Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

Summary

Yüksek çözünürlüklü bir ışık sıvazlama aracı kullanarak bakteri hücrelerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanıldığı bildirilmektedir. Sürecin temel deneysel prosedürleri, sonuçları ve avantajları gözden geçirilmiştir. Yöntem, heterojen topluluklardan veya popülasyonlardan nadir veya benzersiz işlevler gösteren hedeflenen bakterilerin hızlı ve ucuz izolasyon edilmesini sağlar.

Abstract

Biyologlar uzun zamandır fenotip ve genotip arasındaki ilişkiyi anlamaya çalıştılar. Bu bağlantıyı daha iyi anlamak için, aşağı akış genetik analizi için mikroskobik hücre taramasını hücre izolasyonu ile yüksek saflıkta birleştirilen pratik teknolojiler geliştirmek çok önemlidir. Burada, heterojen hücre popülasyonlarından benzersiz büyüme fenotiplerine sahip bakterilerin taranır ve izolasyonu için fotobozunur poli (etilen glikol) hidrojellerin kullanımı açıklanmıştır. Yöntem, hücreleri hidrojel ile kapsüllemek veya içine almak, ardından kültür, mikroskobik tarama, daha sonra hidrojel bozulmasının mekansal kontrolü ve seçilen hücrelerin geri alma için bir çözeltiye salınması için yüksek çözünürlüklü bir ışık desenleme aracının kullanılmasına dayanır. Farklı ışık desenlerinin uygulanması, çıkarılan hücrenin morfolojisi üzerinde kontrol sağlar ve izolatlardaki DNA hasarını azaltmak için halkalar veya haçlar gibi desenler, en az doğrudan UV ışığına maruz kalan hücreleri almak için kullanılabilir. Ayrıca, ışık desenleme aracı, çeşitli bozulma ve hücre salınım hızlarına ulaşmak için ayarlanabilir bir ışık dozu sunar. Mikron ölçeğinde uzamsal hassasiyetle hücre alımını sağlayarak yüksek çözünürlükte bozulmaya izin verir. Burada, bu malzemenin hem dökme hidrojellerden hem de çip üzerindeki mikrofabrik laboratuvardan bakterileri taramak ve almak için kullanımı gösterilmiştir. Yöntem ucuz, basittir ve mutant kütüphanelerden nadir büyüme profillerine sahip bakteri suşlarının izolasyonu ve genomik karakterizasyonlar için acil fenotipli bakteri konsorsiyumlarının izolasyonu da dahil olmak üzere mikrobiyolojide yaygın ve gelişmekte olan uygulamalar için kullanılabilir.

Introduction

Karmaşık ve heterojen bir ortamdan benzersiz davranışlara sahip hücrelerin izolasyonu biyolojide genetik bilgi elde etmek için temeldir¹. Mikrobiyolojide, genomik bilgiler ile gözlemlenebilir fenotipik bilgiler arasında bağlantı gerektiren birçok uygulamada nadir veya benzersiz mikropların gözlemden sonra seçilmesi ve izolasyonu önem kazanmaktadır. Bu uygulamalar arasında mutant kütüphanelerden fenotipik olarak nadir suşların seçilmesi², karmaşık mikrobiyal topluluklardan kilit taşı mikroorganizmalarının seçilmesi^3,4ve izojenik popülasyonlardan fenotipik olarak nadir ancak önemli bakterilerin seçilmesi yer almaktadır. Canlı ancak kültüre dönüştürülemeyen hücrelerin (VBNC) bakteri popülasyonundan izolesi, VBNC fenotipine sahip hücrelerin genellikle 1:10² ila 1:10 5 oranlarında^{5 ,6'da}bakteri popülasyonlarında gizlendiği ikincisinin önemli bir örneğidir. Bakteri izolasyonundaki yaygın zorluklar nedeniyle, birçok fenotipik olarak nadir mikroorganizma hakkında çok şey bilinmemektedir. Bu sınırlamalar, önce hedef hücreyi veya hücreleri bir karışımdan tanımlamak ve daha sonra aşağı akış moleküler analizi için bunları almak ve izole etmek için hücre izolasyon tekniklerine duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır⁷.

Hücre izolasyonunun en yaygın yöntemlerinden bazıları akış sitometrisi ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)⁸, immünmanyetik ayırma^9,10ve mikroakışkanlar^{11 'dir.} Bu yalıtım yöntemleri yüksek değere sahip olsa da, kullanımlarını sınırlayan dezavantajları da vardır. Örneğin, FACS takip genomik analizi için tek hücreli düzeyde rutin mikrobiyal izolasyon sağlayabilir^3, ancak genellikle kullanılabilirliği ve giderinin yanı sıra aşağı akış kontaminasyon sorunları ile sınırlıdır¹¹. Mikroakışkan akış sitometrisi gibi mikroakışkan tabanlı yaklaşımlar, geleneksel akış sitometrisine kıyasla, gerekli numune hacminde önemli bir azalma sağlayan çok dikkat çekmiş¹². Bununla birlikte, mikroakışkan cihazlardan bireysel veya küçük hücre koleksiyonlarının ayrılması ve alınması genellikle daha karmaşık bir kurulum ve cihaz tasarımı gerektiren zorlu bir sorundur¹³. Birçok mikroakışkan tabanlı yaklaşım, hücreleri bir cihazda girilmeden ve gözlemlenmeden önce genetik olarak karakterize edilir¹⁴fonksiyonel bir ekran gerçekleştirirken gözlenen benzersiz türlerin sayısını sınırlar. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, birçok laboratuvarda yaygın kullanım için hücre taraması ve izolasyon için pratik olan hem yöntemlerin hem de malzemelerin daha fazla yenilendirilerek yenilendir.

Bu makale, bakteri taraması ve izolasyonu için yeni, malzeme tabanlı bir yaklaşım salamektedir. Yöntem, hücre kapsülleme, kültür, mikroskobik gözlem ve benzersiz fenotiplere sahip hedeflenen bakterilerin isteğe bağlı salınımı ve geri kazanımı için fotobozunur hidrojeller kullanır. Hidrojeller, her çapraz bağlantının o-nitrobenzyl grupları 15 içerdiği^{10 nm}ağ boyutu içerecek şekilde tasarlanmıştır. Malzeme, besin maddelerinin ve atık ürünlerin kültür için hücrelere ve hücrelerden yayılmasına olanak tanırken hücreleri gözlem için kapsüller veya hapsedir. Malzemenin dik bir mikroskopla desenli 365 nm UV ışık kaynağına maruzlenmesi, o-nitrobenzil gruplarının fotokopleajı yoluyla hidrojelin lokal olarak bozulmasını sağlar^16,17. Bozulma, genomik ve potansiyel olarak proteomik ve transkriptomik analiz de dahil olmak üzere aşağı akış analizi için hücrelerin seçici olarak geri salınımını tetikler. Deneysel kurulum ve protokol nispeten basit, ucuz ve mikrobiyoloji laboratuvarlarına çeviriseldir. Sadece hidrojel oluşumu yoluyla hücre kapsüllemesi, yakalanan hücrelerin dik bir parlak alan ve floresan mikroskopla gözlemlenmesi ve geri alma için desenli bir UV ışık kaynağı ile ilgi çekici hücrelerin aydınlatılmasını gerektirir.

Taramaya yönelik bu materyal tabanlı yaklaşımın önemli bir avantajı, farklı tarama formatlarına uyarlanabilirliğidir. En temel formatında, malzeme dökme hidrojellerde heterojen bir hücre koleksiyonunu kapsülleyerek tarama için kullanılabilir. Hücreler daha sonra istenen fenotip için gözlenir ve genomik karakterizasyon için tek tek ilgi çekici hücreler çıkarılır. Daha ayrıntılı formatlarda, malzeme, cihazın istenen alanlarından hassas hücre salınımı ve alımı sağlamak için çip üzerindeki laboratuvar cihazlarına da entegre edilebilir. Her iki format da burada açıklanmıştır ve her ikisi de son zamanlarda yeni mikrobiyal tarama ve seçim uygulamalarını^{etkinleştirdi 17,18,19}. Yöntem burada model Gram-negatif organizmalar(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) ve bir model Gram-pozitif organizma (Bacillus subtilis) ile gösterilmiştir ve çeşitli diğer bakterilere kolayca genişletilmiştir.

