Bu biraz zaman alabilir; ısıtma yardımcı olabilir. Son ses seviyesi ₂₅₀ mL olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yap. Filtrasyon veya otoklavlama ile sterilize edin.
10. 0,1 M HCl: 20 mL 1 M HCl'yi 180 mL ultra saf _H2O ile karıştırın.
11. 1 M Tris (pH 11.0): 40 mL ultra saf _H2O'ya 6.1 g Tris tabanı ekleyin. Son ses seviyesi 50 mL olana kadar ultra saf _H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize uğrayın ve oda sıcaklığında (~20-25 °C) saklayın.
12. 100 mg/mL (1000x) karbenisilin: 20 mL ultra _saf H2O'ya 2 g karbenisilin disodium tuzu ekleyin. Filtrasyon ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.
13. 50 mg/mL (1000x) kanamycin: 20 mL ultra _saf H2O'ya 1 g kanamycin sülfat ekleyin. Filtrasyon ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.
14. 10 mg/mL (1000x) tetrasiklin: p etanol 20 mL'ye 0,2 g tetrasiklin hidroklorür ekleyin. Tamamen çözünene kadar karıştırın. Filtrasyon ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.

2. Protein hazırlama

1. Hedef protein stoğunun μM'deki konsantrasyonunu belirleyin. Protein konsantrasyonunu değerlendirmenin en uygun yolu, protein stoğunun emiciliğini 280 nm olarak ölçmektir. Konsantrasyon mg/mL olarak biliniyorsa, hedef proteinin moleküler ağırlığını kullanarak μM'ye dönüştürün. İlgi proteinine bağlı olarak bir dizi yöntem kullanılabilir; ayrıntılar için Tartışma bölümüne bakın.
   NOT: Protein kesilirse (spesifik protein etki alanı/motifi) veya etiketlenmişse, mg/mL'den μM'ye dönüştürürken moleküler ağırlıktaki bu değişiklikleri hesaba katmayı unutmayın.
2. "Yuvarlak 1", "yuvarlak 2/3" ve "yuvarlak 4/5" etiketli üç mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
   1. 800 μL PBS'de 1 μM'ye seyreltmek için gerekli protein hacmini hesaplayın ve pbs eklemeden bu hacmi tüplere aliquot.
      NOT: Mevcut hedef protein miktarı düşükse, konsantrasyon 0,25 μM'ye kadar düşürülebilir.

3. Seçimin birinci turuna hazırlık

1. İkinci tur seçim için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın.
   1. İyi izole edilmiş bir Escherichia coli kolonisi ile 5 mL 2YT / tet aşılayın ve 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 37 ° C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
2. İlk seçim turu için plakayı kapla.
   1. "Yuvarlak 1" tüpteki hedef proteini uygun miktarda PBS ve aliquot 100 μL ile 96 kuyulu bir bağlayıcı plakanın sekiz kuyusuna (yani hedef plakaya) seyreltin.
      NOT: Faya göstergesi, plakanın köşelerindeki kuyular kaplanarak tek bir plaka üzerinde aynı anda dört farklı protein için yapılabilir.
   2. İsteğe bağlı kontrol: Hedef protein GST veya MBP (maltoz bağlayıcı protein) gibi etiketlenmişse, sekiz kuyuyu uygun epitop etiketini içeren 1 μM çözeltinin 100 μL'si ile başka bir 96 kuyu bağlama plakasında kaplar. Bu, özellikle etikete bağlanan istenmeyen fajı kaldırmak için kullanılacaktır.
   3. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 4 °C'de gece boyunca sallama plakaları.

