Yöntem makalesi

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

DOI:

10.3791/62985

⸱

16 Kasım 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solunum yolu dış çevre ile doğrudan temas halindedir ve çevresel antijenlere karşı istenmeyen reaksiyonları bastırırken koruma sağlamak için hassas bir şekilde düzenlenmiş bir bağışıklık sistemi gerektirir. Akciğerler, immün sürveyans sağlayan, aynı zamanda koruyucu immün yanıtlara aracılık eden doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin çeşitli popülasyonlarına ev sahipliği yapar. Sağlıklı pulmoner bağışıklık sistemini dengede tutan bu hücreler, astım, enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlara da katılırlar. Yüzey ve hücre içi proteinlerin seçici ekspresyonu, akciğerin bağışıklık hücrelerine benzersiz immünofenotipik özellikler sağlar. Sonuç olarak, akış sitometrisi, kararlı durum ve patolojik durumlar sırasında bu tür hücre popülasyonlarının tanımlanmasında etkili bir role sahiptir. Bu makale, kararlı durum koşulları altında sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan bağışıklık hücrelerini tanımlamak için tutarlı ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, akciğer bağışıklık manzarasındaki hastalığa özgü değişiklikleri tanımlamaya yardımcı olmak için çeşitli hastalık modellerinde bu hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak için de kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin solunum yolu, patojenlerle savaşmaktan ve bağışıklık homeostazını korumaktan sorumlu benzersiz bir bağışıklık sistemi içerir. Pulmoner immün sistem, fenotipleri, fonksiyonları, kökenleri ve lokalizasyonlarında önemli heterojenliğe sahip hücresel popülasyonlardan oluşur. Esas olarak fetal monositlerden köken alan yerleşik alveoler makrofajlar (AM'ler) alveoler lümende1 bulunurken, kemik iliği kaynaklı interstisyel makrofajlar (IM'ler) akciğer parankiminde bulunur2. IM'ler CD206 ifadesiyle daha da alt sınıflara ayrılabilir. CD206+ IM'ler peribronşiyal ve perivasküler bölgeyi doldururken, CD206- IM'ler alveoler interstisyumda3 bulunur. Son zamanlarda IM'lerin birkaç alt sınıflandırması önerilmiştir3,4,5,6. IM'ler AM'lerden daha az çalışılmasına rağmen, son kanıtlar akciğerin bağışıklık sisteminin düzenlenmesindeki önemli rollerini desteklemektedir7. Ek olarak, CD206 alternatif olarak aktive edilmiş AMs8 ile de ifade edilir.

Pulmoner dendritik hücreler (DC'ler), fonksiyonel özellikleri, yerleri ve kökenleri bakımından akciğer immün hücrelerinin bir başka heterojen grubudur. Akciğerde DC'lerin dört alt kategorisi tanımlanmıştır: geleneksel CD103 + DC'ler (cDC1 olarak da bilinir), geleneksel CD11b + DC'ler (cDC2 olarak da bilinir), monosit kaynaklı DC'ler (MoDC'ler) ve plazmasitoid DC'ler9,10,11,12,13. İlk üç alt sınıf majör histouyumluluk kompleksi (MHC) II+CD11c+9,10,14,15 olarak tanımlanabilir. Plazmasitoid DC'ler MHC II'yi eksprese eder ve CD11c için orta derecede pozitiftir, ancak yüksek B220 ve PDCA-19,13,16 seviyelerini eksprese eder. Naif murin akciğerlerinde, CD103 DC'ler ve CD11b DC'ler hava yolu interstisyumunda bulunurken, plazmasitoid DC'ler alveoler interstisyumda bulunur17.

İki ana monosit popülasyonu, kararlı durum sırasında akciğerde bulunur: klasik monositler ve klasik olmayan monositler. Klasik monositler Ly6C + 'dır ve başlangıçtaki enflamatuar yanıt için kritiktir. Buna karşılık, klasik olmayan monositler Ly6C'dir ve yaygın olarak anti-enflamatuar hücreler olarak görülmüştür3,16,18. Son zamanlarda, Ly6C- monositlerinden kaynaklanan ve CD206 + IMs3'e yol açan CD64 + CD16.2 + monositlerin ek bir popülasyonu tanımlanmıştır.

