Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Summary

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Abstract

Nörodejeneratif protein konformasyonel hastalıklarının (PCD'ler) prevalansındaki artış, yıllar içinde bu konuya büyük bir ilgi uyandırmıştır. Bu artan dikkat, PCD'li insanlarda gözlenen hastalık fenotiplerini çoğaltabilen hayvan modellerinin çeşitlendirilmesi ve iyileştirilmesi çağrısında bulunmuştur. Murin modellerinin paha biçilmez olduğu kanıtlanmış olsa da, pahalıdır ve zahmetli, düşük verimli yöntemlerle ilişkilidir. PCD'leri incelemek için Caenorhabditis elegans nematod modelinin kullanılması, yüksek verimli uygulamalara izin veren göreceli bakım kolaylığı, düşük maliyet ve hızlı üretim süresi ile gerekçelendirilmiştir. Ek olarak, C. elegans ve insan genomları arasındaki yüksek koruma, bu modeli paha biçilmez bir keşif aracı haline getirmektedir. Floresan etiketli dokuya özgü poliglutamin (poliQ) yollarını eksprese eden nematodlar, floresan odaklarla karakterize edilen yaşa ve poliQ uzunluğuna bağlı agregasyon sergiler. Bu tür muhabirler genellikle dokulardaki proteostazdaki değişiklikleri izlemek için vekil olarak kullanılır. Manuel agrega ölçümü zaman alıcıdır ve deneysel verimi sınırlar. Ayrıca, manuel odakların nicelleştirilmesi, toplam tanımlama oldukça öznel olabileceğinden, önyargıya neden olabilir. Burada, solucan kültürleme, görüntü toplama ve veri işlemeden oluşan bir protokol, bağırsağa özgü poliQ'yu eksprese eden C. elegans kullanılarak yüksek verimli agrega nicelemesini desteklemek için standartlaştırılmıştır. Bir görüntü analiz yazılımı olan CellProfiler'ı kullanarak C. elegans tabanlı bir görüntü işleme işlem hattı uygulayarak, bu yöntem tek tek solucanları ayırmak ve tanımlamak ve ilgili toplamlarını numaralandırmak için optimize edilmiştir. Otomasyon kavramı tamamen benzersiz olmasa da, tekrarlanabilirlik, manuel sayımdan kaynaklanan önyargının ortadan kaldırılması ve verimin artırılması için bu tür prosedürleri standartlaştırma ihtiyacı yüksektir. Bu yöntemlerin, C. elegans modelini kullanarak büyük bakteriyel, genomik veya ilaç kütüphanelerinin tarama sürecini büyük ölçüde basitleştirebileceği tahmin edilmektedir.

Introduction

Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları veya amiyotrofik lateral skleroz gibi yaşa bağlı nörodejeneratif protein konformasyonel hastalıkları (PCD'ler), agregasyona, hücre ölümüne ve doku dejenerasyonuna yol açan protein yanlış katlanması ile karakterizedir¹. Protein yanlış katlanması suçlu olarak kabul edilirken, bu hastalıkların etiyolojisi açık değildir. Bu nedenle, etkili tedavilerin geliştirilmesi, hastalığın başlangıcına ve ilerlemesine katkıda bulunan faktörler ve koşullar hakkında bilgi eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, mikrobiyomdaki değişikliklerin PCD'lerin başlangıcını, ilerlemesini ve şiddetini etkilediğini göstermektedir ^2,3,4. Bununla birlikte, insanın, hatta murinin mikrobiyomunun karmaşıklığı, mikropların konakçıları üzerindeki kesin etkisini ortaya çıkaracak çalışmalar yapmayı zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, Caenorhabditis elegans gibi daha basit organizmalar genellikle bir keşif aracı olarak kullanılır 5,6,7,8. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda C. elegans, bakterilerin konakçı proteostazı ve hastalık patogenezi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılmıştır ^9,10. Bakteriyel kolonizasyon, hormesis ve genomik değişiklikler, poliglutamin (poliQ) yollarının toplanmasını etkileyen örnek durumlar arasındadır 9,11,12. Ek olarak, bu yanlış katlanmış protein kümeleri, konakçı içinde poliQ uzunluğu ve yaşa bağlı birikim sergiler ve bozulmuş motiliteyle ilişkilidir ^9,13. Floresan olarak etiketlenmiş puncta'yı ölçmenin nispeten basit bir yaklaşımı, protein katlanmasını ve toplanmasını etkileyen koşullar, faktörler veya ilaçlar hakkında önemli veriler üretebilir.

Floresan punktanın nicelleştirilmesinin güvenilir ve nispeten basit bir prosedür olduğu kanıtlanmış olsa da, protein agregasyonunu etkileyen bileşiklerin, bakterilerin veya koşulların büyük ölçekli taranmasını kolaylaştıracak bir protokol geliştirmek için zorluk devam etmektedir. Otomatik C. elegans görüntü işleme ve puncta niceleme kavramı tamamen yeni değildir, çünkü bir dizi pratik destek aracı geliştirilmiştir^14,15. Bununla birlikte, kültürleme, görüntü alma ve bir işleme boru hattının entegrasyonu, sonuçlardaki değişkenliği ortadan kaldırmak ve daha yüksek verimli ekranlara izin vermek için çok önemlidir.

Bu nedenle, bu makalenin amacı, proteostazdaki değişiklikleri tespit etmek için bir vekil olarak C. elegans'ta poliQ agregasyonunu ölçmek için kullanılan prosedürü standartlaştırmaktır. Bu görev, otomatik solucan ve toplu tanımlama yeteneğine sahip açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı^{olan 16} olan CellProfiler kullanılarak gerçekleştirildi ve solucanları kültürlemek, görüntü almak ve verileri işlemek için daha büyük bir protokole entegre edildi.

Protocol

Tüm prosedürler, Florida Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından gözden geçirilen ve onaylanan güvenlik yönergelerini takip etti. Biyolojik Güvenlik Seviyesi-2 bakterilerine maruz kalma riskini azaltmak için uygun biyogüvenlik önlemleri alınmıştır.

NOT: Tüm deneyler için, C. elegans , Escherichia coli OP50 ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları üzerinde çoğaltılmalı ve muhafaza edilmelidir.

1. 10 cm NGM plakalarının hazırlanması

1. 3 g NaCl, 2.5 g triptikaz-pepton ve 17 g agar'ı 2 L'lik bir şişede birleştirin ve çift damıtılmış suyla (ddH₂O) 1 L'ye doldurun. Otoklavlamadan önce manyetik karıştırma çubuğu ekleyin.
2. Karışımı 121 °C'de 45 dakika ve 21 psi basınçta otoklav yapın. Karışımı bir su banyosunda 50 ° C'ye soğumaya bırakın.
3. Aseptik teknikleri kullanarak, aşağıdaki steril çözeltileri ekleyin: 1 mL'lik 1 M CaCl_2· 2H₂O, 1 mL 1 M MgSOİ_4· 7H2 O, 1 mL 5 mg / mL kolesterol% 100 etanol (oda sıcaklığına ısıtılmış) ve 25 mL 1 M KH₂PO₄ (pH = 6.0) içinde çözülür. Manyetik bir karıştırma plakası kullanarak karıştırın. Karıştırma 700 RPM'de 1 dakika boyunca gerçekleştirilebilir.
4. Karışım 10 cm'lik plakanın tamamını doldurana kadar dökün. Alternatif olarak, plaka başına yaklaşık 20 mL karışım eklemek için dereceli bir serolojik pipet kullanın.
5. Bakterilerle tohumlamadan önce plakaların oda sıcaklığında 24 saat kurumasını bekleyin veya kuruduktan sonra düz plakaları 4 ° C'de saklayın.
   NOT: Tüm medya bileşenleri aseptik teknikler kullanılarak işlenir. Adım 1.3-1.4, laminer bir akış başlığında yapılmalıdır.

