Bu protokol, Streptomyces venezuelae hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sisteminden yüksek rekombinant protein verimini sentezlemek için geliştirilmiş bir yöntemi detaylandırmamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti
Bu makalede
Özet
Özet
Streptomices spp. klinik antibiyotiklerin ve endüstriyel kimyasalların önemli bir kaynağıdır. Streptomices venezuelae ATCC 10712, hızlı büyüyen bir suş ve doğal bir kloramfenikol, jadomycin ve pikromisin üreticisidir, bu da onu yeni nesil sentetik biyoloji şasisi olarak çekici bir aday haline getirir. Bu nedenle, S. venezuelae ATCC 10712'nin ve diğer Streptomyces spp. modellerinin gelişimini hızlandıran genetik araçlar, doğal ürün mühendisliği ve keşfi için son derece arzu edilir. Bu amaçla, yüksek G+C (%) genlerinin yüksek verimli heterolog ekspresyonlarını sağlamak için bu protokolde özel bir S. venezuelae ATCC 10712 hücresiz sistem sağlanmıştır. Bu protokol, 96 kuyu veya 384 kuyu plaka biçimindeki küçük ölçekli (10-100 μL) parti reaksiyonları için uygundur, reaksiyonlar ise potansiyel olarak ölçeklenebilir. Hücresiz sistem sağlamdır ve minimum kurulumda bir dizi rekombinant protein için yüksek verim (~5-10 μ M) elde edebilir. Bu çalışma ayrıca mRNA ve protein sentezinin gerçek zamanlı ölçümü ve etiketli proteinlerin jel içi floresan boyanma için geniş bir plazmid araç seti içerir. Bu protokol ayrıca yüksek verimli gen ekspresyon karakterizasyon iş akışları veya Actinomycetes genomlarında bulunan yüksek G+C (%) genlerinden enzim yollarının incelenmesi ile entegre edilebilir.
Giriş
Hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sistemleri, sentetik biyoloji için kavramsal mühendislik çerçevesi olan hızlı tasarım-yap-test-öğrenme döngülerini uygulamak için sentetik biyoloji için ideal bir prototipleme platformu sağlar1. Buna ek olarak, açık reaksiyon ortamında yüksek değerli rekombinant protein üretimi için TX-TL sistemlerine olan ilgi artmaktadır2, örneğin, antikor-ilaç konjugelerine standart dışı amino asitleri dahil etmek3. Özellikle, TX-TL bir hücre özü, plazmid veya doğrusal DNA ve protein sentezini toplu veya yarı iletken reaksiyonlarda katalize etmek için bir enerji çözeltisi ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: GYM orta ve agar tabağı ile S30A ve S30B yıkama tamponları tarifleri için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakın.
1. Çözümlerin hazırlanması ve genel rehberlik
- Bir istisna belirtilmedikçe, hazırlık sonrası tüm çözeltileri, hücreleri (büyüme sonrası) ve hücre özlerini buz üzerinde tutun.
- Oda sıcaklığında 1 M Mg-glutamat, 4 M K-glutamat, %40 (w/v) PEG 6000, 1 g/mL polivinilsülfiyonik asit ve diğer tüm stokları -80 °C'de saklayın. Kimyasal bozulmayı önlemek için donma-çözülme döngülerinin sayısını en aza indirin.
- 3-PGA (pH ayarı gerektirir) gibi enerji çözeltisi stoklarının hazırlanmas....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu ayrıntılı protokol, kullanıcının S. venezuelae ATCC 10712 model suşuna dayalı bir Streptomyces TX-TL sistemi kurmasına yardımcı olmak için bir örnek olarak sağlanmıştır (Şekil 1). Kullanıcı diğer Streptomices suşlarını incelemeye çalışabilir; bununla birlikte, daha uzun iki katına çıkış süreleri veya farklı büyüme tercihleri ile diğer suşların büyüme/hasat aşamalarının en yüksek sonuçları elde etmek için özel olarak optimize edilmesi gerekecektir. Temsili sonuç .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, TX-TL sistemlerinin hem deneyimli hem de yeni kullanıcıları için yürütülmesi kolay ayrıntılı adımlarla yüksek verimli bir S. venezuelae TX-TL protokolü açıklanmıştır. Mevcut Streptomyces45 ve E. coli TX-TL41 protokollerinden çeşitli özellikler, S. venezuelae TX-TL5,26 için minimal, ancak yüksek verimli bir protokol oluşturmak için kaldırılmıştır. Burada önerilen iş akış.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar aşağıdaki araştırma desteğini kabul etmek isterler: PSF'li bir PDRA olarak SJM için EPSRC [EP/K038648/1] ; Wellcome Trust, Imperial College London'da PSF ile SJM için ISSF bursu sponsoru oldu; Royal Society araştırma hibesi [RGS\R1\191186]; Kent Üniversitesi'nde SJM için Wellcome Trust SEED ödülü [217528/Z/19/Z]; ve Kent Üniversitesi'nde KC için Global Challenges Araştırma Fonu (GCRF) doktora bursu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2,5 L UltraYield Şişe | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (%>93) | Sigma | P8877 | |
| 384 Kuyu Siyah/Şeffaf Alt Plaka | ThermoFisher | 10692202 | |
| Amonyum klorür (%98) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM çözelti, %>99) | ThermoFisher | R0481 | |
| Karbenisilin (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glikoz (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥ %98 - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glikoz-6-fosfat (%>98) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Serbest Asit (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin) | Melford | B2001 | |
| L-glutamik asit hemimagnezyum tuzu tetrahidrat (%>98) | Sigma | 49605 | |
| Magnezyum klorür (%98) | Florohem | 494356 | |
| Malt özü | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96 kuyulu Mikrodiyaliz Plakası, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poli(vinil sülfat) potasyum tuzu | Sigma | 271969 | |
| Potasyum glutamat (%>99) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino asit örnekleyici | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodyum klorür (%99) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE kolonu (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Maya Özü | Melford | Y1333 | |
| Ekipman< / güçlü > | |||
| Plaka Okuyucu | BMG | Omega |
Kaynaklar
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