Protocol

1. Bakteriyel suşlar ve kültür protokolleri

1. Uygun büyüme ortamı ile desteklenmiş agar plakalarında bakteri kolonileri. Bu raporda, B. altyazı (gerinim 1A1135, Bacillus Genetik Stok Merkezi) ATGN (0.079 M KH 2 PO₄, 0.015 M (NH₄)₂SO₄, 0.6 mM MgSO₄·7H₂O, 0.06 mM CaCl₂·2H₂O, 0.0071 mM MnSO₄· H₂O, 0.125 M FeSO_4· 7H₂O, 28 mM glikoz, pH: 7 ± 0.2, 15 g/L agar) agar plakaları 100 μg/mL spektinomisilin ve E. coli (strain 25922, ATCC) ile desteklenmiş ATGN agar plakaları 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiştir.
   NOT: Fattahi ve ark.^19'dan bu malzemelerle hidrojel kapsülleme ve serbest bırakma raporları bunun yerine A. tumefaciens C58 hücreleri kullanıldı
2. ATGN agar plakalarından istediğiniz kolonileri seçin ve gece kültürlerine başlayın. Burada kullanılan E. coli ve B. subtilis suşları için, 24 saat boyunca ATGN sıvı ortamda 215 rpm'de sallanırken 37 °C'de kültür. Hücre kültürlerini gelecekteki kullanıma kadar -80 °C'de P gliserol içinde saklayın.
3. Steril aşılama döngüleri kullanarak gliserol stoklarından her iki türün kolonilerini seçin ve ATGN sıvı ortamlarında 37 °C ve 215 rpm'de 24 saat kuluçkaya yatırın.

2. Hidrojel oluşumu için gerekli malzemenin hazırlanması

1. Fotobozunur PEG-o-NB-diakrilat sentezi
   NOT: PEG-o-NB-diakrilitin şirket içi sentezi iyi tanımlanmış ve daha önce^16,17olarak bildirilmiştir. Alternatif olarak, sentez rutin olduğundan, kimyasal bir sentez tesisinden dış kaynaklı olabilir.
2. Çapraz bağlama arabelleği
   1. Bakteriyel suş için seçilen ortamın tarifini alın ve 2x besin ile medya hazırlayın. Fosfat ekleyin, örneğin, NaH₂PO_4, 100 mM'lik son konsantrasyona orta ila. Ardından, 5 M NaOH (aq) kullanarak pH değerini 8 olarak ayarlayın.
   2. Tampon çözeltisini sterilize edin ve bir sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
      NOT: Bu metaller tiyollerin oksidasyonunu disülfidasyona katalize ettiği için medyada bulunan geçiş metallerini dışarıda bırakın.
3. PEG-o-NB-diakrilat çözümü
   1. Aliquot PEG-o-NB-diakrilit (3.400 Da moleküler ağırlık) tozunun her mg'ı için, 49 mM PEG-o-NB-diakrilit konsantrasyonuna (98 mM akrilat konsantrasyonu) ulaşmak için 3,08 μL ultra saf su ekleyin.
   2. Çözeltiyi iyi karışana kadar vorteks edin ve bu çözeltiyi bir sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
4. 4 kollu PEG-thiol çözümü
   1. 4 kollu PEG-thiol (10.000 Da moleküler ağırlık) hazırlama için, 20 mM konsantrasyona (80 mM tiyol konsantrasyonu) ulaşmak için mg tozu başına 4 μL ultra saf su ekleyin.
   2. Bu çözeltiyi iyi karışana kadar vorteks edin ve daha fazla kullanıma kadar bu çözeltiyi -20 °C'de saklayın.

3. Perfloroalkylated (reaktif olmayan) kapak kapaklarının hazırlanması

1. Polipropilen slayt postalayıcının içine 5 adede kadar cam slayt (25 mm x 75 mm x 1 mm) yerleştirin. Slaytları 20 dakika boyunca% 2 (w / v) deterjançözeltisi (Malzeme Masası)ile sonicate edin.
2. Slaytları ultra saf suyla üç kez durulayın, ardından slaytları 20 dakika boyunca suda sonicate edin. Slaytları N₂akışı kullanarak kurutun.
3. Plazma temiz (bkz. Malzeme Tablosu)cam slaytların her iki tarafında 2 dakika boyunca bölüm 4.1'deki protokole göre.
4. Plazma temizlenmiş slaytları slayt postalayıcısına geri yerleştirin ve kabı toluen içinde% 0,5 (v/v) trikloro (1H, 1H, 2H, 2H, 2H,-perflorooctyl)silane çözeltisi ile doldurun. Bu cam slaytların oda sıcaklığında (RT) 3 saat işlevsel hale getirilmesine izin verin.
5. Slaytlar işlevselleştirildikten sonra, slayt postalayıcısı içindeki slaytları önce toluen ve sonraki etanol ile durulayın (her çözücü ile üç kez). Ardından, işlevselleştirilmiş her slaydı N₂akışı ile kurutun.

4. Tiyol fonksiyonelleştirilmiş (baz) kapakların hazırlanması

1. Plazma temizleyici kullanarak cam kapak kapaklarının temizlenmesi
   1. Petri kabına 18 mm x 18 mm kapaklar yerleştirin. Ardından, Petri kabını bir plazma temizleyici odasına yerleştirin ve plazma temizleyicinin gücünü kapatın.
   2. Basınç göstergesi 400 mTorr okuyana kadar hazne içindeki havayı temizlemek için vakum pompasını açın.
   3. Basınç göstergesi sabit bir basınca (800-1000 mTorr) ulaşana kadar havanın odaya girmesine izin vermek için ölçüm vanasını açın. Ardından, "Merhaba" moduna sahip RF'yi seçin ve kapakları 3 dakika boyunca ortaya çıkarın.
   4. 3 dakika sonra RF modunu ve vakum pompasını kapatın.
   5. Petri kabını odadan çıkar, kapakları çevir ve plazmayı cam örtünün diğer tarafını açığa çıkarmak için odaya geri yerleştirin.
   6. Cam kapak kapağının tedavi edilmemiş tarafını plazma olarak temizlemek için 4.1.2-4.1.4 adımlarını tekrarlayın.
   7. İşlemi tamamladıktan sonra Petri kabını hazneden çıkarın ve plazma temizleyiciyi ve vakum pompasını kapatın.
2. Kapak örtülerinin piranha çözeltisi ile temizlenmesi ve hidroksilation
   NOT: Standart piranha temizleme protokolleri cam kaymaları temizlemek ve hidroksilatlamak için kullanılabilir. Piranha çözeltisi H 2 O 2 ve H₂SO_4'ün30:70 (v/v) karışımıdır. Cam kapak örtülerini temizlemek için alternatif yöntemler de kullanılabilir.
   DİkKAT: Piranha çözeltisi organik çözücülerle güçlü bir şekilde aşındırıcı ve patlayıcıdır ve çok dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipmanların (laboratuvar önlüğü, kimyasallara dayanıklı önlük, güvenlik gözlükleri, yüz siperliği, aside dayanıklı butil eldivenler) kullanımı gibi uygun güvenlik ve muhafaza önlemleri uygulanmalıdır. Piranha çözeltisi ile temas eden tüm cam eşyalar ve çalışma yüzeyleri kullanımdan önce temiz, kuru ve organik kalıntılardan arındırılmış olmalıdır. Piranha çözeltisi asla kısmen kapalı veya kapalı bir kapta saklanmamalıdır.
   1. Duman kaputunun altına ayarlanabilir karıştırma hızına sahip bir ocak manyetik karıştırıcıya temiz bir 100 mm x 50 mm cam çanak yerleştirin ve yemeğe 14 mL H₂SO₄ ekleyin.
   2. Teflon kaplı küçük bir manyetik karıştırma çubuğunu, teflon kaplı toksaları çanağın içine hafifçe yerleştirin. Ardından, asidin sıçramasını önlemek için karıştırıcıyı yavaşça çevirin.
   3. Daha sonra, yemeğe 6 mL H₂O₂ hafifçe ekleyin ve çözeltinin iyice karışmasını sağlar.
   4. Karıştırıcıyı kapatın, ardından karıştırıcıyı çatalları kullanarak tabaktan çıkarın. Daha sonra, kapakları tokmakları kullanarak kabın içine hafifçe yerleştirin ve sıcaklığı 60-80 ° C'ye ayarlayın.
   5. 30 dakika sonra, forsepsleri kullanarak kapakları hafifçe çıkarın ve artık piranha çözeltisini yıkamak için iki kez deiyonize su (DI) suyuna batırın.
   6. Su ile durulama yaptıktan sonra, kapak kapaklarını bir sonraki kullanıma kadar RT'de DI suyunda saklayın.
   7. Ocakları kapatın ve piranha çözeltisinin soğumasını bekleyin.
   8. Piranha çözeltisini atmak için, soğutulmuş piranha çözeltisini içeren 100 mm x 50 mm cam kabı, hacmi en az 1,5 L olan daha büyük, boş bir cam kabın içine hafifçe yerleştirin. Daha sonra seyreltmek için 1 L su ekleyin ve nötralize etmek için sodyum bikarbonat tozu ekleyin. Sodyum bikarbonatın kabarcıklanma ve ısı üretimine neden olacağını ve çok yavaş eklenmesi gerektiğini, aksi takdirde kabarcıklanmanın asidin sıçramasına yol açabileceğini unutmayın. Sodyum bikarbonatın daha fazla eklenmesi kabarcıklanmalara neden olmadığında, nötralize edildiğini doğrulamak için pH kağıdı ile pH'ı kontrol edin. Çözelti nötralize edildikten ve soğutulduktan sonra lavabodan aşağı dökülebilir.
3. Kapak örtülerinin thiol fonksiyonelleştirilmesi
   1. Kuru toluene 269 mM (3-mercaptopropyl) trimetoksilane (MPTS) çözeltiden oluşan % 5 (v/v) bir çözelti hazırlayın.
   2. Tek tek 50 mL konik santrifüj tüplerine çözeltinin 10 mL'lik kısmını ekleyin ve her tüpe bir adet temizlenmiş kapak parçası yerleştirin ve çözeltinin içine batırın.
      NOT: 50 mL'lik tüp başına bir kapak, diğer substratlar tarafından rahatsız edilmeden alt tabakanın her iki tarafının da tiyolasyonunu sağlamak için kullanılır.
   3. 4 saat sonra, her kapak saplarını (kapak kapağı başına dört yıkama) toluen, 1:1 (v / v) etanol: toluen karışımı ve etanol ile yıkayın.
      NOT: Bu, her kapak kapağının ardışık olarak bahsedilen çözeltileri içeren konik santrifüj tüplere daldırılmasıyla yapılır.
   4. Substratı durulamadan sonra, etanol içine batırın ve daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Kapakların sayısına bağlı olarak, kapak örtülerinin teker teker tedavi etmesi nedeniyle bu yöntem zahmetli hale gelebilir. Birden fazla kapak için, aynı anda birkaç kapak kılıfı sığdıran Columbia kavanozları kullanılabilir.