2. NGM agarının 24 delikli plakalarda FUDR ile hazırlanması

1. 1.1-1.3 arasındaki adımları izleyin.
2. NGM'yi 5-Floro-2′-deoksiüridin (FUDR) ile destekleyin ve 100 μg / mL'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için karıştırın.
   NOT: FUDR, DNA replikasyonunu inhibe eder ve sonuç olarak, germline ve embriyogenezi hedefleyerek C. elegans üremesini bloke eder ve sonuçta ömrü etkiler. Bu nedenle, FUDR içeren plakalara geçmeden önce solucanların genç yetişkinlere tamamen gelişmesine izin vermek önemlidir.
   DİKKAT: FUDR toksiktir ve üreticinin Güvenlik Bilgi Formuna göre kullanılmalıdır.
3. Bir pipet tabancası kullanarak, her bir oyuğa 1 mL NGM-FUDR dağıtın.
   NOT: Bu işlem, otomatik bir plaka dökme sistemi kullanılarak kolaylaştırılabilir.
4. Bakterilerle tohumlamadan veya düz plakaları 4 ° C'de saklamadan önce plakayı oda sıcaklığında 24 saat kurumaya bırakın.

3. Plakaların tohumlanması: OP50 ve ek test bakterileri

1. Bir gecede E. coli OP50 kültürü hazırlamak için, dondurulmuş bir stoktan 200 μL bakteriyel bir aliquot'u, 250 mL taze, steril Luria suyu (LB) içeren 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine ekleyin.
   NOT: Ortamın hacmi, tohumlanması gereken plaka sayısına bağlıdır. Diğer bakteri kültürlerini hazırlamak için, steril bir mikropipet ucu kullanarak 5 mL büyüme ortamı içeren 16 mL'lik bir kültür tüpünü dondurulmuş stoktaki bakterilerle aşılayın.
2. 37 ° C'lik bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin, 220 RPM'de sallayın (dakikada dönüş).
   NOT: Ortamın çalışma hacminin en az iki katı olan sterilize şişeler kullanın ve otoklavlanmış alüminyum folyo ile kapatın. Aseptik teknikler kullanarak aşılama adımını ve bakteri dağıtımını gerçekleştirin.
3. Gece boyunca E. coli OP50 kültürünün 1-2 mL'sini her 10 cm'lik NGM plakasının ortasına dağıtın. Bu kültürün NGM plakasının etrafına yayılmasına gerek yoktur.
4. Plakaların kullanımdan/depolamadan önce oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
   NOT: Kapakları açık olan tohumlu plakalar, kurumayı kolaylaştırmak için hava akışlı bir davlumbaza yerleştirilebilir.

4. Plakaların kültürlenmesi ve tohumlanması: 24 kuyucuklu plakalar

1. Adım 3.1-3.2'de bulunan kültürleme talimatlarına bağlı kalarak, istenen bakteri suşlarının bir gecede kültürünü hazırlayın.
2. Her bakteri kültürünün 200 μL'sini, NGM agar içeren 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. 200 μL'lik bir bakteri hacmi, tüm agar alanını kaplayacak ve solucanların bakteriyel çimlerden kaçınmamasını sağlamak için yiyecek miktarını en üst düzeye çıkaracaktır.
3. Kurumayı kolaylaştırmak için plakaları biyolojik bir güvenlik kabininde (BSC) çatlamış halde açık bırakın. Aşırı dehidrasyonu önlemek için plakaları periyodik olarak kontrol edin ve eşit hava akışını ve kurumayı teşvik etmek için plaka yönünü değiştirin. Plakalar 5 saat içinde kurumalıdır.
   NOT: Biyolojik Güvenlik Seviye-2 bakterileri ile yapılan herhangi bir çalışma, sertifikalı BSC'lerde yapılmalı ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmalıdır.

5. Yaş senkronizasyonu

NOT: Tüm adımlar uygun aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirilmelidir (yani, bir aleve yakın veya bir BSC'nin içinde çalışmak).

1. Gravid hermafroditleri 10 cm OP50 plakalarından filtre sterilize edilmiş M9 çözeltisi (5,8 g Na₂HPO_4·) kullanarak yıkayın 7H 2 O, 3.0 g KH 2 PO 4, 5 g NaCl, 0.25 g MgSO₄·7H 2 O, 1 L ddH ₂O).
   1. Solucanları bakteriyel çimlerden kaldırmak için steril bir cam veya plastik serolojik pipet kullanarak plakaya birkaç kez pipet M9 çözeltisi.
   2. Solucan süspansiyonunu toplayın ve çözeltiyi 15 mL'lik polistiren konik bir tüpe aktarın.
2. 270 x g, oda sıcaklığında (RT, ~23 °C), 2 dakika santrifüj.
3. Bir vakum tutucu şişe kullanarak aspire edin ve solucan peletini rahatsız etmeden bırakarak süpernatanı atın.
   1. Solucanları yıkamak için peleti 5-10 mL M9'da yeniden askıya alın ve 5.2-5.3 adımlarını iki kez tekrarlayın.
4. Tüpe 5 mL% 20 ağartma çözeltisi (8.25 mL ddH₂O, 3.75 mL 1M NaOH, 3.0 mL mikrop öldürücü olmayan ağartıcı) ekleyin ve solucanları çözmek için sürekli ters çevirin. Solucanlar neredeyse tamamen çözüldükten sonra santrifüj yapmaya hazırdır.
   NOT: Beyazlatma süreleri ve beyazlatma çözeltisinin hacmi, numunenin boyutuna bağlı olacaktır. Aşırı ve az beyazlatma yaygın hatalardır. Bu nedenle, bu işlem genellikle numunenin santrifüjleme için ne zaman hazır olduğunu belirlemek için optimizasyon gerektirir.
5. 423 x g'de 2 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
6. Yumurta peletini yeniden askıya almak için 10 mL steril M9 ekleyin.
   1. Yumurtaları peletlemek için tüpü 423 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı bir aspiratör şişesi ile çıkarın.
   2. 5.6-5.6.1 arasındaki adımları yineleyin.
7. Yumurta peletini 5 mL steril M9 içinde yeniden askıya alın ve istenen sıcaklıkta gece boyunca bir nutatöre yerleştirin.
   NOT: Yaş senkronize L1 larvaları ertesi gün plakalara geçmeye hazır olacaktır.

6. Solucan hazırlama sonrası yaş senkronizasyonu

1. Yaş senkronize solucanları RT'de (~ 23 ° C) 3 dakika boyunca 270 x g'de santrifüj edin.
2. Süpernatantı davlumbaz gibi temiz bir ortamda veya bir Bunsen brülörün yanında aspire edin. Süpernatantın yaklaşık 200 μL'sini bırakın ve solucanları yeniden askıya alın.
3. Bir mikropipet kullanarak, konsantre sonsuz süspansiyonu daha önce OP50 ile tohumlanmış 10 cm NGM plakalarına aktarın.
   NOT: Her tabak, yiyecek tükenmeden 1.500 solucanı destekleyebilir; Bununla birlikte, bu konsantrasyon bakteriyel çimlerin yoğunluğuna ve büyüme sıcaklığına bağlı olarak ayarlama gerektirebilir. Solucanların açlıktan ölmesini önlemek için birden fazla plaka kullanılması önerilir. Bu plakaların FUDR içermemesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
4. Plakaların kurumasına izin verin; daha sonra ters çevirin ve 48 saat boyunca 25 ° C'de saklayın.
   NOT: Ekranın durumuna bağlı olarak, adım 6.1'deki solucanlar doğrudan test plakalarına (bakteri, ilaç veya test bileşikleri içeren) yerleştirilebilir. İstenilen test koşulu gelişimi etkiliyorsa, solucanlar test koşullarına maruz bırakılmadan önce genç yetişkinlere (~ 48 saat) kadar OP50 içeren NGM üzerinde kültürlenmelidir.
5. 48 saatlik inkübasyonu takiben, solucanları steril M9 çözeltisi ile plakalardan yıkayın ve konik tüplere yerleştirin.
   NOT: Yetişkin solucanlar tüpün dibine batacaktır. Tam süre, 10 cm'lik plakalardan kurtarılan solucanların sayısına göre değişecektir. Bu koşullar altında, solucanlar 10 dakika içinde yerleşir.
6. Yerleşme süresinin süresini belirlemek için görsel inceleme yapın, böylece artık yumurtalar veya yumurtadan çıkmış larvalar çıkarılır.
7. Solucan cisimciklerinden kalan bakterileri durulamak için ilave 10 mL M9 ekleyin.
   1. Solucanları 23 ° C'de 270 x g'de 2-3 dakika santrifüj edin.
   2. Yıkama adımını 3 kez daha uygulayın. En iyi sonuç için, son yıkamadan sonra tüpte yaklaşık 1-1.5 mL M9 çözeltisi bırakın.
   3. Solucan süspansiyonunun 10 μL'sini bir cam slayta aktarın ve solucan sayısını sayın.
   4. Solucan yoğunluğunu 10 μL M9 başına yaklaşık 150 solucana ayarlayın. Süspansiyondaki solucanların konsantrasyonu, santrifüjlemeden sonra M9 çözeltisi çıkarılarak veya eklenerek ayarlanabilir.
   5. İstenilen konsantrasyonun, birkaç farklı damladan gelen sayımların ortalamasıyla oluşturulduğunu onaylayın. En az üç damladan ortalama sayımların yapılması önerilir.
8. Aseptik teknikler kullanarak, yaklaşık 150 solucan içeren solucan süspansiyonunun 10 μL'sini test plakasının her bir kuyucuğuna aktarın.
9. Her birinin yeterli sayıda solucana sahip olduğundan emin olmak için kuyuları mikroskop altında inceleyin. Kuluçkadan önce ek solucanlar eklenebilir.
10. Plakaların yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin; ve daha sonra ters çevirin ve 72 saat boyunca 25 ° C'lik bir inkübatöre aktarın.
    NOT: Son inkübasyon periyodu, deneyin ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde ayarlanabilir. 72 saatlik kuluçka süresi, 25 ° C'de 24 kuyucuklu bir plakada 200 μL bakteriyle beslenen 150 hayvanın büyümesini desteklemek için yeterlidir.

