Yöntem makalesi

Biyobozunur İmplant Materyallerini In Vitro Olarak İncelemek için Doğrudan ve Dolaylı Kültür Yöntemleri

4.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63065

⸱

15 Nisan 2022

 ,  ,  , 
1Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Stem Cell Center, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biyobozunur implant materyallerinin in vitro sitouyumluluğunu değerlendirmek için üç doğrudan kültür, doğrudan maruz kalma kültürü ve maruz kalma kültürü yöntemi sunuyoruz. Bu in vitro yöntemler farklı in vivo hücre-implant etkileşimlerini taklit eder ve çeşitli biyolojik olarak parçalanabilir materyalleri incelemek için uygulanabilir.

Özet

Son birkaç on yılda, biyobozunur materyaller ortopedik, dental ve kraniyomaksillofasiyal implantlar gibi biyomedikal uygulamalar için kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. Biyomedikal uygulamalar için biyobozunur materyalleri taramak için, bu materyalleri in vitro hücre yanıtları, sitouyumluluk ve sitotoksisite açısından değerlendirmek gerekir. Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO) standartları, biyomalzemelerin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, çoğu ISO standardı başlangıçta parçalanamayan malzemelerin sitotoksisitesini değerlendirmek için oluşturulmuştur, böylece biyolojik olarak parçalanabilir malzemelerin taranması için sınırlı bir değer sağlanmaktadır.

Bu makalede, biyolojik olarak parçalanabilen polimerler, seramikler, metaller ve bunların kompozitleri de dahil olmak üzere biyolojik olarak parçalanabilen implant materyallerinin farklı hücre tipleri ile in vitro sitouyumluluğunu değerlendirmek için doğrudan kültür yöntemi, doğrudan maruz kalma kültürü yöntemi ve maruz kalma kültürü yöntemi olmak üzere üç farklı kültür yöntemi tanıtılmakta ve tartışılmaktadır. Araştırmalar, kültür yöntemlerinin biyolojik olarak parçalanabilen materyallere hücre tepkilerini etkilediğini göstermiştir, çünkü dinamik bozunmaları, arayüzde ve yerel ortamda mekansal zamansal farklılıklara neden olur. Spesifik olarak, doğrudan kültür yöntemi, doğrudan implantlara tohumlanan hücrelerin tepkilerini ortaya çıkarır; doğrudan maruz kalma kültürü yöntemi, implantlarla temas eden yerleşik konakçı hücrelerin tepkilerini aydınlatır; maruziyet kültürü yöntemi, implantlarla doğrudan temas halinde olmayan, ancak implant yıkımına bağlı olarak yerel ortamdaki değişikliklerden etkilenen yerleşik konakçı hücreleri değerlendirir.

Bu makalede, biyolojik olarak parçalanabilen implant materyallerinin in vitro sitouyumluluğunu ve kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (BMSC'ler) ile etkileşimlerini incelemek için bu üç kültür yöntemine örnekler verilmektedir. Ayrıca, hasat etme, pasaj, kültür, tohum, düzeltme, lekeleme, hücrelerin nasıl karakterize edileceği ve kültür sonrası medya ve malzemelerin nasıl analiz edileceğini açıklar. Bu makalede açıklanan in vitro yöntemler, in vivo ortamın farklı senaryolarını taklit ederek, çeşitli biyomedikal uygulamalar için farklı biyomalzemelerin in vitro sitouyumluluk testlerinin uygulanabilirliğini ve alaka düzeyini genişletmektedir.

Giriş

On yıllardır biyobozunur materyaller ortopedik1,2, dental3,4 ve kraniyomaksillofasiyal5 uygulamaları gibi biyomedikal uygulamalarda kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve kullanılmıştır. Kalıcı implant ve malzemelerin aksine, biyolojik olarak parçalanabilen metaller, seramikler, polimerler ve bunların kompozitleri, fizyolojik ortamdaki farklı kimyasal reaksiyonlar yoluyla zamanla vücutta yavaş yavaş bozulur. Örneğin, magnezyum (Mg) alaşımları1,6,7 ve çinko (Zn) alaşımları8,9 gibi biyolojik olarak parçalanabilen metaller, kemik fiksasyon cihazları için umut verici malzemelerdir. Biyolojik olarak parçalanabilirlikleri, kemik iyileşmesinden sonra implantları çıkarmak için ikincil ameliyatların gerekliliğini ortadan kaldırabilir. Kalsiyum fosfat çimentoları (TBM'ler) gibi biyobozunur seramikler, perkütan kifoplastide osteoporotik vertebral kompresyon kırıklarının tedavisinde heyecan verici bir potansiyel göstermiştir10. TBM'ler kırık vertebral gövde için mekanik destek sağlar ve kırık iyileştikten sonra yavaş yavaş bozulur.