5. Silikon microwell dizilerinin imalatı

1. Parilen kaplama: Silikon gofretleri parilenle kaplamak için önceki araştırma makaleleri^20,21'de açıklanan standart protokolü kullanın.
2. Mikrofabrikasyon: Mikrowell dizisini tasarlamak ve imal etmek için Barua ve ark.¹⁸ tarafından açıklanan protokolü izleyin (Tamamlayıcı Şekil 1).
   NOT: Timm ve ark.¹⁷ tarafından tanımlanan standart fotolitografik teknikler, parilen kaplı silikon gofretler üzerinde mikrowell dizileri imal etmek için uygulanmıştır.

6. Hidrojel oluşumu

1. Cam kapaklarda dökme hidrojel oluşumu
   1. Hydrogel öncül çözümü: 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne çapraz bağlama tamponunun 12,5 μL'lik kısmını ve ardından5,6 μL PEG-o -NB-diakrilat çözeltisini ekleyin. Son olarak, karışıma 6,9 μL 4 kollu PEG-thiol çözeltisi ekleyin.
      NOT: Karışıma 4 kollu PEG tiyolü eklemek çapraz bağlama reaksiyonu başlatır. Bu nedenle, hidrojel öncül çözeltisi karıştırmadan hemen sonra kullanılmalıdır.
   2. Hidrojel öncül çözeltisinde hücre kapsülleme için 6.1.3-6.1.9 adımlarını izleyin.
   3. Hücre kapsülleme için, adım 6.1.1'den önce, çapraz bağlama arabelleği istenen hücre yoğunluğuyla aşıla. Daha önce bildirildiği gibi¹⁹, çapraz bağlama tamponundaki 7,26 ×^{10 7} CFU/mL hücre yoğunluğunun hidrojel boyunca kapsüllenmiş ~ 90 hücre/mm² yoğunluğu ile ilişkili olduğu gözlenmiştir.
   4. Tiyolated baz kapak kapağını temiz bir Petri kabına yerleştirin. Kapakçık'ın iki karşı tarafına iki aralayıcı (bkz. Malzeme Tablosu)yerleştirin.
      NOT: Kapakların tiol fonksiyonelleştirilmesi, hidrojel'in kapaklı yüzeye katılması için gereklidir. Bu, yüzeydeki tiyol gruplarının ve hidrojel öncül çözeltisinde bulunan akrilat gruplarının reaksiyonları yoluyla yapılır.
   5. Aralayıcıları Petri kabına bantlayarak taban kapak kapağındaki araları sabitlayın.
   6. Reaktif olmayan, perfloroalkylated cam slayt üzerinde öncü çözeltinin istenen hacmini pipetleyin.
   7. Perfloroalkylated cam slaydı taban kapak çizgisine yerleştirin (Şekil 1C). Hidrojel oluşumunun tamamlanması için RT'de 25 dakika bekleyin.
   8. Jelleşmeden sonra, perfloroalkylated cam slaydı hafifçe çıkarın. Hidrojel taban kapağına bağlı kalacaktır.
      NOT: 12,7 μm kalınlığında bir membran elde etmek için 18 mm x 8 mm kapaklar için, öncü çözeltinin ~7 μL'sini kullanın (Şekil 1A,B). Daha yüksek hacimli öncül çözelti kullanılması, taban kapak kapağının altında hidrojel ile sonuçlanabilir. Bu, taban kapağının Petri kabına yapışıp çıkarılma girişiminde kırılmasına neden olabilir. Ayrıca, kapak altlarındaki hidrojel kalıntısı mikroskopi için sorunludur. Hızlı çıkarma hidrojel zarar verebileceğinden, reaktif olmayan perfloroalkylated cam slaydın nazik bir şekilde çıkarılması gerekir.
   9. Alt tabakayı belirtilen kültür ortamına 60 mm x 15 mm Petri kabına yerleştirin. Burada, B. subtilis için 100 μg/mL spektinomisin veya 37 °C'de E.coli için 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş ATGN ortamları 24 saat kültür süreleri için kullanılmıştır.

Şekil 1: Tiyolated cam kapaklar üzerinde hidrojel oluşumu. (A) 12,7 μm kalınlığında aralayıcılar, reaktif tiyol grupları içeren bir taban örtünün iki zıt tarafına yerleştirilir. (B) Hidrojel öncül çözeltisi reaktif olmayan, florlu bir cam kaydırak üzerine pipetlenmiştir. (C) Reaktif olmayan cam slayt, 12,7 μm kalınlığında hidrojel oluşumu için ara parçaların üzerine yerleştirilir. (D) Reaktif olmayan cam slayt hafifçe çıkarılır ve hidrojel taban kapağına takılı kalır. (E) Hazırlanan hidrojel kültür için medyada kuluçkaya yatırılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Mikrowell dizileri üzerinde hidrojel oluşumu

1. Mikrowell dizilerinde bakteri tohumlama
   NOT: Mikrowell dizisi substratları üzerinden_{700 μL 0.1 OD 600} hücre süspansiyonu tohumlandı ve Timm ve arkadaşları tarafından açıklanan protokol kullanılarak hücreleri arka plandan çıkarmak için parilen kaldırma yöntemiuygulandı. ²².
2. 12,5 μL pH 8 fosfat tamponlu salin ATGN ile 5,6 μL PEG-o-NB-diakrilat ekleyerek ve dört kollu PEG tiyol çözeltisinin 6,9 μL'si ile karıştırarak hidrojel öncül çözeltisini hazırlayın.
3. Reaktif olmayan, perfloroalkylated cam kaydırağına öncü çözeltinin pipeti 12,5 μL ve mikrowell dizisinin hücrelerle aşılanmış iki karşı tarafına iki adet 38 μm çelik ara parçası (bkz. Malzeme Tablosu)yerleştirin.
4. Perfloroalkylated cam kaydırağı öncü çözelti damlacığı ile ters çevirin ve damlacığı mikrowell substratının ortasına yerleştirin. Ardından, hidrojel oluşumu için RT'de 25 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Cam slaydı mikrowell substratından yavaşça çıkarın. Hidrojel membran mikrowell substrata bağlı kalmalıdır. 6.1.9 adımına geçin.