7. Görüntüleme için solucanlar hazırlama

1. Daha etkili yerleşmeyi kolaylaştırmak ve numune kaybını en aza indirmek için, yüzmeyi önlemek için yıkamadan önce solucanları hareketsiz hale getirin.
   NOT: Birkaç numune ile çalışıyorsanız, bu levamisol'e (100 μM) maruz kalarak elde edilebilir. Bununla birlikte, çok sayıda numune ile çalışıyorsanız, solucanlar dondurularak hareketsiz hale getirilebilir. Ek olarak, uzatılmış dondurma (18-24 saat), hazırlık sırasında poliQ agregalarının daha da gelişmesini önleyecektir.
   1. Çok kuyulu plakaları -20 ° C'de 15-20 dakika boyunca veya solucanlar artık hareket etmeyene kadar yerleştirin.
   2. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve 5 dakika bekletin.
2. Bir mikropipet kullanarak, ilgilenilen bir kuyuya 4 ° C'ye soğutulmuş 1 mL M9 ekleyin, solucanları her bir kuyucukta yıkamak için pistonu 4-6 kez tekrar tekrar bastırın ve bastırın.
   NOT: Bazen solucanlar mikropipet uçlarına yapışabilir. Bu nedenle, solucanların karışmasını önlemek için her kuyucuk arasında farklı uçlar kullanılmalıdır.
3. Solucan süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve solucanların dibe batmasına izin verin.
4. Süper natantı aspire edin ve atın. Numuneyi toplam üç kez yıkayın.
5. Solucanlar son yıkama sırasında dibe yerleştikten sonra, solucanları askıya almak için 500 μL bırakarak 500 μL süpernatan aspire edin.
6. Kalan sonsuz süspansiyonu yeni bir düz tabanlı 24 delikli plakaya aktarın ve 48 saat boyunca -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
   NOT: Dondurucu solucanlar arka plan floresansını azaltır ve agregaların daha iyi görselleştirilmesini sağlar.

8. Görüntüleme

1. Plakaları dondurucudan çıkarın ve çözülmeye bırakın, fazla yoğuşmayı silin ve görüntülemeden önce kapağı çıkarın.
   NOT: Görüntü yakalamanın ayrıntıları, kullanılan ekipman ve yazılıma göre değişiklik gösterir. Bu bölüm için protokoller yalnızca bir kılavuz görevi görmelidir ve değişiklikler beklenir. Tiff dosya formatında görüntü yakalamak da gereklidir.
2. Görüntü yakalama sırasında aşağıdaki mikroskop ayarlarını kullanın: Pozlama süresi, 500 ms; 0,63x kamera adaptörü (25,2x) ile 40x büyütme, GFP yoğunluğu %100'e ayarlanmıştır.
   NOT: Çeşitli mikroskop konfigürasyonları ve sistemleri, sonuçlar bölümünde sağlananlardan farklı görüntüler elde edebilir. Gerekli görüntülerin daha evrensel bir tanımını elde etmek için, görüntülerle ilgili daha objektif ayrıntılar sağlanır. Agregaların CellProfiler tarafından düzgün bir şekilde tanımlanabilmesi için 1,0-10,0 piksel çapında ve floresan yoğunluğu 0,10-1,0 (rastgele birimler, ölçek 0-1) arasında olmalıdır. Bu toplu görüntüler için floresan arka plan genellikle 0,10 eşiğinin altındadır. Parlak alan görüntüleri için, solucan yoğunluğu 0,7-1,0 arasında değişir ve arka plan yoğunluğu 0,1-0,2 olur. Parlak alan görüntülerindeki solucanların ortalama uzunluğu, baştan kuyruğa uzunluğu 250 piksel ila 350 piksel arasında değişmektedir.
3. Solucanlar karanlık arka plana kıyasla parlak bir şekilde aydınlatılmış görünene kadar iletilen ışık kontrollerini ayarlayın. Aşırı maruz kalmaktan kaçının; solucan boyutunu artıracaktır.
4. Aşırı kümelenmeyi önlemek için solucanların kuyu içindeki konumlarını değiştirmek gerekebilir. Bir pipet ucu kullanarak topaklanmış solucanları dağıtın.
5. Her iki görüntü için de bir odak düzlemi oluşturmak üzere kanalı GFP olarak ayarlayın.
   NOT: Odak düzleminin GFP kanalında belirlenmesi esastır. Parlak alan görüntüleri yakalanırken odakta yapılan herhangi bir değişiklik, görüntü analizi sırasında agregaların ve solucanların yanlış hizalanmasına neden olur.
6. Parlak bir alan görüntüsü yakalayın ve plakayı rahatsız etmeden hemen karşılık gelen floresan görüntüsünü alın.
7. Adım 8.2'den sonraki "NOT"a göre görüntüdeki nesnelerin yoğunluğunu ve boyut değerlerini belirlemek için işlem hattı üzerinden test görüntülerini çalıştırın.
   NOT: CellProfiler, analizden önce nesnelerin yoğunluğu ve uzunluğu ile ilgili gerekli tüm bilgileri sağlayabilir.
8. Görüntüleri değerlendirmek için önce CellProfiler^17'yi indirin. Yazılımı açın ve ilgilendiğiniz görüntüleri sürükleyip Görüntüler kutusuna bırakın.
9. Açmak için dosya listesindeki resimlere tıklayın.
10. Ekranın sol üst köşesinde birkaç simge vardır; nesnelerin boyutunu ölçmek veya belirli bir bölgeyi büyütmek için bunları kullanın. İlgilendiğiniz bir bölgeyi vurgulamak için büyüteç seçin.
11. Hem solucanların hem de agregaların uzunluğunu ölçmek için ok simgesini seçin.
12. Ekranın alt kısmında görülebilen yoğunluk değerini belirlemek için fareyi istediğiniz nesnenin üzerine getirin.
    NOT: Tüm görüntüler gri tonlamalı olarak çekildiğinden, tüm kırmızı, mavi ve yeşil piksel değerleri aynı olacaktır.