Eozinofiller esas olarak helmint enfeksiyonu veya alerjik durumlar sırasında akciğerlerde görülür. Bununla birlikte, yerleşik eozinofiller olarak bilinen, kararlı durum sırasında pulmoner parankimde az sayıda eozinofil vardır. Yerleşik eozinofillerin aksine, akciğer interstisyumunda ve bronkoalveoler lavajda (BAL) inflamatuar eozinofiller bulunur. Ev tozu akarı (HDM) fare modellerinde, enflamatuar eozinofiller, antijen aracılı stimülasyondan sonra akciğere alınır. Yerleşik eozinofillerin, HDM19'a T helper 2 (Th2) duyarlılığını inhibe ederek alerjide düzenleyici bir role sahip olabileceği öne sürülmüştür.

Pulmoner miyeloid hücrelerin geri kalanının aksine, nötrofiller CD68'i değil Ly6G'yi eksprese eder ve CD68-Ly6G + immünofenotip16,20,21'in bir imzası ile karakterize edilir. Görselleştirme çalışmaları, kararlı durum sırasında akciğerin intravasküler kompartmanda bir nötrofil havuzu ayırdığını ve önemli sayıda ekstravasküler nötrofil barındırdığını göstermiştir22. Eozinofillere benzer şekilde, nötrofiller BAL'da kararlı durumda bulunmaz; Bununla birlikte, LPS meydan okuması, astım veya zatürre gibi çeşitli bağışıklık stimülasyon biçimleri, nötrofilleri alveoler lümene sürer ve BAL21,22,23'te bulunmalarına neden olur.

Akciğerin CD45+ hücrelerinin önemli bir kısmı doğal öldürücü (NK), T hücreleri ve B hücrelerini temsil eder ve çoğu miyeloid belirteç için negatiftir24. Naif farelerin akciğerlerinde, bu üç hücre tipi CD11b ve MHC II18 ekspresyonuna dayanarak tanımlanabilir. Pulmoner CD45+ hücrelerinin yaklaşık %25'i B hücreleridir, oysa NK hücrelerinin yüzdesi akciğerde diğer lenfoid ve lenfoid olmayan dokulardan daha yüksektir24,25,26. Pulmoner T hücreleri arasında önemli bir kısmı CD4-CD8- dir ve solunum yolu enfeksiyonlarında önemli bir rol oynar26.

Akciğer, çok karmaşık ve benzersiz bir bağışıklık sistemine ev sahipliği yaptığı için, akciğer bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için çeşitli geçit stratejileri geliştirilmiş ve bildirilmiştir16,18,20,27. Burada açıklanan geçit stratejisi, 9 belirteç kullanarak 12 farklı pulmoner miyeloid ve miyeloid olmayan immün popülasyonu tanımlamak için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir yol sağlar. Sonuçları doğrulamak için ek belirteçler kullanılmıştır. Ayrıca, hücre ölümünü en aza indiren ve akciğerin bağışıklık hücresi bölmesinin en eksiksiz profilinin belirlenmesini sağlayan tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir yöntem sağlanmıştır. Epitel hücreleri (CD45-CD326+CD31-), endotel hücreleri (CD45-CD326-CD31+) ve fibroblastlar gibi akciğerin immün olmayan hücrelerinin tanımlanmasının farklı bir yaklaşım gerektirdiği unutulmamalıdır28,29. Bu tür popülasyonların tanımlanması, burada açıklanan protokol ve yönteme dahil değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan tüm çalışmalar ve deneyler, Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) göre kılavuzlar altında yürütülmüştür. Bu protokolü geliştirmek için her iki cinsiyetten altı ila on haftalık C57BL / 6 fareleri kullanıldı.