8. Hücre ekstraksiyonu için malzeme hazırlığı

1. PDMS tutucu hazırlığı
   1. On 18 x 18 mm'lik bir kapak yığınını birbirine bantlayın ve bu kapak yığınını bir Petri kabının dibine yapıştırın.
   2. PDMS tutucuları imal etmek için, PDMS öncüsü ve kürleyiciyi plastik bir kapta 10:1 hacim oranında karıştırın, karışımı vakumlu bir kurutucuda gazdan arındırın ve ardından karışımı Petri kabına dökün.
   3. PDMS'yi 80 °C'de 90 dakika boyunca tedavi edin. Ardından, PDMS tutucusunu çıkarmak için bantlanmış bloğun etrafını kesin ve mikroskopi için daha kolay kullanım için PDMS tutucusunu cam bir kaydırağın üzerine yerleştirin.
2. Mikrosiring ve boru hazırlama
   1. 20 cm PTFE boruyu kesin (0.05 I.D.) ve borunun bir ucunu 100 μL mikroliter şırıngaya takın.
      NOT: Ekstraksiyon için, serbest bırakılan hücreleri bir pipet ucuyla çizmek hidrojel yüzeyine zarar verebilir ve kirlenmeye yol açabileceğinden pipet kullanmaktan kaçının.

9. Desenli aydınlatma aracı ile hidrojel bozulması

NOT: Bu bölümde açıklanan aşağıdaki adımlar, 9.6.4-9.6.6 ve 9.6.7-9.6.10 adımlarında açıklanan ışık maruz kalma desenleri dışında hem dökme hidrojeller hem de microwell dizileri için aynıdır.

1. Mikroskobu açın (bkz. Malzeme Tablosu). Ardından, desenli aydınlatma aracını açın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. 365 nm LED ışık kaynağı Analog ve Dijital kontrol modülini açın. Ardından, LED ışık kaynağı kontrol modülini açın.
3. Mikroskop yazılımını ve desenli aydınlatma aracının yazılımını açın. Donanım yapılandırma penceresi açıldığında Yükle düğmesini seçin.
   NOT: Buraya üç cihaz yüklenecektir. (Üçüncü taraf kamera, kontrol modülü ve desenli aydınlatma aracı)
4. Başlat düğmesine basın. Işık desenleme yazılımı penceresi şimdi açılacaktır. Pencerenin sol kenar çubuğundaki ilk seçenek olan Aygıt Denetimi düğmesini seçin.
5. Desenli aydınlatma aracını kalibre edin.
   NOT: Kalibrasyon, ışığa maruz kalma için kullanılacak aynı mikroskop hedefi ve filtre ile yapılmalıdır.
   1. Mikroskop hedefini 10 kat büyütme olarak ayarlayın.
      NOT: Bu büyütme, mikroskop lensi ile numune yüzeyi arasında yeterli çalışma mesafesi sağlar. Ayrıca, alma işlemini görüntü penceresinden gerçek zamanlı olarak izlemenizi ve kaydetmenizi sağlar.
   2. Mikroskop lensini ve filtresini ışığa maruz kalmak için kullanılan ayarlara ayarlayın ve kalibrasyon aynasını mikroskop altına yerleştirin.
   3. Aygıt Denetimi penceresinde LED Denetimi sekmesine basın. LED #1'i açın ve ışık yoğunluğunu istediğiniz sayıya ayarlayın. Standart ekstraksiyon deneylerinde bu ` olarak ayarlanır.
   4. Aygıt Denetimi penceresinde desenli aydınlatma aracı ürün adının yer alan sekmesine basın. Ardından Izgarayı Göster düğmesine basın.
      NOT: Kalibrasyon aynasına bir ızgara deseni yansıtılacaktır.
   5. Izgaranın yüksek görüntü kalitesini elde etmek için mikroskop netliğini ve kamera pozlamasını ayarlayın ve gerekirse ızgara çizgilerini kamera pencere çerçevesine paralel hizalamak için kamerayı döndürün.
   6. Desenli aydınlatma aracı ürün adıyla başlıklı sekmenin altındaki Kalibrasyon Sihirbazı düğmesini seçin ve bu pencerede yazılım tarafından sağlanan yönergeleri izleyin.
      NOT: Üçüncü taraf kamera kurulum penceresi açılacaktır.
   7. Kalibrasyon Türü Seçimi penceresi açılacaktır. Otomatik Kalibrasyon 'u seçin ve İleri 'yebasın.
   8. Ön Kalibrasyon Ayarı penceresi açıldığında, yazılım yönergelerini izleyin ve İleri düğmesine basın.
   9. Eşleme Bilgileri penceresi açıldığında, bu kalibrasyonu istediğiniz klasöre uygun şekilde kaydedin. Bu, tarih, mikroskop adı, objektif lens ve filtre koyarak yapılır.
   10. Kalibrasyondan sonra, gerektiğinde desenli aydınlatma aracının çalışma alanını tanımlamak için desenli aydınlatma aracı ürün adı ile başlıklı sekmenin altında bulunan Çalışma Alanı Tanımı düğmesine basın.
6. Desen hazırlama için Sıralı Tasarım bölümü.
   1. Yazılım penceresinin sol kenar çubuğundaki Sıralı Tasarım düğmesine basın. Ardından Profil Sırası Düzenleyicisi düğmesine basın.
   2. Profil Sırası Düzenleyicisi penceresi açıldığında, Profil Listesialtında Yeni Profil seçeneğini belirleyin.
      NOT: Şimdi, bir Desen Düzenleyicisi penceresi açılacaktır.
   3. Farklı desen şekilleri ve boyutları seçerek ışık maruziyeti için istediğiniz deseni hazırlayın veya isterseniz deseni manuel olarak çizin.
   4. Dökme hidrojel için daire ve kırık çapraz desenler için, adımları izleyin 9.6.5- 9.6.6
   5. Daire desenleri için, tüm koloniyi kapsayacak şekilde bir hedef bakteri kolonisi üzerinde 30 μm çapında bir daire tanımlayın. Şekil dolgu rengi beyazını seçin.
   6. Kırık çapraz desenler için, 3 μm x 8 μm boyutlarında desen çizim penceresinden dikdörtgen şeklini seçin. Bu boyuta sahip dört dikdörtgeni hedef koloninin kenarlarına yerleştirin, desenlerin yarısı koloni ile kaplamaya sahiptir.
   7. Microwell dizileri için daire ve halka desenleri için 9.6.8-9.6.10 adımlarını izleyin.
   8. Daire desenleri için kuyu çevresine 10 μm çapında bir daire çizin. Şekil dolgu rengi beyazını seçin.
   9. Halka deseni için, 20 μm çapında bir daire çizin, kuyunun üzerine yerleştirin ve şekil dolgu rengini beyaz seçin.
   10. Dolgu şekli rengi siyah olan 10 μm çapında başka bir daire deseni çizin ve kuyunun çevresine yerleştirin.
7. Deseni düzenleyin ve istenen ayıklama yöntemine göre şekilleri değiştirin. Desenli aydınlatma aracının çalışma alanında istenen desenin bulunduğundan emin olun.
8. Numuneyi bir PDMS tutucusuna yerleştirin ve numune dehidrasyonunu önlemek ve serbest bırakılan hücreler için bir taşıyıcı çözüm sağlamak için tanımlanan ortamı numunenin üzerine pipetleyin.
9. Ardından, bunu kalibrasyon aynasıyla değiştirin.
10. Hidrojel içindeki kolonilerin keskin bir görüntüsünü elde etmek için mikroskop odağını ayarlayın. İlgi çekici bir koloniyi tanımlamak için kolonileri inceleyin.
11. Burada, kamera görünümü hücre ekstraksiyonu için farklı desenleri test etmek için numunenin içindeki kolonileri gösterirken ışık desenlerini tasarlayın.
12. Tanımlanan deseni kaydedin. Tanımlanan deseni kaydettikten sonra Oturum Denetimi bölümünü seçin.
13. Bu bölümde, desenli aydınlatma aracı ürün adıyla başlıklı sekmenin altına kaydedilen sırayı ekleyin.
14. Sırayı ekledikten sonra, istediğiniz pozlama konumunu görüntülemek ve ayarlamak için deseni simüle etme seçeneğini belirleyin.
    NOT: Desenin hedeflenen alana tam olarak yansıtılmasını sağlamak için örnek konum burada ayarlanabilir.
15. Ardından, LED kontrol sekmesi altında ışık yoğunluğunu `'a ve pozlama süresini 40 s'ye ayarlayın ve pozlama işlemini başlatın.
16. Hücre salınımını sağlamak için hidrojel bozulmasını gerçek zamanlı ve parlak alan modunda izleyin.
    NOT: Hidrojelin istenmeyen alanlarının bozulmasına neden olabileceği ve çapraz kontaminasyona neden olabileceği için ışığa maruz kalma sırasında numuneye herhangi bir hareketi önleyin.