9. Görüntü analizi

1. CellProfiler görüntü analizi işlem hattını kullanmak için, görüntü çiftlerini doğru şekilde adlandırın. Şu biçimi kullanın: P1_A01_S1_C1, burada P1 belirli plakayı ve ilgili sayısal tanımını ifade eder; "A", satırı ve "01" sütununu ifade eder; "S", tek bir kuyu için belirli bir görüntü çiftini ifade eder; "C", parlak alan görüntülerini belirtmek için "1" ve floresan görüntüler için "2" nin kullanıldığı kanalı ifade eder.
2. CellProfiler'ı (sürüm 4.1.3 veya üstü) resmi web sitesinden indirin¹⁷.
3. İşlem hattını indirin (Ek Dosya 1). Dosya > İşlem Hattını Dosyadan İçeri Aktar'ı seçerek işlem hattını (İşlem Hattı) CellProfiler'a > yükleyin.
   NOT: Modül 2 ve 3, gereksiz görüldükleri için devre dışı bırakılmıştır. Görüntü analizi solucanların tatmin edici bir şekilde ayrılmasını ve tanımlanmasını sağlamazsa işlevleri geri yüklenebilir; ancak, boru hattının değiştirilmesi gerekmektedir.
4. Bu modülleri dahil etmek için, her modülün solunda bulunan kutuları seçin. "UntangleWorms" modülü için giriş ikili görüntüsünü "convertobjectstoimage" modülünden çıkış görüntüsüne yeniden adlandırın.
5. İlk kullanım sırasında Modül 2 ile ilgili bir hata mesajı görüntülenebilir. Bu durumda, analize devam edin.
6. Solucanları tanımlamak için kullanılan bir eğitim kümesini "UntangleWorms" modülüne yükleyin. Bu eğitim seti Ek Dosya 2'de bulunabilir.
   1. Ayarlarını açmak için UntangleWorms modülünü seçin.
   2. Eğitim Seti Dosyası adını tanımlayın ve dosya yükleme simgesini seçin.
   3. Ek Dosya 2'yi (eğitim seti) yükleyin.
7. Sol üst köşedeki Görseller modülünü seçerek görüntüleri karşıya yükleyin. Adım 9.1'de açıklandığı gibi düzgün adlandırılmış görüntüleri sürükleyip bırakın.
8. Görüntüleri analiz etmeden önce, sonuçları depolamak için kullanılacak istediğiniz çıktı klasörünü seçin.
   1. Programın sol alt köşesinin yanında bulunan Çıktı Ayarları düğmesine tıklayın.
   2. İstediğiniz çıktı konumunu seçmek için Varsayılan Çıktı'nın sağındaki klasör simgesini seçin.
9. Görüntü analizine başlamak için Görüntüleri Analiz Et simgesini seçin.
10. Analizin tamamlanması çok uzun sürüyorsa ve tek bir görüntüyü işlemeye takılıyorsa, bunun nedeni büyük olasılıkla görüntü yakalama sorunlarından kaynaklanmaktadır. Bu durumda, çalıştırmayı iptal edin ve çıktı klasöründe sıralama yaparak ve hangi görüntü adlarının bulunamadığını not ederek işlenmemiş görüntüleri tanımlamaya devam edin.
    NOT: Görüntüler, işlem hattı tarafından işlenemeyen büyük veya yoğun aydınlatılmış yapıları kaldırmak için ek işlem gerektirebilir. Bazı durumlarda, bu tür görüntülerin analizin dışında tutulması gerekebilir.
11. Tam bir analizin ardından, yazılım sonuçları tek tek solucanları (sütun N) ve bunların ilgili toplama sayısını (K sütunu) içeren bir excel elektronik tablosunda düzenleyecektir.
    NOT: Başarılı bir çalıştırma, her kuyucuk için tanımlanan solucan başına toplama sayısını içeren bir excel elektronik tablosu oluşturur. Bu veriler, deneyci tarafından belirlenen bir şekilde manipüle edilebilir.
12. CellProfiler'ın çıktı CSV dosyasındaki verileri uygun şekilde düzenlemek için Ek Dosya 3'ten (Windows) veya Ek Dosya 4'ten (Mac) meta veri düzenleyicisini (Grafik Kullanıcı Arabirimi) indirin.
    NOT: Bu yazılımın resmi bir lisansı yoktur ve indirildikten sonra otomatik olarak açılmayacaktır.
13. Windows işletim sistemi 64 bit kullanıyorsanız 9.14-9.17 arasındaki adımları izleyin. Yazılım, Windows 32-bit üzerinde çalışmaz. Mac OS kullanıyorsanız 9.18-9.20 arasındaki adımları izleyin. 9.21-9.22 adımları her iki işletim sistemi için de aynıdır.
14. Windows işletim sistemi için, indirilen dosyayı bulun ve istediğiniz konuma ayıklayın.
15. gui_windowsOS_64x adlı ayıklanan klasörü bulup açın ve "gui" uygulama simgesine tıklayarak uygulamayı başlatın.
16. Çalıştırmak için izin isteyen bir istem açılabilir. Daha Fazla Bilgi'yi seçin ve ardından Yine de Güven'i tıklatın.
17. Meta veri düzenleyicisi, CellProfiler çıktı CSV dosyalarını sürükleyip bırakmaya hazırdır. Adım 9.21'e geçin.
18. Mac OS için, indirilen dosyayı bulun ve gui_macOS_64x.zip açın. Bu adım tüm dosyaları otomatik olarak ayıklamalıdır.
19. "İndirilenler" bölümünde bulunan ayıklanmış klasörü açın.
20. "gui" uygulamasına sağ tıklayın ve Aç'ı seçin. Resmi bir lisansın olmaması nedeniyle açılması için izin isteyen bir istem görünecektir. Aç'ı seçin ve adım 9.21'e devam edin.
21. Dosyalarınızı Buraya Yükleyin'e tıklayın veya istediğiniz CellProfiler CSV dosyalarını sürükleyip bırakın.
22. Kullanıcıyı Dosyaları İndir düğmesiyle yeni bir ekrana getirecek olan Düzenle düğmesine tıklayın. Düğmeye tıklayın ve çıktı dosyasını kaydetmek için istediğiniz konumu seçin. Çıktı dosyası, dosya adına "_organized" uzantısı eklenmiş orijinal dosya adı olarak görünecektir.

Results

Burada açıklanan, kültürleme ve görüntüleme platformu olarak 24 delikli bir plaka formatı kullanılarak çeşitli bakterilerin varlığında poliQ agregasyonunun değerlendirilmesine izin veren kültürleme, görüntü toplama ve işleme protokollerini içeren bir C. elegans iş akışıdır (Şekil 1). Bu protokol, bakterilerin, spesifik koşulların, küçük moleküllerin, ilaçların veya genomik manipülasyonların konakçı proteostazı üzerindeki etkisini incelemek için ayarlanabilir. Tarif edilen yöntem, sarı bir floresan proteinine kaynaşmış bağırsak poliQ'sunu yapısal olarak eksprese eden solucanlar kullanılarak optimize edilmiştir (vha6p::p olyQ44::YFP); Bununla birlikte, kas veya nöronlardaki proteostazı bildiren diğer modeller de daha fazla optimizasyonla kullanılabilir. Örneğin, ön deneyler, bu yöntemlerin kas poliQ gibi diğer dokulardaki protein agregalarının miktarının belirlenmesinde uygulanmasını göstermektedir (Ek Şekil 1). Bununla birlikte, bölüm 8 NOT'ta belirtildiği gibi, toplam boyut ve parlaklık için uygun şekilde ayarlanması için boru hattında değişiklik yapılması gerekecektir.

Şekil 1: İş akışı görsel gösterimi. Protokolün ana adımları beş ayrı aşamadan oluşur: solucan hazırlama ve yaş senkronizasyonu (adım 1-5), bağırsak kolonizasyonu / solucan tedavisi (adım 6), görüntüleme için örnek hazırlama (adım 7), görüntü elde etme (adım 8) ve görüntü işleme (adım 9). Protokolün "Bölümleri" de şekilde "Adımlar" olarak belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İlk optimizasyon deneyleri, çok sayıda projen nedeniyle aşırı kalabalıkla ilişkili çeşitli zorlukları ortaya çıkardı ve bu da daha hızlı gıda tükenmesine neden oldu. Bölüm 2'de açıklanan NGM plakalarında FUDR takviyesi bu sorunu çözmüştür (Şekil 2). Ek olarak, FUDR varlığında, çeşitli bakterilerle beslenen solucanlar, daha düzgün ve doğru solucan tespitine izin veren daha tutarlı bir vücut boyutuna sahipti.