Bazı polisakkaritler ve polyesterler gibi biyolojik olarak parçalanabilen polimerler de biyomedikal uygulamalar için yaygın olarak araştırılmıştır. Örneğin, biyolojik olarak parçalanabilen bir polisakkarit olarak kitosan hidrojel, enfeksiyonu önleme ve cilt dokusunu yenileme yeteneklerini sergilemiştir11. Poli-L-laktik asit (PLLA), poli(glikolik asit) (PGA) ve poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA), doku mühendisliği uygulamaları için 2D veya 3D gözenekli iskelelerin imalatı için yaygın olarak çalışılan polyesterlerdir12,13,14. Ayrıca, kompozit malzemeler çok çeşitli biyomedikal uygulamalar için gelişmiş işlevler sağlamak üzere iki veya daha fazla metal, seramik ve polimer fazını bütünleştirir15,16,17. Örneğin, PLGA ve kalsiyum fosfat kompozitleri, kafatası kemik kusurlarının onarımı gibi uygulamalar için biyolojik olarak parçalanabilen iskeleler üretmek için kullanılabilir18. Bu biyolojik olarak parçalanabilen iskeleler ve implantlar, hücrelerin ve dokuların büyümesini destekleyebilir ve teşvik edebilir ve daha sonra zamanla vücutta yavaş yavaş bozulabilir.

Ek Tablo 1'de gösterildiği gibi, farklı biyolojik olarak parçalanabilen malzemeler çeşitli bozunma mekanizmalarına, ürünlerine ve oranlarına sahip olabilir. Örneğin, Mg-2 ağırlıkça% Zn-0.5 ağırlıkça% Ca (ZC21)1, Mg-4 ağırlıkça% Zn-1 ağırlıkça% Sr (ZSr41)19 ve Mg-9 ağırlıkça% Al-1 ağırlıkça% Çinko (AZ91)20 gibi magnezyum alaşımları, su ile reaksiyona girerek bozulur ve bozunma ürünleri esas olarak Mg2 + iyonlarını, OH- iyonlarını, H2 gazını ve mineral birikintilerini içerir. Biyolojik olarak parçalanabilen metaller için bozunma oranı, farklı bileşimlerine, geometrilerine ve bozunma ortamlarına bağlı olarak değişir. Örneğin, Cipriano ve ark.19, ZSr41 tellerinin (Ø1.1 × 15 mm) % 85 kütle kaybettiğini, aynı geometriye sahip saf Mg tellerinin ise 47 gün boyunca sıçan tibiae'sine implante edildikten sonra% 40 kütle kaybettiğini bildirmiştir. Hidroksiapatit (HA) ve β-trikalsiyum fosfat (β-TCP) gibi biyolojik olarak parçalanabilen seramik malzemeler, çözelti güdümlü hücre dışı sıvı çözünmesi yoluyla parçalanabilir veya küçük parçacıklara parçalanabilir ve daha sonra hem hücre dışı sıvı çözünmesi hem de hücre aracılı rezorpsiyon işlemleri yoluyla parçalanabilir. Bu kalsiyum fosfat bazlı seramiklerin bozunma ürünleri Ca2 + iyonlarını, (PO4) 3 iyonlarını, OH- iyonlarını ve mineral birikintilerini içerebilir21. Kalsiyum fosfat seramikleri için bozunma hızı, kristal yapılarından önemli ölçüde etkilenir. Örneğin, Van Blitterswijk ve ark.22, %40 hacimli mikrogözenekli HA'nın herhangi bir kütle kaybetmediğini, %40 hacimli mikrogözenekli β-TCP'nin ise 3 ay boyunca tavşanların tibialarına implante edildikten sonra %30 ± %4 kütle kaybettiğini bildirmiştir. PLGA14,23 gibi polimerler, su varlığında ester bağlantılarının hidrolizi nedeniyle bozulabilir ve bozunma ürünleri esas olarak laktik ve glikolik asitleri içerir. PLGA 50/50 için bir ay ve PLGA 95/5'in tam bozulmaya ulaşması birkaç ay sürebilir24.

