Yöntem makalesi

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

DOI:

10.3791/63052

⸱

15 Ekim 2021

 ,  ,  ,  , 
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, MHC sınıf I ve sınıf II peptit komplekslerinin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlayan fare ve insan hücre çizgilerinden arındırılması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, piyasada bulunan antikorları kullanarak numune hazırlamaya odaklanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünopeptidomik, aşı ve immünoterapilerin geliştirilmesini besleyen ve yönlendiren gelişmekte olan bir alandır. Daha spesifik olarak, kütle spektrometresi (MS) teknoloji platformları kullanılarak majör histocompatibility complex (MHC) sınıf I ve sınıf II molekülleri tarafından sunulan peptitlerin bileşimini araştırma bilimine atıfta bulunur. MS tabanlı immünopeptidomik iş akışındaki tüm adımlar arasında, numune hazırlama, terapötik alaka düzeyinin yüksek kaliteli verilerini yakalamak için kritik öneme sahiptir. Burada, MHC sınıfı I ve II ile ilişkili peptitleri immünaffinite saflaştırma ile kalite kontrol örneklerinden, fareden (EL4 ve A20) ve daha spesifik olarak insan (JY) hücre çizgilerinden izole etmek için adım adım talimatlar açıklanmaktadır. Çeşitli reaktifler ve spesifik antikorlar, MHC ile ilişkili peptitleri bu hücre hatlarından izole etmek için, antikorun boncuk bağlama verimliliğini ve MHC-peptit komplekslerinin boncuklardan salınım verimliliğini doğrulama adımları da dahil olmak üzere iyice tanımlanmıştır. Protokol, bir immünopeptidomik iş akışı oluşturmak ve standartlaştırmak ve yeni protokolleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, protokol, immünopeptidomikte numune hazırlama prosedürünün laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliğini teşvik ederek uzman olmayanlar için harika bir başlangıç noktasını temsil eder.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yılda, MHC ilişkili peptitlerin repertuarını araştırmaya olan ilgi akademik sektörü aşmış ve biyoteknoloji ve ilaç endüstrilerine ulaşmıştır. Gerçekten de, kanserde, etkilenebilir tümöre özgü neoantijenlerin keşfi, endüstriyel sektörde kişiselleştirilmiş onkolojiye yol açan klinik immünoterapiler geliştirmek için önemli bir araştırma odağını temsil etmektedir1,2,3. Temel olarak, MHC ilişkili peptitler tüm vücutta sunulur, hücre içi evresini yansıtır ve otoimmünite, transplantasyon, bulaşıcı hastalıklar, iltihaplanma, kanser ve alerjiler gibi çeşitli hastalık koşullarında önemlidir1,4. Bu nedenle, MHC ilişkili peptitler veya insanlarda insan lökosit antijen (HLA) ligandları, tıbbi açıdan büyük ilgi çekicidir ve toplu olarak immünopeptidome5 olarak adlandırılır.

MS, tümöre özgü neoantijenlerin keşfi de dahil olmak üzere immünopeptidome6,7'yi karakterize etmek için güçlü bir analitik yaklaşımdır8,9,10,11. İmmünopeptidomik deneyi yapmak için tipik bir iş akışı üç ana adım içerir: 1) MHC ilişkili peptitlerin izolasyonu için örnek hazırlık, 2) MS tarafından veri toplama ve 3) çeşitli hesaplamalı yazılım araçları kullanılarak veri analizi12. Bu görselleştirilmiş protokolde açıklanan yüksek kaliteli örneklerin üretilmesi, MS tabanlı immünopeptidomikteki herhangi bir projenin başarısı için kritik öneme sahiptir. Aşağıda açıklanan protokol, MHC sınıfı I ve II ile ilişkili peptitlerin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler üretmeye uygun köklü hücre hatlarından izole edilmesine odaklanmaktadır. Bu hücre satırlarından gelen temsili sonuçlar geçerli iletişim kuralında gösterilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sağlanan protokol, belirlenen protokollerden uyarlandı13,14,15,16,17,18,19,20. MHC sınıf I ve II peptitlerin immünaffinite saflaştırması (IP) için genel prosedür Şekil 1'de gösterilmiştir. Kullanılan hücre hatları ve antikorlar hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Boncukların antikorlarla birelenmesi (Gün 1): Sepharose CNBr ile aktive edilmiş boncuklara karşı antikorların birleştirilmeleri

NOT: Her yeni deneme için yeni çözümler hazırlayın. Reaktiflerin ve çözüm tariflerinin listesi için Malzeme Tablosu ve Tamamlayıcı Tablo 1'e bakın. Tüm adımlar oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir. Yeni bir antikor kullanırken, anahtar aliquots toplayarak (gösterge İsteğE BAĞLANDIRILDI) ve Coomassie mavi boyama SDS-PAGE (Şekil 2) gerçekleştirerek bağlama verimliliğini kontrol edin.