Şekil 2: FUDR kullanımı, dölleri azaltarak görüntü kalitesini artırır. FUDR takviyeli plakalar, E. coli OP50 ile tohumlanan FUDR olmayan kontrol NGM plakalarında yetiştirilen solucanlara kıyasla C. elegans soyunu ortadan kaldırır . Görüntüler 25,2x büyütmede (0,63x kamera adaptörüyle 40x büyütme) elde edildi. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Arka plan floresansı, poliQ agregalarının yanlış pozitif tespitine katkıda bulunmuştur. Bağırsak sistemindeki bu tür floresan sinyalini azaltmak ve agregaların otomatik olarak algılanmasını iyileştirmek için, görüntülemeden önce solucanların dondurulması gerekiyordu. Solucanların 18-48 saat boyunca -20 °C'de dondurulması, arka plan floresansını ortadan kaldırarak poliQ agrega tespitini önemli ölçüde geliştirdi (Şekil 3A). İnsan gözü, agregalar ve arka plan floresansı arasında ayrım yapabilir; bu nedenle donmadan önce ve sonra manuel sayım aynıdır (Şekil 3B). Bununla birlikte, otomatik sayım o kadar doğru değildir, ancak dondurma, manuel sayımla karşılaştırılabilir doğrulukta otomatik sayımları önemli ölçüde geliştirmiştir (Şekil 3B).

Şekil 3: Donma, agrega tespitini iyileştirir. (A) C. elegans'ın donmadan önce ve sonra bağırsak poliQ44::YFP'yi ifade eden floresan görüntüleri. Ekler, seçilen alanın yakın plan görüntülerini temsil eder. Ölçek çubukları = 500 μm. (B) P. aeruginosa MPAO1 ile kolonize edilen solucanlarda, manuel veya otomatik (boru hattı) agrega miktarı kullanılarak dondurulmadan önce ve sonra bağırsak başına ortalama agrega sayısı. Veriler iki biyolojik replikayı temsil eder (n = 60-109). İstatistiksel anlamlılık Student t-testi kullanılarak hesaplanmıştır (**** p < 0.0001). Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PoliQ44::YFP agregalarını görüntülemek için tüm C. elegans (Şekil 4A) ve GFP kanalını tespit etmek için ters parlak alan aydınlatması kullanıldı (Şekil 4B). Her solucan için solucan algılama, dolaşıklık çözme ve toplama nicelemesi, tek tek solucan başına toplama sayısının elde edilmesini sağlayan iyileştirilmiş bir CellProfiler görüntü işleme ardışık düzeni (Ek Dosya 1) uygulanarak yapılmıştır (Şekil 4C-D). Bu yaklaşımın fizibilitesini ve otomatik agrega tespiti ve niceliğinin doğruluğunu test etmek için, bağırsaklara özgü poliQ44::YFP'yi eksprese eden solucanlar kültüre alınmış ve belirlenen protokollere göre görüntüleme için hazırlanmıştır (bölüm 1-7). Solucan başına düşen agrega sayısı, otomatik işlem hattı (bölüm 8-9) veya el ile sayım kullanılarak değerlendirilmiştir. Her deney, koşul başına 90-571 solucan kullanılarak üç bağımsız çalışmada gerçekleştirildi. İki denemeyle elde edilen bağırsak başına ortalama agrega sayısı anlamlı bir fark göstermezken, üçüncü denemedeki solucanlar otomatik yaklaşım kullanılarak ölçüldüğünde önemli ölçüde daha az agregaya sahipti (Şekil 5A). Üç denemeden elde edilen ortalama agrega sayısı, niceleme CellProfiler boru hattı (bölüm 8-9) kullanılarak yapıldığında biraz, ancak önemli ölçüde daha az agrega ile sonuçlandı (Şekil 5B). Bununla birlikte, iki yaklaşım arasındaki fark çok azdı ve otomatik yöntemin büyük ölçekli ekranlara uygulanabileceğini gösteriyordu.

Şekil 4: CellProfiler kullanılarak toplu algılama . (A) Solucan cisimciklerini tanımlamak için kullanılan Brightfield görüntüsü. (B) GFP kanalı kullanılarak elde edilen ve toplam bağırsak poliQ44::YFP agregalarının sayısını tanımlamak ve ölçmek için kullanılan orijinal floresan görüntü. (C) CellProfiler kullanılarak tanımlanan toplamalar. (D) Orijinal floresan görüntünün üzerine solucan ve agrega anahatları ile üst üste bindirilmiş toplam tanımlanmış agrega sayısı. Görüntü yakalama ve işleme, bölüm 8-9'da açıklanan ayarlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. E-H panelleri, A-D görüntülerinde karşılık gelen ana hatlarıyla belirtilen bölgelerin yakın plan görüntülerini temsil eder. Görüntüler 25,2x büyütmede (0,63x kamera adaptörüyle 40x büyütme) elde edildi. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Otomatik agrega ölçümünün etkinliği. (A) Manuel sayım (Manuel) ve otomatik CellProfiler tabanlı niceleme (Pipeline) kullanılarak kontrol E. coli OP50 ile kolonize edilen solucanlarda bağırsak başına ortalama toplam sayı. Sonuçlar üç ayrı çalışmada (T1-T3) analiz edilen verileri temsil etmektedir (n = 90-571). (B) Bağırsak başına ortalama agrega sayısı, manuel veya otomatik (Boru hattı) agrega ölçümü kullanılarak elde edilmiştir. İstatistiksel anlamlılık Student t-testi kullanılarak hesaplanmıştır (* p < 0.05, ** p < 0.01). Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Farklı deneyciler arasında sonuçların tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, Pseudomonas aeruginosa MPAO1 veya Escherichia coli OP50 ile beslenen altı solucan kuyucuğu içeren bir plakadan alınan görüntüler, ikisi bu protokolleri kullanarak solucanları görüntüleme konusunda daha önce hiç deneyimi olmayan üç kişi tarafından elde edildi. Her kuyudan toplanan görüntüler, tespit edilen 30-115 solucan arasında herhangi bir yerde bulunuyordu. Üç deneyci tarafından görüntülenen aynı kuyulardan solucanlarda toplamada anlamlı olmayan bir fark tespit edildi. MPAO1 ve OP50 ile beslenen solucanlar için üç deneyci arasında bağırsak başına ortalama agrega sayısı çok tutarlı kalırken, ortalama agrega sayısında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar vardı, ancak yalnızca MPAO1 tarafından kolonize edilen solucanlarda (Ek Şekil 2). Bu sonuçlar, deneyimsiz deneyciler arasında bile sonuçların tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır.

Agrega niceliğinin tekrarlanabilirliğinin solucan konumundan önemli ölçüde etkilenmediğinden emin olmak için, 15 solucandan oluşan bir set seçildi ve bir pipet ucu kullanılarak her görüntü yakalama arasında ajitasyonun ardından 15 ayrı kez görüntülendi. E. coli OP50 ve P. aeruginosa MPAO1 ile beslenen solucanlardaki agrega görüntüleri CellProfiler kullanılarak toplandı ve analiz edildi. Bu farklı görüntü kümelerinin her birinden elde edilen ortalama agrega sayısı biraz farklıydı, ancak önemli ölçüde farklıydı ve bu yaklaşımın tekrarlanabilirliğini daha da destekledi (Ek Şekil 3).

C. elegans bağırsağının gram-negatif enterik patojenlerle kolonizasyonunun, dokular arasında proteostazı bozduğu gösterilmiştir, P. aeruginosa, poliQ agregasyonu^9'un en güçlü indükleyicileri arasındadır. Bu optimize edilmiş protokollerin P. aeruginosa aracılı agregasyon artışını başarılı bir şekilde tespit edip ölçmeyeceğini belirlemek için, bağırsak poliQ'sunu eksprese eden solucanlar E. coli OP50 (kontrol bakterileri) ile kolonize edildi ve P. aeruginosa MPAO1, bölüm 1-8 yapıldı. Elde edilen görüntüler CellProfiler kullanılarak analiz edildi (bölüm 9, Ek Dosya 1). Otomatik nicelemenin sonuçları, P. aeruginosa MPAO1 tarafından indüklenen agrega sayısında önemli bir artış olduğunu ve sürekli olarak E. coli OP50 kontrolü ile beslenen solucanlara kıyasla iki kat iyileşme ile sonuçlandığını göstermektedir (Şekil 6).