10. Hücre alma

NOT: Hücre alma prosedürü hem dökme hidrojeller hem de mikrowell dizileri için aynıdır.

1. 365 nm ışığa maruz kalma ve hücre salınımı sonrasında, hücreleri bir mikroliter şırınga ve mikroakışkan boru kullanarak toplayın (Şekil 2).
   NOT: Hücre alma işlemi, örüntüye maruz kalma işleminden hemen sonra yapılmalıdır. Bu, serbest bırakılan hücreler ışınlanmış alandan uzaklaşmadan önce yerelleştirilmiş hücre kurtarma sağlar.
2. Numunenin açıkta kalan alanını çıplak gözle görselleştirmek için mikroskobu parlak alandan FITC veya TRITC filtresine değiştirin.
3. Açık alan yerleştirildikten sonra, borunun ucunu ışınlanmış noktaya yerleştirin. Ardından, hücre alımını gerçek zamanlı olarak izlemek için mikroskop filtresini tekrar brightfield olarak değiştirin.
4. Serbest bırakılan hücreleri dikkatlice çekmek için borunun diğer ucuna bağlı şırınnayı kullanın. Çözeltinin 200 μL'lik kısmını çekin ve çözeltiyi DNA analizi veya kaplama için 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.

Şekil 2: Hidrojelden salınan hücrelerin toplanması için ekstraksiyon yönteminin şematik gösterimi. Burada, 365 nm UV maruziyeti, hidrojel bozulması ve hücre salınımından hemen sonra, mikroskop hidrojel örneğini bir TRITC filtresinden gelen ışıkla aydınlatmak için kullanılır ve bu da hücre salınımı gerçekleşen alanı kaplayan parlak yeşil bir nokta ile sonuçlanır. Bu, kullanıcının örnek toplama için uzamsal konumu tanımlamasına yardımcı olan yardımcıdır. Bu alan görselleştirilmesinden sonra mikroliter şırıngasına takılan toplama boruları bu noktaya yerleştirilir ve numune toplanır. 10x büyütmede Brightfield mikroskopisi, hassas hücre toplama için boru ve hidrojel yüzeyinin ucunu gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

11. Genomik DNA saflaştırma ve DNA kalite ölçümü

1. Bakteri izolelerinden DNA çıkarmak için DNA saflaştırma kiti (bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
   1. Tampon AE ile elution gerektiren son adıma kadar (adım^{7) 23} DNA temizleme kiti el kitabında açıklanan üreticinin spesifikasyonunu izleyin.
   2. Elution adımı için, 200 μL yerine 100 μL Tampon AE kullanma farkıyla üreticinin spesifikasyonunu izleyin.
   3. 11.1.2 adımında açıklandığı gibi elution'ı bir kez tekrarlayın. Bu adım genel DNA veriminin artmasına neden olmaktadır.
2. UV-Vis spektrofotometre kullanarak DNA kalitesini ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Spektrofotometreyi açın. Aygıtın başlatılmasından sonra, giriş sayfasında ekranda dsDNA seçeneğini belirleyin.
   2. Ardından, kaide kolunu kaldırın ve kaide pozisyonunu DI suyu ve tüy bırakmayan mendillerle temizleyin.
   3. Pipet 2 μL boş bir çözelti, burada AE tamponu, kaide pozisyonunda ve kaide kolunu hafifçe aşağı getirin ve ekranda Boş'u seçin.
   4. Daha sonra kaideyi kaldırın ve kaide pozisyonunu DI suyu ile temizleyerek önceki ölçümden kalan malzemeleri çıkarın.
   5. Örneği (2 μL) kaide konumuna yükleyin, kaide kolunu aşağı getirin ve ekrandaki Ölçü düğmesini seçin.
   6. Tüm örnekler için 11.2.4 ve 11.2.5 adımlarını yinele.
   7. Ölçüm yapıldıktan sonra ekranda "Denemeleri Sonlandır"ı seçin. Flash sürücüyü cihaza takın ve ekrandaki "Verileri dışa aktar" tuşuna basın.

12. Hidrojel ve mikrowell özlerinden hücre canlılığının belirlenmesi

1. Bakteriyel süspansiyonları 96 kuyulu bir plaka kullanarak^{10 5} seyreltme faktörü ile seyreltin.
2. Seyreltilmiş bakteri süspansiyonunun pipet 10 μL'si ve her bakteri süspansiyonu için ATGN plakalarında üç kez noktalayın.
3. Hücreleri ağar yüzeylere yaymak için plakaları eğin. Bakteriyel süspansiyonları içeren ATGN plakalarını havayla kurutun.
4. Plakaları 37 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın. Koloni Oluşum Birimleri (CFO) sayılarını sayın ve kaydedin. Her plakadaki üç bakteri süspansiyonu yayılımını da sayın.
   NOT: Plakanın kirlenmesini önlemek için biyolojik güvenlik kabininde 12.1-12.4 arası adımları uygulayın.

Results

UV ışığının hücre salınımı için kontrollü hidrojel bozulmasını tetikleme yeteneğini araştırmak için, hidrojeller ilk olarak bakteri olmadan tiyolated coverlips üzerinde kapsüllendi. Her hidrojel, farklı yoğunluklarda ve maruz kalma sürelerinde üç ayrıştırılmış ışık çemberi desenine maruz kaldı. Yüzde jel bozulması, her ışık yoğunluğunda UV ışığına maruz kaldıktan sonra hesaplandı ve maruz kalma süresi daha sonra floresan görüntüleme için floresan-5-maelimide boyası ile kolye tiyol gruplarının birleştirilmesiyle ölçüldü^19,24. Bu iki parametrenin hidrojel bozulmasına nasıl etki ederek etkilediğine dair temsili bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. Belirgin olduğu gibi, desenli aydınlatma aracı tarafından sağlanan desenli ışık, hidrojel bozulmasının sadece az sayıda hücrenin salınmasını mümkün kılacak bir çözünürlükte mekansal-zamansal kontrolünü sağlar.

Şekil 3: Hidrojel bozulması üzerinde kontrol. UV ışık dozu ve elde edilen hidrojel bozulma oranı desenli aydınlatma aracı ile ayarlanabilir. (Giriş) Desenli hidrojel bozulması için iki farklı ışık yoğunluğu seçildi. 365 nm UV ışığa maruz kaldıktan sonra, hidrojeller floresan görüntüleme için floresan-5-maleimid ile etiketlendi. Fattahi ve ark.¹⁹ Telif Hakkı 2020 Amerikan Kimya Derneği'nin izniyle yeniden basıldı (uyarlandı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre ekstraksiyonu için hücre salınımını araştırmak için farklı ışık desenleri kullanılmıştır (Şekil 4). Burada, Agrobacterium bakteri hücreleri tiyolated cam kapaklar üzerinde dökme hidrojellere kapsüllendi, daha sonra mikro ölçekli koloniler halinde kültüre edildi. Hidrojeller daha sonra brightfield mikroskopisinde incelendi ve hedeflenen mikrokolonlar çeşitli UV ışık desenlerine maruz kaldı. Farklı maruz kalma örüntülerinin salınan hücrelerin morfolojisini etkilediği gözlendi. Bu, çeşitli uygulamalar için potansiyel olarak faydalıdır. Örneğin, hedef koloninin etrafındaki bir halka deseninin açığa çıkması, hala koruyucu bir PEG hidrojelinde kapsüllenmiş ve hücreleri koruyabilen ve kolay aşağı akış saflaştırması sağlayabilen doğrudan UV ışığına maruz kalmadantümkoloninin salınmasıyla sonuçlanır. Buna karşılık, koloninin bir kısmını veya tamamını UV ışığına maruz kalarak, hücreler birleştirilmiş hücre kümeleri (Şekil 4B) veya serbest, tek tek hücreler (Şekil 4C) olarak çıkarılabilir.