  1. Sepharose CNBr boncuklarının aktivasyonu
    1. Numune başına 80 mg sepharose CNBr ile aktive boncuk tartın ve bunları 15 mL konik bir tüpe aktarın.
    2. Kurutulmuş boncukların yeniden doğuşunu kolaylaştırmak için, önce 5 mL 1 mM HCl ekleyin ve pipet 5 kez yukarı ve aşağı. Ardından, konik tüpü 1 mM HCl'lik ek 8,5 mL ile doldurun.
    3. Bir rotator cihazı kullanarak RT'de 30 dakika boyunca 20 rpm'de (dakikada devir) döndürün. Rt'de 2 dakika boyunca 200 x g'da boncukları santrifüj edin ve aspirasyonla süpernatantı çıkarın.
    4. Boncuk peletine 500 μL kavrama tamponu ekleyin ve yeni bir 2,0 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 1.2.2 adımı için kenara alın.
  2. Antikorların CNBr ile aktive edilmiş boncuklara bağlantısı
    1. MHC sınıfı I veya II peptitlerin izolasyonu için seçilen antikoru, 2 mg antikor ekleyerek (üretici tarafından belirtilen konsantrasyona göre) yeni bir 2,0 mL mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. 2 mg/mL'lik son konsantrasyonu elde etmek için kavrama tampon çözeltisi ile hacmi 1 mL'ye tamamlayın.
    2. Rt'de 2 dakika boyunca 200 x g'da 1.1.4 adımdan boncukları santrifüj edin ve ardından aspirasyonla süpernatantı çıkarın.
    3. Antikor çözeltisini aktif boncukları içeren 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
    4. (İsteğE BAĞLI) 18 μL (INPUT) aliquot alın, 6 μL 4x SDS-PAGE tampon ekleyin ve hemen dondurun.
    5. Mikrosantrifüj tüpünü bir rotator cihaz kullanarak 120 dakika boyunca 20 rpm'de 1.2.3 adımından döndürün. Boncukları 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin ve ardından süpernatantı çıkarın.
    6. (İsteğE BAĞLI) 18 μL'lik bir aliquot alın üstnatant (ilişkisiz antikor), 6 μL 4x SDS-PAGE tamponu ekleyin ve hemen dondurun.
  3. Antikor eşleştirilmiş boncukların bloke edilmesi ve yıkanması
    1. 1.2.5 adımından antikor bağlantılı boncukları içeren mikrosantrifüj tüpüne 1 mL 0.2 M glisin ekleyin. Bir rotator cihazı kullanarak RT'de 60 dakika boyunca 20 rpm'de döndürün.
    2. Boncukları 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin, ardından süpernatantı çıkarın. 1 mL PBS (Fosfat tamponlu salin) ekleyin.
    3. Boncukları 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin, ardından süpernatantı çıkarın.
    4. (İsteğE BAĞLI) 18 μL'lik bir aliquot üsttant alın (ilişkisiz antikor, son yıkama), 6 μL 4x SDS-PAGE tamponu ekleyin ve hemen dondurun.
    5. 1.3.3 adımındaki boncuklara 1 mL PBS ekleyin.
    6. (İsteğE BAĞLI) 18 μL boncuk karışımından (antikor ile birleştirilmiş boncuklar) bir aliquot alın, 6 μL 4x SDS-PAGE tamponu ekleyin ve hemen dondurun.
    7. 2.5. adımda aynı gün kullanılana kadar 4 °C'de tutun.
      NOT: Boncuklar immünkapstürden bir gün önce hazırlanabilir, ancak daha uzun depolama test edilmiştir.

2. Hücre lizisi ve antikor eşleştirilmiş boncuklarla immünaptür (Gün 1)

NOT: MHC moleküllerinin seviyesi bir hücre tipinden diğerine değişir ve hücre başına MHC/HLA moleküllerinin nicelemesi önerilir21 (Şekil 4A). Her IP için en az 1 x 108 hücre öneririz. Bu hücre sayısı% 0.5 Chaps tamponu ile çözünür hale getirilir JY, EL4 ve A20 hücrelerinden 6-10 mg proteine karşılık gelir. IP'ler için hücre peletleri hazırlamak için hücreler hasat edilmeli, santrifüjlenmeli ve 5 mL PBS ile iki kez yıkanmalıdır. Daha sonra, hücre peletleri IP zamanına kadar 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde veya -80 ° C'de 15 mL konik tüpte saklanabilir. IP'lerin taze hasat edilmiş veya dondurulmuş hücre topakları üzerinde gerçekleştirilebileceğini unutmayın.

  1. MHC sınıf I veya II peptitleri izole etmek için, tüpün altını avuç içiyle ısıtarak 1 x 108 hücreli donmuş bir peleti çözün. Peletin içine 500 μL PBS ekleyin ve süspansiyon homojen olana kadar pipet yukarı ve aşağı ekleyin.
    NOT: Hücre tipine bağlı olarak, hücre pelet hacmi önemli ölçüde değişebilir. Hücre peletini çözmek için 500 μL PBS yeterli değilse, hücreler yukarı ve aşağı pipetleme sırasında kolayca dağılana kadar daha fazla PBS kullanın.
  2. PBS'de yeniden kullanılan peletin toplam hacmini ölçün ve yeni bir tüp 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse daha fazla tüpe bölün.
  3. Önceki adımda ölçülen PBS'de yeniden süzülen hücre pelet hacmine eşdeğer bir hücre liziz tamponu (PBS'de proteaz inhibitörleri içeren %1 chaps tamponu, 1 pelet/10 mL tampon) ekleyin. Lizis tamponunun son konsantrasyonu %0,5 Chaps'tır.
  4. Bir rotator cihazı kullanarak 4 °C'de 60 dakika boyunca 10 rpm'de döndürün. Hücre listini 4 °C'de 20 dakika boyunca 18.000 x g'da tam frenle santrifüj edin ve süpernatantı (MHC-peptit komplekslerini içeren) yeni bir 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Antikor bağlantılı boncukları adım 1.3.7'den 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile kurtarın ve süpernatantı çıkarın.
  6. 2.4 adımdaki hücre lisat süpernatantını antikor bağlantılı boncuklara aktarın ve bir rotator cihaz kullanarak 4 °C'de 14-18 saat (geceleme) boyunca rotasyon (10 rpm) ile kuluçkaya yatırın.

3. MHC peptitlerinin elüsyon (Gün 2)

NOT: Polipropilen sütun, boncukları sütuna tutarken MHC-peptit komplekslerinin elüsyonunu sağlar. %1 TFA (trifluoroasetik asit) ile asidik elüasyon öncesi ve sonrası boncuklara bağlı MHC-peptit komplekslerinin oranını değerlendirmek için, protokol sırasında kilit adımlarda atılan aliquots ile batı lekesi yapmak mümkündür (bkz. gösterge İsteğE BAĞLI). Şekil 3'te gösterilen Batı şişkinliği, %1 TFA ile asidik elüasyonu takiben MHC-peptit komplekslerinin zenginleştiğini ortaya koymaktadır. Bu kesirde sinyal olmaması, elution adımının başarılı olmadığını gösterir. İlişkisiz MHC-peptit komplekslerinin boncuklara oranının, 3.1.6 adımında açıklanan bir aliquot kullanılarak batı şişkinliği ile paralel olarak da değerlendirilebileceğini unutmayın.