Şekil 6: Kontrol E. coli OP50 ve P. aeruginosa MPAO1 ile kolonize edilen solucanlarda bağırsak başına ortalama agrega sayısı. Bağırsak başına agrega sayısı CellProfiler kullanılarak değerlendirildi (bölüm 8-9). Veriler, OP50 (n = 1068) ve MPAO1 (n = 1557) ile kolonize edilen solucanlarda bağırsak başına ortalama agrega sayısı olarak gösterilmektedir. İstatistiksel anlamlılık Student t-testi kullanılarak hesaplanmıştır (**** p < 0.0001). Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Optimize edilmiş boru hattı, proteostazı etkileyen koşullar için büyük ölçekli elekleri desteklemek üzere tasarlanmıştır. Bu yaklaşımın konakçı proteostazı üzerindeki etkileri açısından büyük bakteri kütüphanelerinin taranmasında fizibilitesini test etmek için, burada açıklanan boru hattı, 90 P. aeruginosa esansiyel olmayan gen nakavt mutant suşlarının poliQ agregasyonu¹⁸ üzerindeki etkisini test etmek için kullanılmıştır (bölüm 1-9). Bu pilot ekran, konakçı proteostazı etkileme yetenekleri için tüm P. aeruginosa esansiyel olmayan mutant suşlarını taramak için tasarlanmış daha büyük bir projenin parçasıdır. Test edilen 90 bakteri suşundan C. elegans bağırsağının bir adayla kolonizasyonu, agrega sayısında önemli bir azalma göstermiştir (Şekil 7). Bu tahlilin duyarlılığını değerlendirmek için takip deneyleri, MPAO1 kontrolünden anlamlı olmayan bir şekilde farklı olan altı P. aeruginosa mutantının rastgele seçiminden manuel agrega sayımları yoluyla gerçekleştirildi. Bu deneyler, daha geleneksel 6 cm'lik NGM plakaları kullanılarak gerçekleştirildi ve daha önce kurulmuş yöntemleri^9'u özetlemek için solucanları L1'ler olarak test suşlarına aktardı. Manuel sayımla yapılan doğrulama deneyleri, agrega sayısını önemli ölçüde azaltan mutantlar da dahil olmak üzere mutantların hiçbirinin (Şekil 7), poliQ toplamasını etkilemediğini ortaya koymuştur (Ek Şekil 4). Ek olarak, 90 mutant suşun ekranında gözlenen toplamadaki ince değişiklikler, seçilen adayların manuel sayıları arasında tespit edilmemiştir, bu da bu tür değişikliklerin düşük n değeri gibi biyolojik ve deneysel değişkenlik nedeniyle ortaya çıkabileceğini göstermektedir. Toplu olarak, sonuçlar, yöntemimiz önemli değişiklikleri güvenilir bir şekilde toplayabilse de, ince olanların muhtemelen kaçırılacağını ve tüm potansiyel adayların bireysel olarak onaylanması gerekeceğini göstermektedir.

Şekil 7: 92 bakteri suşu tarafından kolonize edilen temsili bir solucan örnek kümesindeki bağırsak başına agrega sayısı. Veriler, MPAO1 ile kolonize edilen solucanlarınkine normalleştirilmiş bağırsak başına ortalama agrega sayısı olarak temsil edilir. Noktalı çizgiler, MPAO1 (üstte, açık daire) ve OP50 kontrolü (altta, açık kare) ile kolonize edilen solucanlardaki ortalama agrega sayısını temsil eder. Katı semboller, P. aeruginosa MPAO1'in 90 farklı nakavt mutant suşunu temsil eder. MPAO1 ile kolonileştirilen solucanlar ile tek bir mutant arasındaki solucan başına ortalama agrega sayısı istatistiksel olarak anlamlıydı. Gri daireler, manuel olarak onaylanan örnekleri temsil eder (Ek Şekil 4). İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karşılaştırma Dunnett'in post-hoc testi (** p < 0.01, **** p < 0.0001) kullanılarak hesaplandı. Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CellProfiler tarafından üretilen büyük miktarda veriyi yönetmek için, veri işleme ve organizasyonu otomatikleştirmek için bir Grafik Kullanıcı Arabirimi (GUI) geliştirilmiştir (Şekil 8). GUI, açık kaynaklı bir Python çapraz platform widget araç seti olan Tkinter kullanılarak geliştirilmiştir. Uygulama, verilen meta verilerden, bir plakada bulunan her kuyucuktan (J Sütunu) agrega sayısını (K sütunu) ayıklar. Yukarıda belirtilen işlemi gerçekleştirmek için "Pandas" adlı bir Python veri işleme kütüphanesi kullanılmıştır. GUI uygulaması, kullanıcıların veri dosyalarını yüklemesi için sürükle ve bırak desteği sağlar. Her dosyadaki veriler, veri çerçevesi adı verilen iki boyutlu bir tablo yapısı biçiminde depolanır. Veri çerçevesi içinde bulunan her benzersiz kuyu için boş bir sözlük çifti başlatılır. Daha sonra, her bir kuyuda bulunan farklı agregalar sayılır ve ilgili sözlük çiftlerine eklenir. Daha az veri içeren sütun, her sütunun eşit boyutta olmasını sağlamak için boş değerli dizelerle doldurulur. Son olarak, yapı, kullanıcı tarafından belirtilen dizine bir elektronik tablo biçiminde dışa aktarılan bir veri çerçevesine dönüştürülür.