1. Cerrahi eksizyon ve doku hazırlığı

  1. İntraperitoneal olarak 1 mL tribromoetanol enjekte ederek fareyi ötenazi yapın (standart protokole göre hazırlanır; Malzeme Tablosu).
    NOT: CO2 boğulması, akciğer çalışmalarında, akciğer hasarına neden olabileceğinden ve akciğer bağışıklık hücrelerinin özelliklerini ve özelliklerini değiştirebileceğinden kaçınılmalıdır. Servikal çıkıktan, akciğerin mekanik yaralanmasına neden olabileceğinden de kaçınılmalıdır.
  2. Fareyi cerrahi işlem için temiz ve özel bir alana aktarın.
  3. Dört ekstremitede iğneler veya bant kullanarak fare sırtını yan yana doğru stabilize edin. Ventral bölgenin cildini sterilize etmek için% 70 etanol kullanın.
  4. Boyundan karnına kadar ciltte bir kesi yapın. Cildi torasik bölgeden dikkatlice çıkarın.
  5. Sternum ve kaburgaları dikkatlice çıkarın.
  6. Akciğerler tamamen beyaz olana kadar 18-21 G'lik bir iğne kullanarak 10 mL soğuk PBS'yi doğrudan sağ ventriküle enjekte ederek akciğerleri yıkayın.
  7. Akciğerlere dokunmadan timus ve kalbi dikkatlice çıkarın.
  8. Akciğerleri çevreleyen dokulardan nazikçe ayırın ve soğuk BSA tamponlu bir tüpe aktarın (Tablo 1).
    NOT: Tek hücreli süspansiyonu daha fazla hazırlamadan önce tüm bitişik yağları akciğerlerden çıkarmak için çaba gösterilmelidir, çünkü bu, okumaları önyargılı hale getirebilir.

2. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

  1. Akciğerleri boş bir Petri kabına aktarın ve iki ince neşterle doğrayın. Kıyılmış akciğerin tüm parçalarını yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. Plakayı yıkamak için 5 mL sindirim tamponu kullanın ve kıyılmış akciğeri içeren 50 mL'lik tüpe ekleyin (Tablo 1).
    NOT: Sindirim tamponu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. 5 mg/mL kollajenaz28 kullanın. 1 veya 5 mg kollajenazın BSA tamponu veya proteinsiz PBS ile birleştirilmesi sonuçları iyileştirmedi (Ek Şekil S1).
  2. Tüpün kapağını sabitleyin ve akciğeri 37 ° C'de 150 rpm hızında yörüngesel bir çalkalayıcıda 30 dakika boyunca sindirin. 10 mL soğuk BSA tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  3. Sindirimden sonra, akciğer parçalarını karıştırmak ve çözmek için 18 G'lik bir iğne kullanın. Yeni bir 50 mL konik tüpün üstüne 70 μm'lik bir filtre süzgeci yerleştirin.
    NOT: Daha küçük bir mikron filtrenin kullanılması, majör miyeloid popülasyonlarının kaybına neden olabilir.
  4. Sindirilmiş akciğer karışımını yavaşça doğrudan süzgeç üzerine aktarın. Filtredeki kalan akciğer parçalarını parçalamak için 10 mL'lik bir şırınga pistonunun kauçuk tarafını kullanın. Filtre üzerindeki işlenmiş malzemeyi BSA tamponu ile yıkayın.
  5. Tek hücreli süspansiyonu 350 × g'da 4 °C'de 8 dakika boyunca santrifüj yapın.
  6. Süpernatantı dikkatlice atın ve hücreleri 1 mL ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın. 1 mL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 90 sn kuluçkaya yatırın.
  7. Reaksiyonu durdurmak için 10 mL soğuk BSA tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 7 dakika boyunca 350 × g'da santrifüj yapın.Bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak için süpernatantı dikkatlice atın ve peleti Boyama Tamponunda yeniden askıya alın.
  8. Hücreleri 5 × 106 hücre/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın ve yüzey boyama için kullanın (bkz. bölüm 3).
    NOT: Bu amaçla, hücreleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya yerleştirin, ardından antikor boyama ve yıkayın. Bir plaka santrifüjü mevcut değilse, plakalar yerine akış tüpleri kullanın. Bu protokolle, ortalama büyüklükte 6-10 haftalık bir C57BL / 6 fareden akciğer başına ~ 15-20 × 106 hücre elde edilebilir.