  1. MHC-peptit komplekslerinin antikor eşleştirilmiş boncuklardan elüsyon
    1. Polipropilen kolonun alt kapağını çıkarın, sütunu polipropilen sütun rafına yerleştirin ve akışı toplamak için altına boş bir kap takın.
      NOT: Örnek başına bir sütun gereklidir.
    2. Polipropilen kolonu 10 mL tampon A ile durulayın ve yerçekimi ile boşalmasına izin verin. Sıvı elution akış hızı çok yavaşsa, polipropilen kolonun alt ucunu daha da kesin.
    3. Boncuk-lysate karışımını (~2 mL) adım 2.5'ten ölçün ve toplayın ve polipropilen sütununa aktarın.
    4. (İsteğE BAĞLI) Batı şişkinliği için 20 μL 'lik (veya toplam hacimden 1/100) bir aliquot alın ve hemen dondurun. Bu fraksiyon boncuklarla inkübe edilen toplam MHC-peptit komplekslerine karşılık gelir.
    5. Sıvı karışımın yerçekimi tarafından ayıklanmasına izin verin.
    6. (İsteğE BAĞLI) Batı şişkinliği için 20 μL (veya toplam hacmin 1/100'ü) bir aliquot toplayın ve ölçün ve hemen dondurun. Bu fraksiyon artık ilişkisiz MHC-peptit komplekslerini temsil eder.
    7. Boncuk-lisat karışımını mümkün olduğunca geri kazanmak için, tüpü 3.1.3 adımından 1 mL tampon A ile durulayın ve polipropilen sütununa aktarın.
    8. Polipropilen kolonda tutulan boncukları 10 mL tampon A ekleyerek yıkayın. Yıkama tamponu yerçekimi tarafından elute izin verin.
    9. Yıkama adımını 10 mL B tamponu, 10 mL tampon A ve ardından 10 mL tampon C ile tekrarlayın.
    10. Polipropilen kolonu raftan çıkarın ve yeni bir 2,0 mL mikrosantrifüj tüpünün üzerine yerleştirin. Kolonu ve tüpü elinizle birlikte tutun.
    11. Polipropilen kolonuna 300 μL%1 TFA ekleyin ve boncukları 5 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.
      NOT: Boncuklar polipropilen kolonda tutulacak ve MHC'ye bağlı peptitler 2,0 mL mikrosantrifüj tüpünde elüte edilecektir.
    12. Eluat'ı yeni bir 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 3.1.11 adımını tekrarlayın ve 2 elüatları bir araya toplayın (MHC-peptit komplekslerini içeren elüatlar toplam 600 μL'ye karşılık gelmelidir ve adım 3.2.4'te kullanılacaktır).
    13. (İsteğE BAĞLI) Batı şişkinliği için 6 μL 'lik (veya toplam hacmin 1/100'ü) bir aliquot toplayın ve hemen dondurun. Bu fraksiyon boncuklardan elde edilen MHC-peptit komplekslerine karşılık gelir.
  2. MHC peptitlerinin tuzdan arındırılması ve elüasyonu
    NOT: MHC peptit adımlarının tuzdan arındırılması ve elüasyonu, C18 sütununun 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne takılması ile yapılabilir. Daha iyi bir uyum için, üretici tarafından sağlanan tavlamaları C18 sütunu ile 2,0 mL mikrosantrifüj tüpü arasına takın. Bu protokolde, 5-200 μL (6-60 μg) hacim kapasitesine sahip bir C18 sütunu kullanılır. Tüm adımlar RT'de gerçekleştirilir.
    1. C18 sütununun üstüne 200 μL Metanol ekleyin, ardından 3 dakika boyunca 1546 x g'da santrifüj ekleyin. Akışa geç.
    2. C18 sütununun üstüne 200 μL%80 ACN (asetonitril)/%0,1 TFA ekleyin, ardından 3 dakika boyunca 1546 x g'da santrifüj ekleyin. Akışa geç.
    3. C18 sütununun üstüne 200 μL%0,1 TFA ekleyin, ardından 3 dakika boyunca 1546 x g'da santrifüj ekleyin. Akışa geç.
    4. MHC-peptit komplekslerinin 200 μL'sini C18 sütununun üstündeki 3.1.12 adımından yükleyin. 3 dakika boyunca 1546 x g'da santrifüj ve akışı atın.
    5. Tam birim yüklenene kadar 3.2.4 adımını iki kez yineleyin. MHC peptitlerinin C18 sütununda tutulduğunu unutmayın.
    6. C18 sütununa 200 μL%0,1 TFA ekleyin, ardından 3 dakika boyunca 1546 x g'da santrifüj ekleyin. Akışa geç.
    7. C18 sütununu yeni bir 2,0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. C18 sütunundan %28 ACN/%0,1 TFA'nın 150 μL'sini ekleyerek Elute MHC peptitleri.
    8. 3 dakika boyunca 1546 x g'da santrifüj.
    9. Akışı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Akıştan geçmemeye dikkat edin; izole edilmiş MHC sınıfı I veya II peptitleri içerir.
    10. Toplam 450 μL hacim için 3.2.7-3.2.9 adımlarını iki kez yineleyin.
    11. Numuneler LC-MSMS tarafından analiz edilene kadar 450 μL elüat (saflaştırılmış MHC sınıfı I veya II peptitler) -20 °C'de dondurun.
    12. LC-MS/MS analizinden önce, adım 3.2.11'den arındırılmış MHC sınıfı I veya II peptitler, 2 saat için 45 °C ön ayarlara sahip bir vakum konsantratörü kullanılarak buharlaştırılarak kurumaya, vakum seviyesi: 100 mTorr ve vakum rampası: 5.
      NOT: Dondurulmuş numunelerin buharlaşması oldukça verimlidir. Kurutulmuş peptitler analize kadar yeniden dondurulabilir.

4. MHC sınıfı I ve II peptitlerin LC-MS/MS ile tanımlanması

NOT: Yüksek performanslı Orbitrap ve yüksek çözünürlüklü dörtlü uçuş süresi kütle spektrometreleri6 kullanarak MHC sınıf I ve II immünopeptidome analiz edin6. Mevcut çeşitli tandem kütle spektrometresi aletlerinin farklı operasyonel standartlara göre çalıştığı dikkate alınarak, aşağıdaki bilgiler yalnızca bir gösterge olarak verilmiştir. Adımların kısa bir özeti aşağıda ele alınmıştır:

  1. Kurutulmuş örnekleri (adım 3.2.12'den itibaren) %4 formik asit (FA) 50 μL'de çözün.
  2. Her örnek için 16 μL'lik üç enjeksiyon yükleyin ve ev yapımı ters fazlı bir sütuna (150-μm i.d. 250 mm uzunluğa göre Jüpiter 3 μm C18 300 Å) %5-%30 ACN-%0,1 SK gradyan ve MS'e bağlı nano akışlı UHPLC'de 600 nL/dk akış hızına sahiptir.
  3. Her tam MS spektrumunu 120000 çözünürlükte, enjeksiyon süresi için otomatik modlu 4 x 105 AGC'de ve en fazla 3 sn için en bol çarpma yüklü öncü iyonlarda tandem-MS (MS-MS) kullanarak spektra elde edin.
    NOT: Tandem-MS deneyleri% 30 çarpışma enerjisi, 30.000 çözünürlük, 1.5 x 105 AGC ve 300 ms enjeksiyon süresi ile daha yüksek enerjili çarpışma dissosiyasyonu (HCD) kullanılarak gerçekleştirilir.
  4. Fare ve insan veritabanlarını (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)) kullanarak bir proteomik LC-MS/MS analiz yazılımı (örneğin PEAKS X) kullanarak üç enjeksiyon/örnekten veri dosyalarını işleyin.
  5. Enzim parametresi için 'Belirtilmemiş Enzim Sindirimi'ni ve öncül ve parça iyonlarındaki kütle toleransları için sırasıyla 10 ppm ve 0,01 Da'yı seçin.
    NOT: Değişken modifikasyonlar deamidasyon (NQ) ve oksidasyondur (M). Diğer tüm arama parametreleri varsayılan değerlerdir. Son peptit listeleri% 80 ALC kullanılarak ve proteomik LC-MS / MS analiz yazılımı kullanılarak % 1 yanlış keşif oranı (FDR) ile filtrelenir.