Şekil 4: Çıkarılan hücrelerin morfolojisi üzerinde kontrol. (A) Peg matrisinde korunan tüm hücre kolonisini serbest bırakmak için halka deseninin kullanılması. (B) Agregalarda hücre salınımı için kırık bir çapraz desen kullanımı. (C) Tek tek hücreleri serbest bırakmak için çapraz desen kullanımı. Fattahi ve ark.^19'dan izin alınarak yeniden basıldı (uyarlandı) Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kapsülleme protokolünde kritik olan, hem hücre tohumlama yoğunluğu hem de hidrojel kalınlığıdır, çünkü bu parametrelerin her ikisi de gözlem için hidrojelde bulunan hücre sayısını etkileyebilir. Göstermek için, A. tumefaciens hücre örnekleri ince ara parçalar (12.7 μm) veya kalın ara parçalar (40 μm) kültürlü kullanılarak iki farklı kalınlıkta hidrojel içine kapsüllendi ve belirlenen protokolleri izleyerek görüntülendi. Daha ince hidrojeller, minimum koloni çakışmasının gözlendiği hidrojel boyunca 90 koloni / mm² mikrokolony yoğunluğuna neden oldu (Şekil 5A). Buna karşılık, 12,7 μm'den büyük hidrojel kalınlıkları dikey yönde üst üste binen kolonilerin oluşmasına neden oldu (Şekil 5B), bu da birden fazla koloninin çıkarılmasına neden olabilir. Üst üste binen koloniler, ışık deseninin iki boyutlu doğası nedeniyle ekstraksiyon sırasında çapraz kontaminasyona neden olabilir. Örneğin, bir üst koloni hedeflenebilirken, alttaki bir koloni de onunla çıkarılır (Şekil 5C). Bu nedenle, hidrojel hazırlama için 12,7 μm aralayıcı kullanılması önerilir.

Şekil 5: Hidrojel kalınlığı ekstraksiyon saflığını etkiler. (A) Hidrojel oluşumu için 12,7 μm kalınlığında aralayıcılar kullanılarak, bir 10x odak düzlemi içinde koloniler oluşur. (B) 12,7 μm'den daha büyük kalınlıklara sahip aralayıcılar kullanılırsa kolonilerin yer paylaşımı 10 kat büyütmede gözlemlenebilir. (C) Hücre salınımı sırasında kolonilerin yer paylaşımı ile çapraz kontaminasyon meydana gelebilir: (i) hedeflenen bir hücre kolonisini serbest bırakmak için bir halka deseni kullanılır, (ii) hedeflenen hücre kolonisi hidrojelden ayrılır ve (iii) hedeflenen koloninin altındaki ışığa maruz kalma sırasında ikinci bir altta yatan koloni görülür. Bu koloni de çıkarılır ve çapraz kontaminasyona neden edilir. Fattahi ve ark.¹⁹ Telif Hakkı 2020 Amerikan Kimya Derneği'nin izniyle yeniden basıldı (uyarlandı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

UV ışığı ile bakterilere potansiyel hasar göz önüne alındığında, çeşitli UV ışık mikropatternlerinin hücre canlılığı üzerindeki etkisi model, Gram-pozitif bakteri (B. subtilis) ve model, Gram-negatif bakteriler (E. coli) kullanılarak daha fazla çalışılmıştır. Her biri dökme hidrojeller içinde kapsüllendi ve hidrojel ile uyumluluklarını doğrulayarak standart protokollere göre mikro ölçekli kolonilere kültürlendi. Eşdeğer boyutlardaki hedeflenen mikrokolonlar (26 ± 1 μm çapı), daha sonra sabit bir ışık dozuna (168 mJ/ mm²⁾maruz kaldı, tüm mikrokolonları UV ışığına maruz bırakan daire desenleri veya hücrelere ışık maruziyetini en aza indirmek için sadece hidrojel kenarlarını bozan çapraz desenler şeklinde. Hücreler daha sonra kurtarıldı ve her koloniden kurtarılan CFU/mL'yi ölçmek için kaplandı. Hücre iyileşme düzeyinde anlamlı bir fark bulunmadı(Şekil 6A). Çıkarılan hücrelerin saflığını daha fazla araştırmak için DNA, E. coli örneklerinden çıkarıldı ve bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak analiz edildi. Her iki model için de DNA kalite seviyeleri, genomik dizileme için ideal aralıkta olan_1.8 ile 2.0 ( Şekil 6B ) arasında bir A260/ A²⁸⁰aralığına girer. Bu, açıklanan koşullar altında serbest bırakılmak için kullanılan UV desenlerinin, dökme hidrojellerden veya ekstraksiyondan sonra genomik DNA kalitesinden kurtarılan canlı hücrelerin miktarı üzerinde minimum etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Şekil 6: Farklı ışık maruziyet kalıplarının, dökme hidrojellerden salınan bakterilerin hücre canlılığı ve DNA kalitesi üzerindeki etkisi. (A) Çapraz desenler ve daire desenleri kullanılarak ekstraksiyondan sonra hem E. coli hem de B. subtilis için hücre kurtarma seviyeleri. Bu deney için, her koloniden salınan hücre sayısının eşdeğer olduğundan emin olmak için aynı çapa (26 μm ± 1 μm) sahip küresel kolonilerden ekstraksiyon yapıldı. Çıkarılan çözeltiler daha sonra her desenden elde edilen CFU/mL'yi hesaplamak için kaplandı. İstatistiksel analizde hem E. coli hem de B. subtilis için çapraz ve daire desenlerinden elde edilen CFU/mL'de anlamlı bir fark olmadığı tespit edildi (P değeri > her iki suş için 0.05, n= 6). (B) Çapraz ve daire desenleri kullanılarak izole E. coli hücreleri için DNA kalitesinin spektrofotometrik nicelemesi. Burada istatistiksel analizde kullanılan desenler için DNA kalitesinde anlamlı bir fark görünmedi (P değeri > 0.05, n = 6) (C) Çapraz ve daire desenlerine maruz kalan eşit çaplara sahip kolonilerin Brightfield görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Microwell dizileri, dökme hidrojellere kıyasla daha kontrollü tarama özellikleri sunan alternatif, çip üzerinde laboratuvar tarama arayüzü sağlar. Örneğin, microwell dizileri, inoculumdaki hücre sayısının kontrol edilebildiği ayrı kültür alanlarına bakterilerin tohumlanmasını sağlar. Mikrowelllerin derinlik ve çap gibi geometrik özellikleri de standart mikrofabrikasyon yöntemleri ile kontrol edilir. Bu faydalarla, mikrowelller mekansal hapsetme altında bakteri büyümesini incelemek için yararlı olmuştur²⁶ve en son mikro ölçekli^18'debir araya geldiğinde farklı bakteri türleri arasındaki simbiyotik ve antagonistik etkileşimlerin keşfi için . 16S amplicon dizilimi gibi genomik analizler için kuyulardan hücresel ekstraksiyon bu uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Aynı hidrojel malzeme kullanılarak, UV ışığı daire veya halka desenleri olarak ilgi çekici hücreler içeren bir kuyu üzerinde maruzkalınabilir. İkincisi, hücrelerin doğrudan ışınlanmasını önlemek için sadece mikrowell çevresinde hidrojel bozulmasını sağlar. Bunu göstermek için, mCherry'yi ifade eden A. tumefaciens hücreleri kuyulara tohumlandı, hidrojel daha sonra mikrowell dizisine bağlandı. Hücreler kültüre edildi ve daha sonra daire veya halka desenleriyle ışınlandı. Membran daha sonra floresan-5-maleimid boya ile boyandı. İki renkli floresan görüntüler, hem membran hem de kuyulardaki hücrelerin her iki ışınlama deseni için çıkarıldığını ortaya koydu¹⁷. Dökme hidrojel formatının aksine, buradaki hücre ekstraksiyonu sadece hücre kümeleri şeklinde gözlenmiştir¹⁸.