3. Yüzey antikor boyama

  1. 96 delikli bir plakada kuyu başına 200 μL'de 1 × 106 hücre aktarın. Plakayı 4 °C'de 7 dakika boyunca 350 × g'de santrifüj yapın. Bu arada, anti-16/32 antikoru (1:100) boyama tamponunda seyrelterek Fc-blok çözeltisini hazırlayın (Tablo 1).
  2. Hücreleri önceden hazırlanmış Fc bloke edici çözeltinin (Malzeme Tablosu) 50 μL'sinde yeniden askıya alın ve 4 ° C'de veya buz üzerinde 15-20 dakika inkübe edin.
  3. 150 μL boyama tamponu ekleyin ve plakayı 4 °C'de 5 dakika boyunca 350 × g'da santrifüj yapın. Bu arada, yüzey antikorlarını seyrelterek yüzey antikoru kokteylini hazırlayın (1:100; Tablo 2) boyama tamponunda.
    NOT: (i) Fc blokajı için anti-16/32 antikoru, aynı karışımdaki yüzey antikorları ile birlikte kullanılabilir. (ii) Sabitlenebilir canlılık boyası kullanılıyorsa, 1:1.000 seyreltmede yüzey antikor kokteyline ekleyin.
  4. Hücreleri önceden hazırlanmış yüzey antikor kokteylinin 50 μL'sinde yeniden askıya alın ve karanlıkta 4 ° C'de 30-40 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
    NOT: Hücre içi boyama gerekmiyorsa, hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın ve doğrudan akış sitometresinde veri toplamaya devam edin. Alternatif olarak, hücreler daha sonra elde edilmek üzere 4 ° C'de sabitlenebilir ve saklanabilir. Hücreleri 24 saat içinde akış sitometrisi için kullanmanızı öneririz.