5. İmmünopeptidomik verilerin görselleştirilmesi

NOT: MS tarafından oluşturulan immünopeptidomik verilerin kalitesi, yakın zamanda açıklandığı gibi birden fazla şekilde değerlendirilebilir22,23. Verileri görselleştirmek ve genel kalitelerini, kompozisyonlarını ve MHC özgüllüklerini değerlendirmek için MhcVizPipe (MVP) yazılım aracı kullanılabilir.

  1. Caron Lab GitHub web sitesinde bulunan MVP yazılımını yüklemek ve çalıştırmak için tüm talimatları ve ilgili belgeleri izleyin24.
    NOT: MVP, numune kalitesi, bileşimi ve MHC özgüllüğünün hızlı ve konsolide bir görünümünü sağlar. MVP, köklü immünopeptidomik algoritmaların (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 ve GibbsCluster27) kullanımını paralelleştirir ve HTML (HyperText Markup Language) biçiminde organize ve anlaşılması kolay raporlar oluşturur. Raporlar tamamen taşınabilir ve modern bir web tarayıcısına sahip herhangi bir bilgisayarda görüntülenebilir. HTML raporlarına örnekler için Ek Veriler 1-4'e bakın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MS tarafından immünipeptidomların analizi için MHC-peptit komplekslerini izole etmek için genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Antikorun boncuk bağlama verimliliğinin doğrulanması için temsili sonuçlar (Şekil 2) (Y3 anti-H2Kb antikor kullanılarak) ve MHC-peptit komplekslerinin boncuklardan salınım verimliliği (Şekil 3) (W6/32 anti-HLA-ABC antikor kullanılarak) gösterilmiştir. Şekil 4A'da gösterildiği gibi EL4 hücresi (H2Kb ve H2Db) ve JY hücresi (HLA-ABC) başına mutlak MHC sınıf I moleküllerinin mutlak sayısını ölçmek için akış sitometri tabanlı nicelik tahlilleri21 de uygulanmıştır.

Mevcut protokol kullanılarak sonuçların birey içi ve bireyler arası tekrarlanabilirliği Şekil 4B-E'de gösterilmiştir. 1 x 108 EL4 hücresi ve 1 x 108 JY hücreden tanımlanan MHC sınıfı I peptitler için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Sonuçlar iki farklı laboratuvar üyesinden (Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2) oluşturulmuştır. Kullanıcı 1 için, EL4 ve JY hücrelerinden tespit edilen MHCI'ya özgü peptitlerin ortalama sayısı sırasıyla 1341 ve 6361 idi; sırasıyla Kullanıcı 2, 1933 ve 7238 için (Şekil 4B,D). Üç farklı biyolojik çoğalır/deneyde tespit edilen peptit sayısı için ortalama değişim katsayısı (CV) %1,9- arasında değişmektedir (Şekil 4B,D). Üç farklı deneyde tespit edilen peptit sayısı için CV'ler nispeten küçük olmasına rağmen, peptitlerin kimliği önemli ölçüde değişmektedir (Şekil 4C,E). Gerçekten de, temsili Venn diyagramları, üç biyolojik yinelemede tekrarlanabilir olarak tespit edilen peptitlerin oranının% 39 (Kullanıcı 2, EL4 hücreleri) ile% 63 (Kullanıcı 1, JY hücreleri) arasında değiştiğini göstermektedir (Şekil 4C, E ve Tamamlayıcı Tablo 2).

MVP yazılımı tarafından oluşturulan ısı eşlemleri, NetMHCpan paket araçlarını kullanarak tanımlanan peptitlerin MHC bağlama gücünü tahmin etti25,26,28. 'Denetimsiz GibbsCluster' ve 'Allele-Specific GibbsCluster' olaraklandırılan iki GibbsCluster rutin seçeneği de MVP tarafından MHC peptit bağlayıcı motifleri çıkarmak için gerçekleştirilir. MVP'nin sınırlamaları olduğunu unutmayın; birincil amacı, alaşıma özgü motifleri çıkarmak ve peptitlere son derece doğru bir şekilde açıklama eklemek değil, örneklerin genel kalitesi, bileşimi ve MHC özgüllüğü hakkında kuşbakışı bir görünüm sağlamaktır.

EL4 hücrelerindeki fare MHC sınıfı I (H2Db ve H2Kb) peptitler için (Şekil 5A; üst paneller ve Tamamlayıcı Veriler 1), temsili bir ısı haritası, tespit edilen tüm 8-12 mer peptitlerin% 89'unun H2Db veya H2Kb molekülleri için Güçlü Bağlayıcılar (SB: NetMHCpan % Kademe <0.5) veya Zayıf Bağlayıcılar (WB: NetMHCpan % Rank <2) olacağının tahmin edildiğini göstermektedir. 8-12 mer peptitlerden oluşturulan dizi kümeleri, H2Db (P5'te kuşkonmaz ve P9'da Lösin) ve H2Kb (P5'te fenilalanin ve P8'de lösin) için bildirilen logolarla uyum içindedir (Şekil 5)29. M1 antikoru kullanılarak üçüncü bir baskın motifin (P7'de histidin ve P9'da lösin) yanı sıra ek 'artefactual' motiflerinin gözlemlenebileceğini belirtmek gerekir (Ek Veriler 1). Aslında, M1 antikorun klasik olmayan Qa2 molekülü ile çapraz reaksiyona geçtiği bilinmektedir ve bu nedenle Qa2 ilişkili peptitler ms tarafından da tespit edilir (Ek Veri 1). Burada, basitlik için Şekil 5, EL4 hücrelerinde ifade edilen iki klasik H2b alel (yani H2Db veya H2Kb) için köklü peptit bağlama motiflerini göstermeye odaklanmaktadır.