Şekil 8: Grafik Kullanıcı Arayüzü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Kaslara özgü poliQ agregalarının tespiti. Kaslara özgü poliQ35::YFP'yi ifade eden solucanlar L1'ler olarak kaplandı ve OP50'de 48 saat boyunca kültürlendi. Solucanlar genç yetişkinlere dönüştüğünde, 24 kuyucuklu NGM plakalarına aktarıldı, 100 μg / mL FUDR ile desteklendi ve görüntülemeden önce 72 saat daha MPAO1 ile tohumlandı. (A) Solucan cisimciklerini tanımlamak için kullanılan parlak alan görüntüsü. (B) GFP kanalı kullanılarak elde edilen orijinal floresan görüntü. (C) CellProfiler kullanılarak tanımlanan toplamalar. (D) Orijinal floresan görüntünün üzerine solucan ve agrega anahatları ile üst üste bindirilmiş toplam tanımlanmış agrega sayısı. Görüntü yakalama ve işleme, bölüm 8-9'da açıklanan ayarlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. E-H panelleri, A-D görüntülerinde karşılık gelen ana hatlarıyla belirtilen bölgelerin yakın plan görüntülerini temsil eder. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Farklı deneyciler arasında toplam nicelemenin tekrarlanabilirliği. P. aeruginosa MPAO1 (siyah çubuklar) ile kolonize edilmiş altı kuyucuk solucan ve kontrol E. coli OP50 (gri çubuklar) ile kolonize edilmiş altı kuyucuk solucan için CellProfiler kullanılarak ölçülen ortalama agrega sayısı. Her kuyu üç deneyci tarafından görüntülendi (AVS, DMC, RDH). Veriler bağırsak başına ortalama agrega sayısı olarak gösterilir (n = 30-115). İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi (* p < 0.05, ** p < 0.01) kullanılarak hesaplandı. Hata çubukları SEM'i temsil eder. Lütfen bu Dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Solucan pozisyonunun agrega niceliğinin tekrarlanabilirliği üzerindeki etkisi. Kontrol E. coli OP50 (gri çubuklar) ve P. aeruginosa MPAO1 (siyah çubuklar) ile kolonize edilen solucanlarda bağırsak başına ortalama agrega sayısı. Sonuçlar, CellProfiler kullanılarak ölçülen bağırsak başına ortalama agrega sayısını (15≥n≥12) temsil eder. Solucanların kuyular içindeki konumu, her edinim arasındaki ajitasyonla değiştirildi. Her iki grupta da istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi kullanılarak hesaplandı. Hata çubukları SEM'i temsil eder. Lütfen bu Dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Pilot ekranın manuel sayma ile doğrulanması. Bağırsak başına ortalama agrega sayısı manuel olarak ölçüldü. Veriler, vahşi tip MPAO1 ve OP50 kontrollerine (n = 30) kıyasla altı MPAO1 nakavt mutantı (gri daireler Şekil 7) ile kolonize edilmiş solucanların toplama profillerini temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve ardından çoklu karşılaştırma Dunnett'in post-hoc testi (**** p < 0.0001) kullanılarak hesaplandı. Hata çubukları SEM'i temsil eder. Lütfen bu Dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: FUDR'nin intestinal poliQ agregasyonu üzerine etkisi. Veriler, bağırsak başına ortalama poliQ44::YFP agregası sayısı olarak gösterilir (n = 20). Solucanlar, E. coli OP50 üzerinde 25 ° C'de 48 saatlik büyümeden sonra kontrol (FUDR yok) veya FUDR içeren plakalara (100 μg / mL) aktarıldı. Manuel sayımlar 48 saat daha sonra toplandı. İstatistiksel anlamlılık, Öğrencinin t-testi kullanılarak hesaplanmıştır (ns = anlamlı değildir). Hata çubukları SEM'i temsil eder. Lütfen bu Dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Proteostaz boru hattı. CellProfiler'da kullanılmak üzere indirilebilir görüntü analizi işlem hattı. Uygulama talimatları bölüm 9'da bulunabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Eğitim kümesi solucanı çözme. "UntangleWorms" modülüne yüklenecek dosya. Bu özel eğitim seti, ilk yaklaşımda kullanılan solucanlara özgüdür. Solucan boyutu ve şeklindeki değişiklikler, tanımlamanın doğruluğunu ve kalitesini değiştirecektir. Daha kişiselleştirilmiş bir eğitim dosyası oluşturmak gerekebilir. Yeni bir eğitim seti oluşturma talimatları resmi CellProfiler web sitesi^17'de bulunabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: Windows İşletim Sistemi için Grafik Kullanıcı Arabirimi. gui_windowsOS_64x.zip. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 4: Mac İşletim Sistemi için Grafik Kullanıcı Arabirimi. gui_MacOS_64x.zip. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Açıklanan protokol, açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı olan CellProfiler'ı içeren C. elegans kültürleme, görüntüleme ve görüntü işleme prosedürlerini özetlemektedir. Temsili sonuçlar tekrarlanabilirliği, önyargının azaltılmasını ve ölçeklenebilirliği gösterir. Bu standartlaştırılmış prosedür, büyük bakteriyel, genomik veya ilaç kütüphanelerinde kullanılan tarama stratejilerini geliştirecektir. Diğer otomatik C. elegans nesne algılama yöntemleri mevcut olsa da, açıklanan teknik, kültürleme, görüntü alma ve analizi entegre eden standartlaştırılmış, daha yüksek verimli bir boru hattı sunar.

Burada açıklanan protokolü optimize etmek için solucan yetiştiriciliğinin çeşitli varyasyonlarının test edilmesi gerekiyordu. Başlangıçta, solucanlar yaş senkronizasyonundan hemen sonra örnek bakterilere aktarıldı (L1 aşaması). Bununla birlikte, böyle bir yaklaşım, aynı kuyudaki solucanlar arasında bile, değişken boyutlarda bir solucan popülasyonu ile sonuçlandı. C. elegans, patojen kaçınma¹⁹ ile bilinir, bu da boyuttaki gözlemlenen değişkenliğe katkıda bulunmuş olabilir ve sonuçta özellikle aşağı akış görüntüleme-solucan tespitini etkileyebilir. Bu değişkenliği ortadan kaldırmak için, her kuyucuktaki tüm NGM alanı test bakterileri ile kaplandı. Ayrıca, solucanlar E. coli OP50 ile beslendi ve 25 ° C'de 48 saat boyunca genç yetişkinlere tamamen gelişmesine izin verildi. Solucanların test bakterilerine aktarılmadan önce E. coli OP50'de yetişkinliğe ulaşmalarına izin vermek, daha tutarlı vücut büyüklüğü ile sonuçlandı. Ek olarak, aşırı kalabalık ve döl tarafından hızlı gıda tükenmesi, NGM agarının FUDR ile takviye edilmesiyle ortadan kaldırılmıştır. FUDR'nin uygulanması, ebeveyn popülasyonuyla karışan soy tarafından gizlenen döl ve gelişmiş otomatik solucan tanımlamasını ortadan kaldırdı. Bununla birlikte, FUDR kullanırken dikkatli olmak ve uygun kontrolleri kullanmak önemlidir, çünkü bileşiğin C. elegans proteostazını ve ömrünü^20,21 etkilediği bilinmektedir. Bu protokolde açıklanan koşullar altında, FUDR bağırsak poliQ agregasyonunu etkilememiştir (Ek Şekil 5); bu nedenle, kullanımı tarif edilen yönteme uygun ve faydalıydı.

Görüntülemeden önce numunelerin dondurulması, boru hattının başarılı bir şekilde kullanılmasında kritik bir adım olduğu ortaya çıktı. Donmadan önceki toplam sayımlar manuel sayımlardan anlamlı derecede yüksekti (Şekil 3B). Görüntülemeden önce solucanları 18-48 saat boyunca -20 ° C'de tutmak, arka plan floresansını azalttı ve sonuçta agrega algılamasını geliştirdi (Şekil 3A). Donmanın agrega tespiti üzerindeki etkileri sadece poliQ için araştırılmıştır ve bu tür etkiler daha fazla araştırılmadan diğer modellere genelleştirilmemelidir.

Tüm koşulların aynı tutulmasına rağmen, solucan başına ortalama agrega sayısının farklı koşular arasında değişebildiği, OP50 ile kolonileştirilen hayvanlardaki agrega sayısı ile MPAO1 arasındaki oranın tutarlı kaldığı gözlenmiştir (Şekil 6, Ek Şekil 2, Ek Şekil 5). Bu nedenle, her çalıştırmada her zaman E. coli OP50 kontrolünü veya herhangi bir ek uygun referans kontrolünü dahil etmek önemlidir. Deneyler arasındaki toplam sayımlardaki bu değişkenlik, çevresel koşullardan (sıcaklık, nem) ^22,23 veya genetik arka plandan etkilenebilir⁸. Aslında, uzun süreli kültürden sonra, bağırsak floresansının büyük ölçüde azaldığı veya tamamen kaybolduğu, bunun da donmuş stoktan yeni bir suşun çözülmesini gerektirdiği gözlenmiştir. Floresanda gözlenen azalma, poliQ'yu ifade edenler gibi toksik transgenleri baskılayan genetik değişikliklerin bir sonucu olabilir. Bununla birlikte, farklı deneyciler arasında (Ek Şekil 2), biyolojik replikasyonlar arasında (Şekil 5) ve aynı örneklem içinde (Ek Şekil 3) gözlemlenen sonuçların istisnai tekrarlanabilirliği bu yaklaşımın gücünü vurgulamaktadır.

Çok sayıda rapor, proteostaz^{9,11,12,13,24,25'i} incelemek için bağırsak ^poliQ'sunu kullanmıştır. Ancak deneysel yaklaşımlar ve okuma yöntemleri arasındaki değişkenlik nedeniyle sonuçlar arasında doğrudan bir karşılaştırma yapılamamaktadır. Bununla birlikte, daha önce yayınlanmış verilerden elde edilen birkaç sonuç, burada açıklanan otomatik niceleme ile özetlenmiştir, buna ^9,13 agregasyonunun bakteriyel indüksiyonu ve karşılaştırılabilir sayıda agrega ¹¹ dahildir. Toplu olarak, tarif edilen boru hattı proteostazı incelemek için değerli bir araç sunmaktadır.