4. Seçimin birinci turu

1. İkinci raundu hazırlayın.
   1. Adım 3.1'den itibaren 200 μL tohum kültürü ile 30 mL 2YT / tet aşıla.
   2. Bakteriler orta kütük fazında olana kadar 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 37 °C'de kuluçkaya yaslanın (_OD600 0.6 - 0.8). Bu yaklaşık üç saat sürer.
2. Hedef plakayı engelle.
   1. Kaplama solüsyonunun plakadan veya bir kontrol plakası yapılmışsa her iki plakayı da bir lavabonun üzerine ters çevirip sallayarak çıkarın. Kağıt havluları kurulayın.
   2. Her iyi kaplanmış kuyuya 300 μL PB tampon ekleyin.
   3. PB arabelleği adım 4.2.1'deki gibi çıkarın ve 200 μL daha PB arabelleği ekleyin.
   4. Oda sıcaklığında (~20-25 °C) 1 saat boyunca 300 rpm yörüngesel sarsıntı ile kuluçkaya yaslanın.
3. Faj kütüphanesini hazırlayın.
   1. Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün ve PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katını seyreltin. Örneğin, kitaplık çeşitliliği 1 x ¹⁰¹⁰ ve kitaplık konsantrasyonu 1 x ¹⁰¹³ ise, konsantrasyon 1 x ¹⁰¹² olacak şekilde kitaplığı seyreltin. Burada kullanılan kütüphaneler için, kütüphanenin 1 mL'si ile 9 mL PBS'yi birleştirerek PBS'de 10 kat seyreltin.
      NOT: Kütüphane çeşitliliği kütüphane oluşturma sırasında belirlenmeliydi ve başka türlü kolayca değerlendirilemez. Kütüphane konsantrasyonu, E. coli hücrelerinin orta kütük fazında (_{OD600 0.6} - 0.8) aşılanması ve LB/karbonhidrat üzerine kaplama yapılmasıyla belirlenebilir.
   2. 1/5 cilt PEG/NaCl ekleyin. Örneğin, daha önce seyreltilmiş kitaplığın 10 mL'si için 2 mL PEG /NaCl ekleyin.
   3. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
   4. 4 °C'de 30 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüj, süpernatantı atın ve kalan süpernatantı aşağı çekmek için 2 dakika boyunca son santrifüj.
      NOT: Tüpü, peleti aynı yerde tutan ilk tüp olduğu gibi ikinci kez aynı yönde rotora koyun, bu nedenle görmeyi kolaylaştırın.
   5. Faj peletini protein başına 1 mL PBT'de hafifçe yeniden diriltin. Dört protein için peleti 4 mL PBT'de yeniden diritin.
      NOT: Pelene dokunmamaya çalışın ve hava kabarcıkları sokmayın.
4. Fajı hedef proteinlere görüntüleyin.
   1. İsteğe bağlı kontrol: Kontrol plakasındaki her kaplamalı kuyuya 100 μL faj kütüphanesi ekleyin. 300 rpm yörüngesel sarsıntı ile 1 saat boyunca oda sıcaklığında (~20-25 °C) kuluçkaya yaslayın ve kütüphaneyi kontrol plakasından hedef plakaya aktarın. Adım 4.4.2'ye atlayın.
   2. PB tamponunu adım 4.2.1'de olduğu gibi hedef plakadan çıkarın ve her bir iyi kaplanmış kuyuya 100 μL faj kütüphanesi ekleyin.
   3. Oda sıcaklığında (~20-25 °C) 1 saat boyunca 300 rpm yörüngesel sarsıntı ile kuluçkaya yaslanın.
5. Bir faj yuvarlak elute.
   1. Faj kütüphanesini çıkarın ve kaplamalı kuyuları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Tabağı ters çevirin ve son damlaları çıkarmak için bir kağıt havluya dokunun.
      NOT: Birden fazla hedef protein tek bir plaka üzerine kaplanmışsa, kuyular arasındaki sonraki tüm çözümlerin akışını en aza indirmeye çalışın.
   2. Her kaplamalı kuyuya 100 μL 0,1 M HCl ekleyin ve 300 rpm yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yaslayın.
   3. Her kaplamalı kuyuya 12,5 μL 1 M Tris-HCl (pH 11) ekleyerek pH'ı nötralize edin.
   4. 8 kuyunun tamamından elde edilen fajı tek bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne bir şekilde bir edin. Çözeltileri homojen hale getirmek ve kuyulardan gelen tüm sıvıyı aspire etmek için aktarım sırasında pipet yukarı ve aşağı.
   5. Havuzalanmış eluted faj için% 10 BSA'yı% 1'lik son konsantrasyona ekleyin. 950 μL'lik tipik bir yuvarlak bir elüasyon hacmi için% 10 BSA'nın 95 μL'sini ekleyin. 4 °C'de saklayın. Bu birinci raunt çıktısı.