4. Hücre fiksasyonu ve hücre içi boyama

  1. FoxP3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti'nin üç parça fiksasyon/permeabilizasyon konsantresi ve 1 kısım fiksasyon/geçirgenlik seyrelticisini karıştırarak fiksasyon/permeabilizasyon tamponunu (Fix/Perm Buffer) hazırlayın (Tablo 1).
  2. Hücreleri, bölüm 3'te açıklandığı gibi kaplandığı 96 delikli plakanın kuyucuğu başına önceden hazırlanmış Fix/Perm Buffer'ın 50 μL'sinde yeniden askıya alın ve karanlıkta 4 ° C'de 20-25 dakika boyunca inkübe edin.
  3. 1x permeabilizasyon tamponu hazırlamak için 10x permeabilizasyon tamponunu arıtılmış deiyonize suda 1: 10 olarak seyreltin.
  4. Hücreleri 1x geçirgenlik tamponu ile bir kez yıkayın. Bu arada, hücre içi antikorları (1:100) 1 mL geçirgenlik tamponunda seyrelterek hücre içi antikor kokteylini hazırlayın.
  5. 96 delikli plakanın hücresi başına önceden hazırlanmış yüzey antikor kokteylinin 50 μL'sini kullanarak hücreleri yeniden askıya alın ve karanlıkta 4 ° C'de 40 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Hücreleri bir kez geçirgenlik tamponu ve bir kez boyama tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın.
    NOT: Plaka okuyuculu bir akış sitometresi yoksa, hücreleri akış sitometri tüplerine aktarın.
  7. Akış sitometresinde numune başına en az 1,5 × 106 hücre elde edin.
    NOT: Tek renkli ve lekesiz kontrol numuneleri için numune başına 0,5-1 × 106 hücre yeterli olacaktır. Optimal boyama elde etmek ve maliyetleri azaltmak için kullanılan bireysel antikorların titreleştirilmesi önerilir. Mevcut protokol, FoxP3 boyama arabelleği seti kullanılarak hazırlanan Fix/Perm Arabelleği kullanılarak optimize edilmiştir. CD68 nükleer bir belirteç değil sitoplazmik olduğundan, çeşitli satıcılardan düşük konsantrasyonda paraformaldehit veya sitofiks / sitoperm kitleri gibi diğer geçirgenlik çözümleri yeterli olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçit stratejisi
Geçit stratejimizin ilk adımı, enkaz ve çiftlerin dışlanmasıdır (Şekil 1A). Çiftlerin dikkatli bir şekilde dışlanması, yanlış pozitif popülasyonlardan kaçınmak için kritik öneme sahiptir (Ek Şekil S2). Daha sonra, hematopoetik hücreler için bir belirteç olan CD45 + kullanılarak bağışıklık hücreleri tanımlanır (Şekil 1B). Ölü hücreleri dışlamak için canlı-ölü lekesi eklenebilir. Bununla birlikte, bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulmoner immün hücrelerin tanımlanması, akciğerde bulunan çoklu immün hücre tipleri ve diğer dokularda bulunan muadillerine kıyasla benzersiz immünofenotipik özellikleri nedeniyle zor olabilir. Çeşitli patolojik durumlarda, akciğerlerde farklı fenotipik özelliklere sahip hücreler ortaya çıkar. Örneğin, bleomisin kaynaklı akciğer hasarı, alveolar boşlukta dolaşımdaki monosit kaynaklı makrofajların işe alınmasıyla sonuçlanır, burada bir yıl kadar kalabilirler ve hatta bleomisin kaynaklı fibrozdan sonra bile devam edebilirl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.A.B., Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis ve Dako tarafından lisanslanan PD-1 yolu üzerinde patentlere sahiptir. Yazarlar başka hiçbir rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibeleri R01CA238263 ve R01CA229784 (VAB) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL şırınga pistonuEXELINT26265
18 G iğnelerBD Hassas Kayar İğne305165
21 G iğnelerBD Hassas Kayar İğne305195
50 mL konik tüplerFalcon3520
70 & m hücreli süzgeçThermoFisher22363548
96 oyuklu plakalarFalcon/corning3799
ACK Lysing TamponuThermoFisherA10492-01
anti-fare CD11bBiolegend101215Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
anti-fare CD11cBiolegend117339 / 117337Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
anti-fare CD45Biolegend103115Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın
anti-fare CD64Biolegend139319Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın
anti-mouse CD68Biolegend137009Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın
anti-fare GR-1Biolegend108433Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın
anti-fare Siglec FBiolegend155503Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228Ayrıntılar için bakınız Tablo 2
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
CD24 Biolegend138503Ayrıntılar için Tablo 2
CD3Biolegend'abakınız100205Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
Santrifüj Kollajenaz
Tip 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
DNase I, Millipore Sigma10104159001
Ethanol
F4/80Biolegend123133Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
Fetal Botor SerumR& D Systems
İnce Tırtıklı ForsepsRoboz Cerrahi Alet Co
Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon SetiThermoFisher00-5523-00
Futura Güvenlik NeşterMerit Medical SystemsSMS210
Canlı/Ölü Sabitlenebilir Uzak Okunan Ölü Hücre Leke KitiThermoFisherL34973Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın
MERTKBiolegend151505Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
MHC-IIBiolegend107621Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
NK1.1Biolegend108705Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız
Orbital ShakerVWR Model 200
Petri kabıFalcon351029
Soğutmalı tezgah üstü santrifüjSORVAL ST 16R
Küçük kavisli makasRoboz Cerrahi Alet Co
: : , :

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
  3. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964(2019).
  4. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  5. Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756(2020).
  6. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
  7. Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
  8. Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
  9. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
  12. Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
  13. Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
  14. Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
  15. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
  16. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
  17. Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046(2018).
  18. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  19. Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
  20. Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
  21. Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024(2019).
  22. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  23. Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
  24. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
  25. Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
  26. Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
  27. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
  29. Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21(2020).
  30. Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416(2019).
  31. Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
  32. Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879(2018).
  33. Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
  34. Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
  35. Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794(2018).
  36. Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  37. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  38. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
  39. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  40. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
  41. Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak SitometrisiAkci er mm n H crelerimm n H cre Tan mlamaDo u tan Gelen mm n H crelerTek H cre S spansiyonuGating StratejisiY zey Mark rleriPulmoner mm n Sistem

İlgili makaleler