JY hücrelerindeki insan HLA sınıfı I (HLA-ABC) peptitler için (Şekil 5A; alt paneller ve Ek Veriler 2), temsili bir ısı haritası, tespit edilen tüm 8-12-mer peptitlerin% 97'sinin HLA-A * 0201, -B * 0702 veya -C * 0702 için SB veya WB olacağının tahmin edildiğini göstermektedir. Peptitler, HLA-A*0201 ve -B*0702 için peptit bağlama motiflerini görselleştirmek için kümelenmiştir. HLA-C*0702 için bağlama motifi Şekil 5A'da gösterilmez, çünkü C*0702 alelesi nispeten düşük bir ifade düzeyine sahiptir. Bu nedenle çok az C *0702 peptit izole edildi ve temsili bir C * 0702 motifi oluşturmak için tanımlandı. C*0702 motifinin diğer çalışmalarda30,31,32 veya NetMHCpan 4.1 Motif Görüntüleyici web sitesinden görselleştirilebileceğini unutmayın33.

JY hücrelerindeki insan HLA sınıfı II (HLA-DR) peptitler için (Şekil 5B; üst paneller ve Ek Veriler S3), temsili bir ısı haritası, tespit edilen tüm 9-22 mer peptitlerin% 70'inin HLA-DRB1 * 0404 ve -DRB1 * 1301 için SB veya WB olacağının tahmin edildiğini göstermektedir. Bu iki alel için peptit bağlama motifleri gösterilmiştir (Şekil 5B). Burada gösterilen peptit bağlayıcı motiflerin HLA-DRB1*0404 ve -DRB1*130134 için yakın zamanda bildirilen logolarla tam olarak uyuşmayabileceğini unutmayın. Bu tutarsızlık, MVP/NetMHCpan'ın JY hücrelerinde ifade edilen HLA-DRB1 *0404 ve -DRB1*1301 gibi daha az karakterize edilen HLA sınıf II alellerine peptitlere tam olarak açıklama açıklama getirememesini vurgulamaktadır. Sınıf II peptit bağlama motifleri hakkında ek bilgi diğer çalışmalarda bulunabilir34,35 ve NetMHCIIpan 4.0 Motif Görüntüleyici web sitesinden36.

Son olarak, A20 hücrelerindeki fare MHC sınıf II (H2-IAd ve H2-IEd) peptitleri için (Şekil 5B; alt paneller ve Ek Veriler 4), temsili bir ısı haritası, tespit edilen tüm 9-22 mer peptitlerin% 87'sinin H2-IAd veya H2-IEd için SB veya WB olacağının tahmin edildiğini göstermektedir. Bu iki alel için peptit bağlama motifleri bildirilen logolarla uyum içindedir37.

Örneklerin genel kalitesini ve MHC özgüllüğünü değerlendirmek için MVP yazılımı tarafından oluşturulan eksiksiz HTML raporları Ek Veriler 1-4'te mevcuttur.

MHC peptit izolasyonu iş akış şeması; LC-MS/MS analizi; immün yakalama; Veri görselleştirme.
Şekil 1: MHC sınıf I ve II peptitlerin izolasyonu için tam prosedürün şeması. (A-B)100 milyon hücre % 0.5 Chaps tamponu ile peletlenir ve lysed. (C) Hücre lisatı santrifüjlenir, ve süpernatant, önceden istenen antikora bağlı CNBr-sepharose boncuklara eklenir ve (D) 4 °C'de 14-18 saat inkübe edilir. (F) Peptitler tuzdan arındırilir ve bir C18 sütunu kullanılarak eluted. (G) Daha sonra, peptitler hız vac kurutulur ve tandem kütle spektrometresi ile analiz edilir. (H) İzole edilmiş MHC sınıfı I ve II peptitlerin kalitesi, serbestçe kullanılabilen MhcVizPipe yazılımı kullanılarak HLA alt tiplerine göre değerlendirilebilir. BioRender.com (NT22ZL8QSL) ile oluşturulan şekil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Elektroforez sonucu; Anti-H2Kb bağlama; ağır, hafif zincirli protein jeli; kDa işaretçileri görünür.
Şekil 2: Sepharose CNBr ile aktive boncuklara antikor bağlama verimliliğini izlemek için coomassie jel boyama. Eşdeğer hacimlerdeki aliquotlar% 12 SDS-PAGE jel üzerine yüklendi ve ardından Coomassie mavi boyama: boncuk + antikor ön kavrama (1), kavrama adımını takip eden ilişkisiz antikor (2), kavramadan sonra son yıkamayı takip eden süpernatant (3) ve boncuklar antikorla birleşti (4). Bağlamanın verimliliği, boncuklar CNBr boncuklarına bağlantıdan önceki antikora kıyasla (Şerit 4) koordine olarak bağlandığında H2Kb'nin hafif ve ağır zincirlerinin sinyal boyama yoğunluğunda önemli bir azalma ile gösterilmiştir (Şerit 1). Şekil yeniden basıldı ve bioRxiv38'den uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Anti-HLA-ABC kullanan HLA-ABC ağır zincir (33-44 kDa) gösteren western lekesi; MHC-peptit kompleksleri.
Şekil 3: Antikor bağlantılı CNBr ile aktive boncuklardan asidik elüsyon takiben MHC-peptit komplekslerini izlemek için batı şişkinliği. Protokolde belirtilen adımlardan atılan aliquotlar (toplam ölçülen hacmin 1/100'ü) SDS-PAGE jel üzerine yüklendi ve nitroselüloz membran üzerine aktarıldı: İmmün kapama ve son yıkamadan sonra boncuk + lisat (A); boncuklardan (C) elde edilen son yıkama (B) ve MHC-peptit komplekslerinin süpernatantı. Anti-HLA-ABC ağır zincir antikoru (Abcam, #ab 70328, 1:5000) kullanılarak (C) MHC-peptit komplekslerinin güçlü algılama sinyali, asidik elüasyondan sonra MHC-peptit komplekslerinin izolasyonu doğrulandı. 3.1.6 adımından akış toplayarak antikor bağlantılı boncuklar tarafından yakalanmayan MHC-peptit komplekslerinin oranını değerlendirmenin mümkün olduğunu unutmayın. Batı lekesine bir aliquot eklenebilir (bu jelde gösterilmez). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Fare ve insan hücresi analizinde peptit ligand miktarlarını gösteren çubuk grafikler ve Venn diyagramları.
Şekil 4: JY ve EL4 hücrelerinden MHC sınıfı I peptitlerin tanımlanması. (A) EL4 hücresi başına H2Db ve H2Kb moleküllerinin ve JY hücresi başına HLA-ABC moleküllerinin mutlak sayısını gösteren histogram. Niceleme akış sitometrisi ile gerçekleştirildi. Ortalamanın ortalama ve standart hatası üç biyolojik kopyadan elde edildi. (B, D) İki bağımsız kullanıcı tarafından tanımlanan MHC sınıf I peptitlerinin ortalama sayısını ve standart sapması gösteren histogram (USER_1 [U1] ve USER_2 [U2]). Fare EL4 hücrelerinden (B) ve insan JY hücrelerinden (D) tespit edilen MHC sınıf I peptitlerinin ortalama sayısı ve standart sapması gösterilmiştir. Üç bağımsız biyolojik kopyadaki değişim katsayıları (CV) endikedir. (C, E) Üç bağımsız biyolojik kopyada iki bağımsız kullanıcı (U1 ve U2) tarafından EL4 (C) ve JY hücrelerinde (E) tekrarlanabilir olarak tespit edilen peptitlerin sayısını gösteren venn diyagramları. Şekil 4A yeniden basıldı ve bioRxiv38'den uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