Şekil 7: Microwell dizilerinden hücre izolasyonu üzerinde ışık deseni etkisini gösteren temsili konfokal mikroskopi görüntüleri. (A) Tohumlama ve kültürden sonra bakteri (kırmızı) içeren 40 μm çapında mikrowelller. (B) Daire ve halka desenleri (mavi) kullanarak ışığa maruz kalma. (C) Azalan kırmızı floresan, hücrelerin ışınlanmış kuyulardan çıkarıldığını gösterir. (D) Işınlamadan sonra membranların ve bakterilerin iki renkli floresan görüntüsü, hem hidrojel (yeşil) hem de bakterilerin (kırmızı) hedef kuyulardan çıkarıldığını gösterir. (E) Z-yığını, hedef kuyuların iki renkli floresan görüntüsü. (D) rengindeki kırmızı çizgi (E) içinde görüntülenmiş xz düzlemini, (E) içinde yeşil çizgi ise (D) içinde görüntülenmiş xy düzlemini gösterir. Görüntülerdeki örnekler (C-E) serbest bırakılan hücrelerin çıkarılması için yıkandı, daha sonra düzeltildi ve görüntülendi. Ölçek çubuğu = 40 μm. Van der Vlies ve ark.^17'denizin alınarak yeniden basıldı (uyarlandı). Telif Hakkı 2019 Amerikan Kimyasal Soceity. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu formatta ekstraksiyondan sonra bakteri hücresi canlılığını ve DNA kalitesini ölçmek için, B. subtilis ve E. coli hücreleri tohumlandı, kültürlendi ve daha sonra daire ve halka desenleri kullanılarak mikrowell dizilerinden serbest bırakıldı (Şekil 8A, B). Serbest bırakılan hücreler daha sonra ATGN agar plakaları üzerine kaplandı ve çıkarılan hücrelerin DNA kalitesi ölçüldü. Her ekstraksiyon sırasında tutarlı sayıda hücrenin bulunduğundan emin olmak için, benzer floresan yoğunluklarına (~6000 A.U.) sahip mikrowelller ve bu nedenle benzer sayıda hücre salınım için hedeflenmiştir. Daire deseni kullanılarak çıkarılan canlı hücrelerin sayısı, her iki bakteri için halka deseni kullanılarak çıkarılan canlı hücrelerin sayısından önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 8C). Ayrıca, DNA kalite seviyeleri her iki bakteri için daire ve halka desenleri arasında önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 8D). Bu nedenle, dökme hidrojellerdeki bulgulara benzer şekilde, UV ışığının burada belirtilen yoğunlukta ve sürede uygulanması, mikrowell dizilerinden çıkarılan hücrelerin canlılığı ve DNA kalitesi üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahipti. Bu bulgular, canlı bakteri hücrelerinin aşağı akış analizi için mikrowelllerden en az hasarla seçici olarak alınabileceğini göstermektedir.

Şekil 8: Farklı ışık maruziyet kalıplarının mikrowell dizilerinden salınan bakterilerin hücre canlılığı ve DNA kalitesi üzerindeki etkisi. (A,B) Hem E. coli hem de B. subtilisiçin, 10 μm mikrowells hücre ekstraksiyonu için daire desenleri ve halka desenleri kullanılmıştır. Hücre ekstraksiyonu için yapılan bu deneyde 10 μm çapında daire deseni ve iç çapı 10 μm, dış çapı 20 μm olan halka deseni kullanılmıştır. Her mikrowell'den salınan hücre sayısının aynı olmasını sağlamak için aynı çaplara sahip mikrowelller kullanıldı. (C) Çıkarılan çözeltiler daha sonra her pozlama deseninden elde edilen CFU/mL'yi hesaplamak için kaplanmıştır. İstatistiksel analizde hem E. coli hem de B. subtilis için daire ve halka deseninden elde edilen CFU/mL'de anlamlı bir fark olmadığı tespit edildi (P değeri > her iki suş için 0.05, n = 6). (D) Spektrofotometri, daire ve halka desenleri kullanılarak hem E. coli hem de B. subtilis hücrelerinin DNA kalitesini ölçmek için kullanılmıştır. Burada istatistiksel analizde kullanılan desenler için DNA kalitesinde anlamlı bir fark olmadığı (P değeri > 0.05, n = her iki suş için 6). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 1: Mikrowell dizilerinin tasarımı ve imalatı. (A) Silikon gofretler üzerinde mikrowell dizileri imal etmek için standart mikrofabrikasyon teknikleri uygulanmıştır. (B) Her substrat, 20 μm derinlik ve 30 μm pitch ile 7 x 7 dizi 10μm çapında kuyulardan oluşuyordu. (C) Her dizi 225 mikrowell'den oluşuyordu. Bu rakam Barua ve ark.¹⁸'den değiştirilmiştir. Telif Hakkı 2021 Frontiers Media. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu makale, bakteri taraması ve izolasyonu için fotobozunur hidrojellerin kullanımını göstermektedir. Malzeme ve yaklaşım, yüksek verimli kültür, büyüme ortamı ve büyüme koşulları üzerinde kontrol ve basit ve uygun maliyetli bir şekilde temiz ve hassas hücre ekstraksiyonu sağlar. Ekstraksiyon sadece desenli aydınlatma aracı ile birleştirilmiş floresan bir mikroskop gerektirir ve birden fazla hücre hedefini izole etmek için sıralı bir şekilde yapılabilir. Her ekstraksiyon 5-10 dakika sürer ve tek bir hidrojelden 30'a kadar hedeflenen koloni çıkarılmıştır. Yaklaşımın önemli bir avantajı, hem dökme hidrojellerden hem de microwell dizilerinden tarama ile burada gösterildiği gibi, çeşitli farklı test formatlarına uyarlanabilirliğidir. Her iki formattaki ayırma işlemi, hücre genotipini fenotipe bağlamak için kritik bir yetenek olan kültür ve mikroskobik gözlemden sonra aşağı akış genotipleme için benzersiz büyüme davranışı gösteren bakterileri izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bugüne kadar, bu arayüzlerden çıkarılan bakterilerin genomik karakterizasyonları, acil büyüme davranışı üreten çevresel mikrobiyomlardan çok türlü bakteri koleksiyonlarını tanımlamak için^16Samplicon dizilimini ve mutant kütüphanelerinde bulunan hücrelerde nadir büyüme profillerine neden olan genetik mutasyonları başarıyla tanımlamak için tam genom dizilimini içermektedir¹⁹.

Hücre taraması ve izolasyonu için dökme hidrojel kullanmak en basit ve basit formattır. Dökme fotobozunur hidrojeller, standart bir dik veya ters floresan mikroskobu ile görüntülenen 3-B hücre kültürü matrisinde hücreleri kapsüllemek için öncülleri şeffaf cam kapaklar üzerinde karıştırdıktan sonra hızla (25 dk) oluşur. Bu nedenle, yöntem mikrofabrikasyon kaynakları veya uzmanlığı olmayan yaygın mikrobiyoloji laboratuvarlarına çeviri potansiyeline sahiptir. Bu biçimin bir dezavantajı, hücrelerin üç boyutlu hidrojel boyunca rastgele yönlendirilmiş olmasıdır. Bu nedenle, hücreler daha yüksek büyütme hedefleri ile görüntüleme yaparken odak düzleminin dışında görünebilir ve hücre kolonileri birbirine çok yakın yönlendirilirse veya kolonilerin dikey bir kaplaması varsa ekstraksiyon zor olabilir. Açıklandığı gibi ince bir hidrojel (<13 μm) biriktirmek, bu dezavantajı azaltmak için kritik öneme sahiptir. Kırık çapraz ışık desenlerinde pozlama (Şekil 4B) burada tercih edilir, çünkü bu desen UV ışığına minimum maruziyete sahip hidrojel içermeyen hücrelerle sonuçlanır ve kaplama yoluyla kolayca kurtarılabilir.

Buna karşılık, bakteri hücreleri küçük kültür veya ortak kültür siteleri^{17 , 18,26}olarak hizmet veren ayrı mikrowelllere bölündürken, microwell dizi formatı daha iyi kontrol edilen bir arayüz sağlar. Microwell boyut, perde ve yoğunluk standart fotolitografik teknikler kullanılarak tam olarak üretilmiştir. Dökme hidrojellerle karşılaştırıldığında, hücreler hidrojel boyunca rastgele dağılmadığı için, hücreler sadece önceden tanımlanmış yerlerde bulunduğundan, bakteriler daha yüksek özgüllük derecesine ve çapraz kontaminasyon şansına sahip mikrowell dizilerinden çıkarılabilir. Tohumlama çözeltisindeki bakteri hücrelerinin konsantrasyonu ve oranları, önceki raporlarda karakterize edilen bir tohumlama işlemi ile mikrowell inoculum miktarını ve bileşimini kontrol etmek için de değiştirilebilir²⁶, kullanıcıya ekranın deneysel tasarımında esneklik sağlar. Microwell dizisi formatı ile taramanın birincil dezavantajı, mikrofabrikasyon için gereken ek zaman ve uzmanlıktır. Mikrowelllerin imalatının, malzeme maliyetleri ve temiz oda giderlerini içeren dizi başına ~ 10 $ 'a mal olduğu tahmin edildi. Ek olarak, mikrowells dizileri geleneksel olarak silikondan yapılır, bu da substratlar şeffaf olmadığından görüntüleme zorluklarına neden olabilir. Ayrıca, silikon yüzeyden yüksek miktarda ışık saçılım mikrowells içinde görüntüleme sınırlayabilir ve desenli aydınlatma aracından UV ışığı ile hidrojel maruziyeti sırasında desen çözünürlüğünü azaltabilir (Şekil 8A,B'degörülür). Bu tür sınırlamaları gidermek için şeffaf kuvars substratlarında benzer mikrowelller üretilmiştir^27; ancak, bu imalat önemli ölçüde daha zordur. Kuyunun çevresini aydınlatan halka desenlerine maruz kalmak, UV maruziyetini en aza indirirken kuyulardan serbest hücreler salmak için tercih edilir.