5. Sonraki seçim turları için hazırlık

1. Adım 3.1'de olduğu gibi bir sonraki seçim turu için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın.
2. Üçüncü seçim turu için plakayı adım 3.2'de olduğu gibi aşağıda belirtilen değişikliklerle kaplayın.
   1. Protein başına sadece dört kuyuyu 96 kuyu bağlayıcı bir plakada kaplar. Uygun tur için "yuvarlak 2/3" veya "yuvarlak 4/5" tüplerin içeriğinin yarısını kullanın. Proteinlerin çözeltiden çıkmasını önlemek için bu tüplerin içeriğini gerektiği gibi seyreltin.
3. Faj girişini bir sonraki seçim turu için hazırlayın.
   1. 4.1 adımından 3 mL orta günlük faz hücrelerini aşılamak için 4.5.5 adımından birinci tur çıkışın yarısını kullanın. Tipik bir yuvarlak birinci tur çıkış için, 500 μL çıkış ile aşılanın.
   2. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
   3. 1 x 1010 PFU/mL'lik son konsantrasyona M13K07 yardımcı faj ekleyin.
   4. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
   5. 3 mL'lik kültürün tamamını 30 mL 2YT/karbonhidrat/kan'a aktarın. 200 rpm yörünge sarsıntısı ile 37 °C'de bir gecede büyüyün.
   6. Ertesi gün, hücreleri çökeltmek için kültürü 4 °C'de 10 dakika boyunca 11.000 x g'da 50 mL santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.
   7. Süpernatantı yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne ayırın ve 8 mL PEG / NaCl ile karıştırın ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
   8. 4 °C'de 10 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüj, süpernatantı atın ve 2 dakika boyunca tekrar santrifüj.
      NOT: Tüpü, peleti aynı yerde tutan ilk tüp olduğu gibi ikinci kez aynı yönde rotora koyun, bu nedenle görmeyi kolaylaştırın.
   9. Faj peletini 800 μL PBT'de tamamen homojen olacak ve kümelenme olmayacak şekilde yeniden sakla.
   10. Faj çözeltisini pelet kalıntılarına 4 °C'de 4 dakika boyunca 16.200 x g'da 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.
   11. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu, bir sonraki seçim turu için giriştir.
4. İsteğe bağlı: Giriş ve çıkış çözümlerini titer edin.
   1. 500 μL E. coli tohum kültürünü kullanarak 5 mL 2YT/tet aşılayıp 37 °C'de bakteriler orta kütük evresine gelene kadar 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile kuluçkaya yatırın (_OD600 0.6 - 0.8). Bu yaklaşık 1 saat sürer.
   2. PBS'de ^10-3 - ^10-5'e faj giriş/çıkış çözeltilerini seyreltin ve 90 μL kültürlü hücrelere her seyreltmenin 10 μL'sini ekleyin.
      NOT: Faj zamanla tüpe adsorbe olacağından ve dönüşümler yanlış negatifler üretebileceğinden, seyreltilmiş faj çözeltilerini hemen kullanın.
   3. 200 rpm yörünge sarsıntısı ile 20 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.
   4. Ayrı LB/karbonhidrat plakalarında plaka 5 μL.
      NOT: Kaplanır miktar değişkendir, önceki sonuçlara/kişisel tercihe bağlıdır.

6. Sonraki seçim turları

1. Sonraki tüm turları, sırasıyla 3 ve 4 adımlarında yapıldığı gibi hazırlıkla birlikte gerçekleştirin ve aşağıda farklılıklar dikkate alındı.
   1. Önceki turda üretilen girişi kitaplık yerine faj kaynağı olarak kullanın. Hedef protein başına 4 kuyuyu, önceki turdan elde edilen faj girişinin 100 μL'si ile kapla. Kalan faj girişlerini 4 °C'de saklayın.
   2. Yıkama adımını 4.5.1'de her seçim turunda daha sıkı hale getirin. Birinci raunt 4 kez yıkamayı gerektirir, ikinci tur 6 kez, üçüncü tur 8 kez ve dört ve beş rauntlar 10 kez yıkanması gerekir.
   3. Birinci turda kullanılanlara kıyasla bazı hacimleri azaltın, çünkü sonraki turlar sekiz yerine sadece dört kuyu kaplar. Örneğin, adım 4.5.5'te faj çıkışına sadece BSA'nın 45 μL'si eklenir ve adım 5.3.1'de hücreleri aşılamak için faj çıkışının sadece 250 μL'si kullanılır.

7. Seçim sonrası işleme ve faj İzolasyonu

1. Dördüncü ve beşinci rauntlar için giriş ve çıkış çözümlerini titr.
   1. 5.4. adımda henüz yapılmamışsa, dört ve beş faj çıkışını titer etmek için aynı adımları izleyin ve ideal olarak birkaç plakada 30-300 koloni aralığı üretin.
2. Kültür ve izole faj.
   1. Aliquot 450 μL 2YT / karbonhidrat / M13K07 bir 96 mini tüp kültür kutusunun her tüpüne.
   2. Her tüpü aşılamak için 7.1 adımından plakaların herhangi birinden iyi izole edilmiş koloniler seçin.
      NOT: Dördüncü tur çıkışlar için kutunun üst yarısını ve beşinci tur çıkışları için alt yarısını kullanın.
   3. 200 rpm yörüngesel sarsıntı ile 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
   4. 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüj.
   5. Hücre peletini bozmadan yeni bir 96 mini tüp kültür kutusuna mümkün olduğunca fazla süpernatant aktarın ve eskisini atın. 4 °C'de saklayın.
   6. Yeni kutudan, her tüpten 100 μL'yi tüm kuyularda 100 μL% 50 gliserol içeren 96 kuyu bağlayıcı olmayan bir plakaya aktarın. İyice karıştırın ve yedek stok olarak -80 °C'de saklayın.