MHC sınıf I/II peptit bağlanma analizi, çubuk grafik ve dizi logoları, tür EL4/JY A20 karşılaştırması.
Şekil 5: MVP yazılım aracı kullanılarak immünopeptidomik verilerin görselleştirilmesi. Fare ve insan (A) MHC sınıf I ve (B) MHC sınıf II peptitlerin veri analizi. Temsili bağlama benzeşimli ısı eşlemleri (sol paneller) ve peptit bağlama motifleri (sağ paneller) gösterilmiştir. Isı eşlemleri renkleri, NetMHCpan 4.1 (%rank) tarafından tahmin edilen MHC bağlama benzeşimini temsil eder. Güçlü Bağlayıcılar kırmızıdır (%rank <0.5), Zayıf Bağlayıcılar mavi (%rank <2) ve Bağlayıcı Olmayanlar sarıdır (%Rank >2). SB veya WB olan 8-12mer peptitlerin (A) ve 9-22mer peptitlerin (B) oranı parantez içinde belirtilir. Peptit bağlama motifleri MVP tarafından 'Allele'a özgü Gibbscluster' seçeneği kullanılarak oluşturulmuştur. Bu temsili sonuçlar 1 x 108 hücreden ve aşağıdaki antikorlar ve hücre çizgileri kullanılarak elde edilmiştir: fare MHC sınıfı I peptitler için M1 antikor ve EL4 hücreleri; W6/32 antikor ve JY hücreleri insan MHC sınıf I peptitler için; Fare MHC sınıf II peptitler için M5 antikor ve A20 hücreleri; İnsan MHC sınıf II peptitler için L243 antikor ve JY hücreleri. MVP yazılımı tarafından oluşturulan tam HTML raporlarına erişmek için Ek Veriler 1-4'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Veriler 1-4: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Veriler 1: M1 antikoru kullanılarak 1 x 108EL4 hücreden izole edilen peptitlerden MVP yazılımı tarafından oluşturulan HTML raporu. Üç biyolojik kopya gösterilmiştir. Bu rapor Şekil 4 ve Şekil 5 ile ilgilidir ve ek tablo 2'de temsili peptitler listelenmiştir.

Ek Veriler 2: W6/32 antikoru kullanılarak 1 x 108JY hücrelerinden izole edilen peptitlerden MVP yazılımı tarafından oluşturulan HTML raporu. Üç biyolojik plaka gösterilmiştir. Bu rapor Şekil 4 ve Şekil 5 ile ilgilidir ve temsili peptitler Ek Tablo 2'de listelenmiştir.

Ek Veriler 3: L243 antikoru kullanılarak 1 x 108JY hücrelerinden izole edilen peptitlerden MVP yazılımı tarafından oluşturulan HTML raporu. Bu rapor Şekil 5 ile ilgilidir ve temsili peptitler Tamamlayıcı Tablo 2'de listelenmiştir.

Ek Veriler 4: M5 antikoru kullanılarak 1 x 108A20 hücreden izole edilen peptitlerden MVP yazılımı tarafından oluşturulan HTML raporu. Bu rapor Şekil 5 ile ilgilidir ve temsili peptitler Tamamlayıcı Tablo 2'de listelenmiştir.

Tamamlayıcı Tablo 1: Arabelleklerin listesi. Protokolde kullanılan tüm arabellekler için tarifler açıklanmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 2: H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR ve H2-IAd/IEd ile ilişkili peptitlerin temsili listeleri. Bu tablo, sırasıyla fare EL4 ve A20 hücre çizgilerinden izole edilmiş temsili MHC sınıfı I ve II peptitlerinin ve insan JY hücre hattından HLA sınıfı I ve II'nin listelerini içerir. Bu veriler ProteomeXchange'e (PXD028633) yatırılmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

VERI KULLANıLABILIRLIĞI:

Bu yazıda kullanılan veri kümeleri ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset) üzerine yatırılır: PXD028633.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki fare hücresi çizgisi (EL4 ve A20), bir insan hücre hattı (JY) ve piyasada bulunan beş antikor [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-IA)D/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) ve L243 (anti-HLA-DR)] bu protokol bağlamında test edilmiş ve doğrulanmış ve yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlanmıştır. Diğer anti-HLA antikorları mevcuttur (örneğin, anti-HLA-A2 BB7.2) ancak burada test edilmiştir. W6/32 antikorun yaygın olarak kullanıldığını ve sahada en köklü antikor olduğunu unutmayın; insanlarda tüm HLA-ABC molekülleri tarafından sunulan peptitlerin izolasyonunun sağlanmasını sağlar ve daha önce uzman laboratuvarlar tarafından taze veya dondurulmuş dokular8,39, periferik kan mononükleer hücreler ve kemik iliği mononükleer hücre40, biyopsiler41, ksnograftlar41,42, otopsiler43 ve plazma örnekleri44,45 gibi çeşitli biyolojik kaynaklardan çalışmak üzere raporlanmıştır.

Protokol boyunca kullanılan yeni çözümlerin hazırlanması kritik öneme sahiptir. Özellikle, cam şişelerde taze asidik çözeltilerin kullanılması, MS tarafından analiz edilen numunelerin daha sonra kirlenmesini önlemek için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, protokol ilk kez ve / veya yeni bir antikorla yapıldığında, antikorun gerçekten de mavi bir Coomassie jeli kullanılarak CNBr Sepharose boncuklarına bağlı olduğunu değerlendirmek önemlidir. MHC-peptit komplekslerinin immünkapsitini takiben antikor bağlantılı boncukların yıkama adımları da MHC dışı peptitlerin kirlenmesini önlemek için kritik öneme sahiptir. Son olarak, MHC-peptit komplekslerinin% 1 TFA ile elüsyonunu ve PEPTitlerin C18 sütunundan ACN28% / % 0.1 FA ile elüsyonunu takiben elüatları atmamak için özel bakım gereklidir.