Burada açıklanan yöntemin bazı doğal zorlukları vardır. Örneğin, bu protokolün tüm bileşenlerine hakim olmak için yeterli zaman gerekir, bu da özellikle protokolün 8. bölümü için geçerlidir, bu da elde edilen görüntülerin işlem hattı analizi için uygun olup olmadığını belirlemek için tahlil hakkında bilgi gerektirir. Bu protokolde kullanılan görüntü yakalama ayarlarından sapmalar mümkündür; ancak, ayarların ve solucan eğitim kümesinin değiştirilmesi gerekebilir. Bu işlem hattı, çeşitli boyutlardaki agregaları ve dokunaklı olanları ayırt edebilir, bu da agregaların "harmanlanmasını" sınırlar ve sonuçta algılama hassasiyetini arttırır. Ancak, kabul edilen boyut aralığını aşan büyük toplamaları tanımlamaya çalışırken sorunlar ortaya çıkabilir, çünkü üst boyut eşiğinin genişletilmesi, dokunulan toplamaların ayırt edilememesi gibi zayıf tanımlamanın neden olduğu hatalara neden olabilir. Görüntü analizinden önce doğruluk, boyut ve yoğunluk arasında bir denge bulunmalıdır. Aggregate tanımlamanın verimliliği, agrega algılamayı geliştirebilen bir sinir ağı oluşturmak için makine öğrenimini dahil ederek daha da geliştirilebilir. Bu tür iyileştirmeler şu anda araştırılmaktadır ve farklı odak düzlemlerinde bulunan veya anormal şekillere sahip agregaların tespiti gibi mevcut sorunların ele alınmasında büyük ölçüde yardımcı olacaktır.

Tarif edilen yöntemin dikkate değer bir zayıflığı, otomatik agrega sayımlarındaki değişkenliktir, çünkü bunlar her zaman farklı bakteri suşlarıyla beslenen solucanlarda manuel sayımlarla özetlenmez. Örneğin, otomatik sayımlara dayanarak, P. aeruginosa mutant 53 (M53) ile beslenen solucanlar, vahşi tip suşa (MPAO1) kıyasla önemli ölçüde daha az agregaya sahipti (Şekil 7); Bununla birlikte, isabetin doğrulanması anlamlı bir fark göstermedi (Ek Şekil 4). Genel olarak, yüksek verimli ilaç ekranları yüksek oranda yanlış pozitif isabet tespitine sahiptir ve açıklanan yöntem istisna değildir²⁶. Bu nedenle, tüm potansiyel isabetleri doğrulamak protokolün kritik bir parçasıdır.

Bu protokol, konakçı proteostazını etkileyen bakterileri tanımlamak için bir tarama stratejisine uyacak şekilde optimize edilmiş olsa da, her adım genomik RNAi kütüphanelerinin, küçük moleküllerin veya diğer koşulların etkisini test etmek için daha da değiştirilebilir. Her adımda, belirli bir tarama stratejisinin gereksinimlerine uyacak şekilde ek değişiklikler yapılabilir. Ayrıca, bu teknik, her adımın belirli bir modele uyacak şekilde optimize edilmesini sağlayan bir esneklik düzeyi sağlar. Örneğin, bu yaklaşım diğer dokularda poliQ agregasyonuna veya indüklenebilir floresan muhabirleri (örneğin, ısı şoku genleri) kullanarak gen ekspresyonunu izlemek, proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek (örneğin, DAF-16'nın nükleer lokalizasyonu), diğer hastalık modellerinde (Aβ 1-42, α-sinüklein,_TDP-43, vb.) agregasyonu incelemek veya fizyolojik fenotipleri değerlendirmek gibi görüntülerde tespit edilen diğer özelliklerin çıkarılmasına genişletilebilir. solucan boyutu gibi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Mikrotüpler	Olympus Plastics	Cat # 24-282	Mikrosantrifüj tüpleri
10 mL Serolojik Pipetler	GenClone	Cat # 12-104	Plastik pipetler
15 mL Santrifüj Tüpleri, Raflı	Olympus Plastics	Cat # 28-101	Konik tüpler
5-Floro-2 & prime;-deoksiüridin	Fisher Scientific	D2235100MG	FUDR
Accu-jet Pro Pipet Kontrol Cihazı	Genesee Scientific	91-600RB	Pipet tabancası
Agar	Fisher Scientific Cat	#BP1423-2	Granül agar
BioRender	BioRender		Grafiksel şekil üreteci
Çamaşır Suyu (Normal)	Clorox	Bar# 044600324111, Sıçramasız Çamaşır Suyu	%4,5 sodyum hipoklorit
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]	Morimoto Laboratuvarı (Northwestern Üniversitesi)	AM140, Q35::YFP	Kas poliQ
C elegans: AM738: rmIs297[vha-6p:: q44::yfp; rol-6(su1006)]	Morimoto Lab (Northwestern Üniversitesi)	AM738, Q44::YFP	Bağırsak poliQ
CaCl2· 2H2O	Fisher Scientific	Cat#C79-500	Kalsiyum klorür dihidrat
CellProfiler	Broad Institute		Görüntü analiz yazılımı
Kolesterol	Fisher Scientific Cat	#ICN10138201	Kolesterol
Sirkülasyonlu Su Banyosu Başlığı	Lauda	26LE	Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir montajlı STEREO	CoolLED	8114931	Floresan ışık kontrolü ve yayıcı
16 mL Kültür Tüpleri	Olympus Plastics	21-129	Kültür tüpleri, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50	Caenorhabdit Genetik Merkezi	OP50	E. coli kontrol suşu
Etanol, 200 Kanıt	Decon Labs, Inc.	2701
Mercek 10x/23B, ayarlanabilir, 3d nesil	Leica Microsystems	10450910	Mercek seti
Filtre Seti ET GFP - MZ10F	Leica Microsystems	10450588	Filtre küpü
GraphPad Prism v9.2.0	GraphPad Software, Inc.		İstatistiksel analiz aracı
Heratherm İnkübatör IMP180	Termo	51031562	Soğutmalı inkübatör
Innova 4000	New Brunswick Scientific	M1192-0000	Çalkalama inkübatörü
K5 Kamera	Leica Microsystems	11547112	Stereomikroskop kamera
KH2P04	Fisher Scientific	Cat#P285-3	Potasyum fosfat monobazik
LAS X Görüntüleme Yazılımı	Leica Microsystems		Mikroskop görüntüleme yazılımı
Leica MZ10 F Optik Taşıyıcı	Leica Microsystems	10450103	Stereomikroskop
Levamizol	Fisher Scientific Cat	#0215522805	Levamizol hidroklorür
Luria Suyu (Lennox)	Apex Bioresearch Products	Kedi# 11-125	LB
Manyetik Karıştırma Plakası	Fisher Scientific	11-100-49S	Karıştırma plakası
MgSO4 & middot; 7H<>sub2O	Alfa Aesar	A14491	Magnezyum sülfat heptahidrat
Mikroskop Slaytları	Premiere	8205	Tek buzlu mikroskop slaytları
Na2HPO4· 7H2O	Fisher Bilimsel	Kedi # S373-500	Sodyum fosfat dibazik heptahidrat
NaCl	Fisher Bilimsel Kedi	# S671-500	Sodyum klorür
NaOH	Fisher Bilimsel	Kedi # S318-3	Sodyum hidroksit peletleri
Objektif Akromat, f = 100 mm	Leica Microsystems	10411597	Objektif mikroskop lensi
Petri Kapları	Genesee Scientific	Cat # 32-107G	100 mm x 15 mm
< em>Pseudomonas aeruginosa< / em> Mutant Kütüphanesi	Manoil Lab (Washington Üniversitesi)		P. aeruginosa< / em> Mutant
Kütüphanesi Süspansiyon Kültür Plakası 24 Kuyulu, Düz Tabanlı	Olympus Plastics	25-102	Solucan büyümesi ve görüntüleme için kullanılır
Trinoküler Tüp %100 M-serisi	Leica Mikrosistemler	10450043
Triptikaz Pepton	ThermoFisher, Difco	Cat # 211921
TX-400 Rotor	Thermo Scientific	Cat # 75003181	Salıncak kova rotoru
Vakum Tahrikli Filtre Sistemi	GenClone	Cat # 25-227	500 mL, PES Membran, .22 ve mikro; C
Leica Microsystems	10447367	0.63x kamera adaptör tüplü	Video Objektifi