Results

Faj ekranından üretilen bağlayıcılar birçok şekilde doğrulanabilir ve analiz edilebilir. Öncelikle fajmid kütüphanesindeki çeşitlendirilmiş kesici ucun yanında bulunan astarlarla fajın dizilimine devam etmeniz önerilir. İdeal bir faj görüntüleme deneyi, çeşitli dizilere karşı net bir önyargı gösterecektir (Şekil 1). Diğer diziler de mevcut olacak, ancak daha düşük bir sayıyla, daha çok arka plan gürültüsü olarak görünecektir. Faj görüntüsünün ubiquitin varyantları (UbVs) ve wildtype UBE4B ar...

Discussion

Adım 2.1'de (protein hazırlama) belirtildiği gibi, protein konsantrasyonunu değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve her birinin faj görüntüleme için kullanılan belirli hedef proteine dayanarak benzersiz yararları ve dezavantajları olacaktır. Daha önce popüler yöntemler için ayrıntılı açıklamalar ve protokoller kaynağı ^{sağlanmıştır11}.

Sonraki bir tur için giriş olarak önceki bir faj ekranı tarafından tutulan fajı kullanmak, zayıf, geçici veya şans eseri b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tüp Sistemi (0,65 mL, steril, 96/Raf, 10 Raf/paket)	Fisher Scientific	14-222-198	Faj gösteriminden sonra faj çıktılarının kültürlenmesi.
BD Difco Susuz Kültür Ortamı: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Titre için plakaların hazırlanması.
Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V	BioShop Canada	ALB001	Tampon bileşeni.
Karbenisilin disodyum tuzu% 89.0-100.5 susuz	Millipore-Sigma	C1389-5G	Fagemid ile enfekte olmuş hücrelerin kültürlenmesi.
Kompakt Dijital Mikroplaka Çalkalayıcı	Fisher Scientific	11-676-337	Faj kütüphanesi ile inkübasyon sırasında plakaları sallama.
Corning Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı	Fisher Scientific	07-200-684	Faj gliserol stoklarının sızdırmazlığı.
Susuz Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Titre için plakaların hazırlanması.
DS-11 Spektrofotometre/Florometre	DeNovix	DS-11 FX+	Protein konsantrasyonu ölçümü.
Greiner Bio-One CellStar 96-Kuyulu, İşlenmemiş, U Şeklinde Tabanlı Mikroplaka	Fisher Scientific	7000133	Faj gliserol stoklarının saklanması.
Hidroklorik Asit	Fisher Scientific	A144-500	Faj elüyonu.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Kimyasal Olarak Yetkin E. coli	Fisher Scientific	C854003	Faj enfeksiyonu için bakteri suşu.
Kanamisin Sülfat	Fisher Scientific	AAJ1792406	M13K07 yardımcı faj ile enfekte olmuş hücrelerin kültürlenmesi.
M13KO7 Yardımcı Faj	New England Biolabs	N0315S	Phagemid paketleme ve salgıya izin verin.
MaxQ 4000 Masaüstü Orbital Çalkalayıcı	Fisher Scientific	11-676-076	Bakteri hücre kültürü.
Nunc MaxiSorp 96 kuyulu mikroplaka, düz dipli	Yaşam Teknolojileri	44-2404-21	İmmobilize edici proteinler.
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 10X Çözelti	Fisher Scientific	BP3994	Tampon bileşeni / faj yeniden süspansiyon ortamı.
ELISA ve Kuluçka için Polyester Filmler	VWR	60941-120	Kuluçka sırasında mikroplakaların kaplanması.
Polietilen Glikol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Faj çökeltisi.
Sodyum klorür	Millipore-Sigma	S3014	Faj çökeltisi.
Steril Plastik Kültür Tüpleri: Yarı Saydam Polipropilen	Fisher Scientific	14-956-1D	Faj girişlerinin kültürlenmesi.
Tetrasiklin Hidroklorür	Fisher Scientific	BP912-100	OmniMax hücrelerinin kültürlenmesi E. coli
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Nötralize edici ayrıştırılmış faj çözeltisi.
Tripton Tozu	Fisher Scientific	BP1421-2	Hücre büyüme ortamı bileşeni.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Tampon bileşeni.
Maya Özü	Fisher Scientific	BP1422-2	Hücre büyüme ortamı bileşeni.