Literatürde mevcut protokoller, izolasyon prosedürünün sonunda peptitleri daha da arındırmak için ek adımlar açıklar, örneğin peptit fraksiyonasyonu farklı yöntemlerle14,46 veya 10-30 kDa filtreleri kullanılarak ultrafiltrasyon13,47. Mevcut protokol bu ek adımlar hakkında ayrıntılı bilgi vermez ve yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlamak için yeterlidir. Ancak, bu tür adımlar, peptit izolasyon prosedürünü daha da optimize etmek için değiştirmek ve sorun gidermek için uzman olmayanlar tarafından düşünülebilir.

Boncukların türü ve MHC komplekslerini boncuklardan elute etmek için kullanılan asidik elüsyon tamponunun türü de sorun giderme için değiştirilebilir13,14,15,16,17,18,19. Bu bağlamda, sepharose CNBr ile aktive boncuklar, çeşitli antikor türleriyle bağlanma açısından esneklik göstermenin yanı sıra nispeten ucuz oldukları için genellikle iyi bir başlangıç noktasıdır. Mevcut protokolde, sepharose CNBr ile aktive edilmiş boncukların, piyasada bulunan beş farklı antikor (örneğin, M1, Y3, W6/32, L243 ve M5) kullanılarak nispeten iyi performans gösterdiği gösterilmiştir. Sepharose CNBr ile aktive boncukların yanı sıra, Protein A veya G veya A / G sepharose 4 Hızlı Akış boncuklarının kullanımı da kolaydır ve nispeten daha pahalı olmasına rağmen benzer sonuçlar üretebilir. Dikkate alınması gereken bir diğer faktör, A veya G proteini için antikorun benzeşimidir. Ayrıca, sepharose manyetik boncukların kullanımı da çok kolaydır, ancak nispeten pahalıdır. Uzman olmayanlar tarafından seçilen boncuk türünden bağımsız olarak, protokolün kritik adımlarında aliquots toplanması ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, antikorun boncuklara bağlanma verimliliğini izlemek için mavi Coomassie lekeli SDS-PAGE jellerinin gerçekleştirilmesi teşvik edilir.

MHC peptit izolasyonunun başarılılığını etkileyen bir diğer önemli faktör, MHC-peptit komplekslerini boncuklardan izole etmek için kullanılan asidik elüasyon tamponunun türünü ifade eder. %0,1, %1 veya %10 TFA, %0,2 FA ve %10 asetik asit olmak üzere farklı tamponlar bildirilmiştir. Test edilen tüm antikorlar için çalışan elüsyon tamponu %1 TFA idi. Bu adım, Şekil 3'te gösterildiği gibi MHC peptitlerini yakalamak için kullanılan MHC moleküllerine karşı batı şişkinliği ile de izlenebilir.

Asetonitril (ACN) ve/veya trifluoroasetik asit (TFA) içeren tüm tamponlar agresiftir ve plastikle temas halindeyse numunenin plastikleştiriciler gibi küçük moleküler ve polimerik maddelerle kirlenmesine yol açabilir. Bu tür sorunları önlemek için, organik çözücü ve/ veya TFA içeren tüm çözümler günlük taze olarak hazırlanır ve kullanıma kadar bir cam şişede saklanır. Adımların çoğu Protein LoBind plastik tüpte gerçekleştirilir. Bu tüpler özellikle proteomik için tasarlanmıştır ve biyositler, plastikleştiriciler ve lateks içermeyen en kaliteli, bakir polipropilenden yapılmıştır. Ayrıca kayma ajanları kullanılmadan optimize edilmiş, son derece cilalı kalıplarla üretilirler. Bu önlemler, yüksek kaliteli immünopeptidomik verilerin üretilmesini sağlamak için dikkate alınması önemlidir.

Antikor, MHC'ye bağlı peptitlerin izolasyonu için önemli bir sınırlamadır. W6/32 antikoru, insanlarda tüm HLA-ABC sınıf I molekülleri tarafından sunulan peptitlerin izolasyonu sağlar ve alanda en yaygın kullanılan ve kurulan antikordur. W6/32 antikorunun uygulanması üzerine karakteristik olmayan insan hücre hatlarının veya biyospektimenlerin yüksek çözünürlüklü HLA yazması bir gereklilik değildir, ancak yine de veri yorumlamayı kolaylaştırmak için belirli uygulamalar için önerilir48. HLA/MHC yazma bilgileri, birden fazla hücre çizgisi ve fare modelleri için kamu kaynaklarında da bulunabilir49. W6/32 antikorunun yanı sıra, bu protokol bağlamında test edilen ve doğrulanan diğer dört antikor (M1, M5, Y3 ve L243) ticari olarak mevcuttur. Öte yandan, daha önceki immünopeptidomik çalışmalarda bildirilen diğer birçok antikor büyük ölçüde topluluk tarafından benimsenmemiştir ve ticari olarak mevcut değildir veya nispeten pahalı olan melezoma hücre hatları kültürü aracılığıyla mevcuttur.

MHC'ye bağlı peptitlerin izolasyonu için bir diğer önemli sınırlama da gerekli başlangıç malzemesi miktarıdır. Gerekli miktar, akış sitometrisi ile ölçülebilen hücre yüzeyindeki MHC moleküllerinin ifade düzeyi ile ters orantılıdır (Şekil 4A). MHC moleküllerinin yüksek ekspresyon seviyelerini gösteren hücreler (örneğin, dendritik hücreler ve genel olarak hematopoetik hücreler) genellikle yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler verir. Uzman laboratuvarlar 50 milyon kadar düşük hücreden kullanır50, ancak uzman olmayanlar için 100 milyon ila 1 milyar hücre önerilir. Doku biyopsisi (<13 mg)41, ksinograft42,43, otopsi44 ve plazma kullanımı da rapor edildi, ancak uzman olmayan laboratuvarlar için zorlu olmaya devam ediyor. Ayrıca, beklenen MHC ilişkili peptitlerin toplam sayısı yerleşik hücre hatları için iyi belgelenmiştir (burada, hücre hattına ve kullanılan antikora bağlı olarak ~2000 ila ~10000 peptit arasında), ancak teknik tarafından verimli bir şekilde aşağı çekilen doğal olarak sunulan peptitlerin mutlak miktarları tartışılmaya devam etmektedir. Nitekim, önceki çalışmalar izolasyon prosedürünün verimliliğinin peptide bağımlı olduğunu ve% 0.5-% 2% 51 kadar düşük olabileceğini tahmin etti. İmmünopeptidomikteki diğer sınırlamalar, yöntemlerin tekrarlanabilirliği ve NetMHCpan süit araçlarının peptitleri daha az karakterize edilen MHC alellerine doğru şekilde açıklamalandıramamasıdır. Bu bağlamda, nispeten yeni veri bağımsız edinme MS yöntemlerinin daha da geliştirilmesi ve uygulanması7,32,52, ayrıca yeni peptit kümeleme ve MHC peptit bağlama tahmin algoritmaları31,34,53,54 immünopeptidomikte peptit ek açıklamalarının tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu artırması beklenmektedir. İmmünopeptidomik, MHC ilişkili peptitlerin MS alımı ve hesaplama analizi ile ilgili başka sınırlamalarla karşı karşıyadır ve başka bir yerde kapsanmaktadır1,6,55.