Her iki formatta da ortaya çıkan en yaygın sorun, hidrojel şişmesi nedeniyle kültür sırasında hidrojelin alttaki substrattan çıkarılmasıdır. Bu dökme hidrojeller için bir sorunsa, kimyasal (MTPS) bağlantı tabakasındaki tiyol gruplarının taban cam kapak kapağının yüzeyindeki varlığı, yoğunluğu ve homojenliği uygun bir yüzey karakterizasyon tekniği (XPS, ATR-FTIR, AFM vb.) kullanılarak doğrulanmalıdır. Verimsiz yüzey fonksiyonelleşmesi nedeniyle yüzey tiyool gruplarının düşük yoğunlukları, substrat ve hidrojel arasında zayıf bir etkileşime yol açabilir. Düşük düzeyde yüzey tiyolasyonu meydana gelirse, MTPS çözeltisinin stabilitesi kontrol edilmelidir. MTPS tedavisinden önce temiz bir yüzey sağlamak için cam kaydırağın ilk temizliğinde dikkatli olunmalı ve MTPS yüzey reaksiyonunda susuz toluen kullanımından emin olunmalıdır (Protokol Bölüm 4). Mikrowell dizileri söz konusu olduğunda, yüzeyler tiyolated değildir ve hidrojeller bunun yerine, hidrojelleri silikon substrata bağlayan hidrojel ile kuyuların kısmi doldurulması yoluyla bağlanır¹⁷. Hidrojel müfrezesi bu sistemde bir sorunsa, daha güçlü bağlanmayı teşvik etmek için hidrojel'i substrata daha fazla tutturmak için diziye daha fazla mikrowell veya diğer mikro ölçekli özellikler kazınabilir.

Tekniğin her iki formatta da bir sınırlaması, hidrojellerin bakteri varlığında sınırlı stabilitesidir. A. tumefaciensgibi bazı bakterilerin, deney süresini sınırlayan 5-7 gün^17,19boyunca hidrojelleri bozabileceği belirtilmiştir. Bakteriyel bozulma mekanizmalarının mevcut soruşturması devam etmektedir; diakrilat monomerlerden mevcut olan ester gruplarının, diğer sistemlerde belirtildiği gibi bakteri aracılı hidroliz ve/veya enzimatik bozulmaya maruz kaldığı varsayılır¹⁷. Daha kararlı hidrojel kimyaları geliştirmek, bakterilerin hidrojelde kalabileceği süreyi uzatacak ve ekranı daha yavaş büyüme oranlarına sahip mikroorganizmalara genişletecektir. İkinci bir sınırlama, her iki formatta da, hücre kurtarma ve ekstraksiyonu açık bir ortamda meydana gelir ve bu da dış kontaminasyona duyarlı olabilen nispeten yüksek ekstraksiyon hacimlerine (30-100 μL) neden olur. Bu nedenle, ekstraksiyon çözeltisi hacmini en aza indirirken hedef kolonilerden yeterli hücrenin bulunduğundan emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Kaplama ve geri kazanım veya DNA materyalinin çıkarılması için yeterli hücre elde etmek için, dökme hidrojellerde hücrelerin en az 10 μm koloni çaplarına ulaşacak kadar uzun süre kültürlenmesi gerektiği gözlenmiştir. Hücre ekstraksiyonu için gerekli hacmi azaltmak için, bir mikroliter şırınga ve boru kullanmanın (Şekil 2) pipetlemeden daha verimli olduğu gözlenmiştir. Boru, izolelerin serbest bırakma noktasından daha doğru bir şekilde çekilmesini sağladı, daha az çözelti hacmi gerektirdi ve kirlenme olasılığını azalttı.

Gelecekteki çalışmalar, hidrojel mekanik özelliklerinin hücre büyümesi üzerindeki etkisinin anlaşılmasını içerir, çünkü bu hidrojellerin mekanik özellikleri çeşitli moleküler ağırlıkların uygun PEG tabanlı monomer öncüllerinin seçimi ile iyi kontrol edilir²⁸ve mekanik etkileşimler muhtemelen bakteri davranışında önemli bir rol oynar²⁹. Hidrojel malzemeler çeşitli farklı sistem ve cihazlara kolayca dahil edilebildiğinden, bu malzemenin mikroakışkan sistemlere entegrasyonuna da odaklanmaktadır. Bu, şu anda açık koleksiyon formatında gerekli olan geleneksel 30-100 μL hacimlere kıyasla, femtoliter'den picoliter hacimlerine ekstraksiyon çözümünü azaltacaktır. Daha küçük çözelti hacimleri potansiyel kontaminasyonu büyük ölçüde azaltır ve yaklaşımı tek hücreli izolasyon ve karakterizasyona doğru taşır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Merkaptopropil) trietoksisilan	Sigma-Aldrich	175617-25G	> %95
Alconox deterjan tozu	Alconox	1104
Amonyum sülfat	Fisher Chemical	A702-500	Sertifikalı ACS Granül
Otoklav SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetik Stok Merkezi	1A1135
Brightfield dik mikroskop	Olympus Corporation	BX51
Kalsiyum klorür, susuz	Fisher Chemical	C614-500	Kurutucular Peletler için, 4-20 Mesh
Santrifüj 5702	Eppendorf	5702
Sitrik asit monohidrat	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS reaktifi, > %99,0
D-Glikoz ( Dekstroz)	VWR Amresco Yaşam Bilimleri	0188-1KG
Dneasy Kan ve Doku Kiti	Qiagen	69504	DNA saflaştırma kiti
DOWSIL 184 silikon elastomer taban	Dow Silicones Corporation		Depolama sıcaklığı: -30-60 °C C
DOWSIL 184 silikon elastomer kürleme maddesi	Dow Silikonlar Şirketi		Depolama sıcaklığı: < 32 C
EPOCH2 mikroplaka spektrofotometresi	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Etanol, susuz	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand mikroskop kapak camı	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest premium mikroskop slaytları düz	Fisher Scientific	12-544-4
Hidrojen peroksit çözeltisi	Sigma-Aldrich	216763-500ML
İzopropanol	Sigma-Aldrich	190764'da
Magnezyum sülfat, 7-hidrat	Macron İnce Kimyasallar	6066-04	Avantor Performans Malzemeleri A.Ş.
Metanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS reaktifi, > %99,8
NanoDrop Bir spektrofotometre	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Azot, sıkıştırılmış	Matheson	UN1066
Oksijen plazma temizleyici	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaeritritol tetra (merkaptoetil) polioksietilen (4 kol-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Fosfat tamponlu salin (PBS), 10X	VWR Amresco Yaşam Bilimleri	K813-500ML	15 ve derece arasında saklayın; C– 30 derece ve derece; C
Polidimetil siloksan (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Premium mikroskop slaytları	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Sodyum klorür	Sigma Yaşam	Bilimleri S5886-500G	Hücre kültürü için uygun biyoreaktif
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > %98, peletler (susuz)
Sodyum fosfat monobazik dihidrat	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, moleküler biyoloji için, > %99,0 (T)
Paslanmaz çelik kalınlık ölçer	Hassas Marka Ürünler	77739
Sülfürik asit	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluen, susuz, %99,8	Sigma-Aldrich	244511-1L	Susuz, > %99,8
Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H perflorooktil) silan (TPS), %97	Sigma-Aldrich	448931-10G
Mikrobiyoloji için	triptik soya suyu	Sigma-Aldrich	22092-500G
Super Nuova Dijital Sıcak Plaka Karıştırıcı	Thermo Scientific	S131825
Ultrasonik sonikatör	Fischer Scientific	FS-110H