Wla-ABC ilişkili peptitlerin W6/32 antikoru kullanılarak insan örneklerinden izolasyonu birçok araştırma grubu tarafından iyi kurulmuş ve yaygın olarak uygulanmaktadır, fare MHC sınıfı I ve II ilişkili peptitlerin izolasyonu nispeten daha az belirlenmiştir. Bu nedenle, fare MHC ligandlarının izolasyonu için sağlam protokollere ihtiyaç vardır. Burada, sırasıyla C57BL/6 ve BALB/c kökenli iki fare hücresi hattından MHC sınıfı I peptitlerin ve MHC sınıf II peptitlerin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Özellikle, protokol, M1 antikoru kullanılarak sınıf I H2Kb ve H2Db ilişkili peptitlerin yanı sıra M5 antikoru kullanılarak sınıf II H2-IAd ve H2-IEd ilişkili peptitlerin izolasyon edilmesini sağlar. Bu nedenle, mevcut protokolün yayılması ve uygulanması, çeşitli fare modellerinde temel ve çevirisel immünopeptidomik araştırmaları kolaylaştırmalıdır.

Protokol, bir immünopeptidomik iş akışı oluşturmak ve standartlaştırmak ve yeni protokolleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, kan/plazmadan taze veya donmuş dokuya ve FFPE'ye (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) kadar çeşitli biyolojik matrislerde immünopeptidomik tarama yapmak için uyarlanabilir ve daha da optimize edilebilir. Ayrıca, protokol immünopeptidomikte numune hazırlama prosedürünün laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliğini teşvik edecektir ve bu nedenle temel ve klinik araştırmalarda geniş bir uygulama bulması bekmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (İmmünoloji ve Kanser Araştırma Enstitüsü, Université de Montréal) ve Anthony Purcell'e (Monash Üniversitesi) anlayışlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), Cole Vakfı, CHU Sainte-Justine ve Charles-Bruneau Vakıfları, Kanada İnovasyon Vakfı, Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) (#174924) tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A20 hücre hattıATCCTIB-208fare B lenfoblast
Asetonitril, LC / MS SınıfıFisherScientificA955-4
anti-İnsan HLA A, B, C (W6 / 32) - MHC sınıf IBioXcellBE0079
anti-İnsan/Maymun HLA-DR (L243) - MHC sınıf IIBioXcellBE0308
anti-Fare H2 (M1/42.3.9.8) - MHC sınıf IBioXcellBE0077
anti-Fare H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC sınıf IIBioXcellBE00108
anti-Fare H2Kb (Y3) - MHC sınıf IBioXcellBE0172
BupH Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Paketleri (PBS)ThermoFisher28372500 mL deiyonize su nihai hacminde çözülmüş poşet içeriği (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-kolamidopropil)dimetilamonyo]-1- propansülfonat)EMDMilipore220201-10MG
CNBr ile aktive edilen SefarozCytivia# 17-0430-01
EL4 hücre hattıATCCTIB-39fare T lenfoblast
epTIPS LoRetention İpuçları, 1000 & L/EppendorfFisherScientific02-717-352Düşük tutma malzemesi
epTIPS ile daha iyi sonuçlar LoRetention Tips, 200 & L/EppendorfFisherScientific02-717-351Düşük tutma malzemesi
Formik Asit, LC/MS SınıfıFisherScientificA117-50
GlisinFisherScientificRDCG0250500
Hidroklorik asit çözeltisiFisherScientific60-007-11
JY hücre hattıSigma Aldrich94022533-1VLEBV ile ölümsüzleştirilmiş B hücreli lenfoblastoid hattı
Metanol, LC/MS SınıfıFisherScientificA456-4
Poli hazırlık kromatografi kolonları (polipropilen kolonu)Bio-Rad731-1550protokolünde polipropilen kolon olarak anılır
Proteaz inhibitörüThermoFisherA3296310 mL hücre lizis tamponu başına 1 pelet
QifikitDakoK007811-8
Sodyum BikarbonatAmresco# 0865-1kg
Sodyum KlorürFisherScientificMSX04201
Katı faz ekstraksiyon diski, ultramicrospin kolon C18Yuva grubuSEMSS18V6 &ndash kapasiteli; 60 ve mikro; g, maksimum 200 ve mikro hacim; L
Trifloroasetik Asit (TFA), LC-MS SınıfıFisherScientificPI85183
TrisFisherScientificT395-500
Tris-HClFisherScientific#10812846001
Tüp LoBind 1.5 mL/EppendorfFisherScientificE925000090Düşük retansiyon malzemesi ile daha iyi sonuçlar
Tüp LoBind 2 mL/EppendorfFisherScientific13-698-795Düşük tutma malzemesi ile daha iyi sonuçlar
Su, LC / MS SınıfıFisherScientificW64
ile daha iyi sonuçlar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533(2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661(2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404(2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577(2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516(2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110(2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, Clifton, N.J. 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152(2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157(2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251(2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409(2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111(2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics - How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110(2021).
  24. Caron Lab. GitHub. , Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021).
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796(2007).
  29. Fortier, M. -H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080(2021).
  33. Nielson, M. NetMHNetMHCpan 4.1 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/logos_ps.php (2021).
  34. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  35. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  36. Nielson, M. NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/logos.php (2021).
  37. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  38. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  39. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  40. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  41. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  42. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558(2019).
  43. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071(2021).
  44. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  45. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  46. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  47. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  48. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  49. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893(2014).
  50. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133(2021).
  51. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  52. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  53. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  54. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  55. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464(2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MHC S n f IIPeptit zolasyonumm noafinite Safla t rmaFare H cre Hatlarnsan H cre HatlarPeptit El syonuLC MS MS

İlgili makaleler