Hücre yanıtı ve sitouyumluluk testi, biyomedikal uygulamalar için bu biyobozunur implant materyallerini değerlendirmek ve taramak için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, Uluslararası Standartlar Örgütü'nün (ISO) ISO 10993-5: 2009 "Tıbbi cihazların biyolojik değerlendirmesi-Bölüm 5 In vitro sitotoksisite testleri" gibi mevcut standartları, başlangıçta Ti alaşımları ve Cr-Co alaşımları gibi parçalanamayan biyomalzemelerin sitotoksisitesini değerlendirmek için tasarlanmıştır. in vitro25. Spesifik olarak, ISO 10993-5: 2009 sadece ekstraktın in vitro sitotoksisite testlerini, doğrudan teması ve dolaylı temas testlerini kapsar. Ekstrakt testinde, ekstrakt, numunelerin standart zaman ve sıcaklık koşullarından biri altında serum ve fizyolojik salin çözeltileri ile kültür ortamı gibi ekstraksiyon sıvılarına daldırılmasıyla hazırlanır. Toplanan ekstrakt veya seyreltme daha sonra sitotoksisiteyi incelemek için hücre kültürüne eklenir. Doğrudan temas testi için, numune ve hücreler arasındaki doğrudan temas, test numunesinin kurulan (yapışmış) hücre tabakasına yerleştirilmesiyle elde edilir. Dolaylı temas testinde, serum ve erimiş agar içeren kültür ortamı, kurulan hücreleri örtmek için pipetlenir. Numune daha sonra filtreli veya filtresiz katılaşmış agar tabakasına yerleştirilir.

ISO standartları, biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerin in vitro olarak değerlendirilmesi için uygulandığında bazı sınırlamalar göstermiştir. Parçalanamayan malzemelerin aksine, biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerin bozunma davranışları dinamiktir ve farklı bir zamanda veya çeşitli çevresel koşullarda (örneğin, sıcaklık, nem, ortam bileşimi ve hücre tipi) değişebilir. Ekstrakt testi sadece malzemenin bozunma ürünlerinin sitotoksisitesini değerlendirir ve numune bozunmasının dinamik sürecini yansıtmaz. ISO standardının hem doğrudan hem de dolaylı temas testleri, yalnızca yerleşik hücreler ve numuneler arasındaki etkileşimleri karakterize eder. Ayrıca, dolaylı temas testinde, malzemeler ve hücreler, in vivo ortamı yansıtmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir malzemelerin dinamik bozulmasını yakalamayan farklı mikro ortamlardadır.

Bu makalenin amacı, mevcut ISO standartlarında açıklanan yöntemlerin yukarıda belirtilen sınırlamalarını ele almak için çeşitli biyolojik olarak parçalanabilir implant materyalleri için sitouyumluluk test yöntemlerini tanıtmak ve tartışmaktır. Bu makalede sunulan yöntemler, implant materyallerinin dinamik bozunma davranışını ve hücre-materyal etkileşimlerinin farklı koşullarını in vivo olarak ele almaktadır. Spesifik olarak, bu makalede, biyolojik olarak parçalanabilen polimerler, seramikler, metaller ve tıbbi implant uygulamaları için kompozitleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak parçalanabilir malzemeler için doğrudan kültür, doğrudan maruz kalma kültürü ve maruz kalma kültürü olmak üzere üç sitouyumluluk test yöntemi sunulmaktadır.

Doğrudan kültür yönteminde, kültür ortamında asılı kalan hücreler doğrudan numuneler üzerine tohumlanır, böylece yeni tohumlanan hücreler ve implantlar arasındaki etkileşimler değerlendirilir. Doğrudan maruz kalma kültüründe, implantların vücuttaki yerleşik konakçı hücrelerle etkileşimlerini taklit etmek için örnekler doğrudan kurulan hücre tabakasına yerleştirilir. Maruz kalma kültüründe, örnekler kendi kuyu eklerine yerleştirilir ve daha sonra yerleşik hücrelerle kültür kuyularına tanıtılır; bu, yerleşik hücrelerin, implantlarla doğrudan temas etmedikleri zaman implant bozulmasının neden olduğu yerel ortamdaki değişikliklere tepkilerini karakterize eder. Doğrudan kültür ve doğrudan maruz kalma kültürü yöntemleri, aynı kültürdeki implant materyalleri ile doğrudan veya dolaylı olarak temas halinde olan hücreleri iyi değerlendirir. Maruz kalma kültürü, implant materyalleri ile dolaylı olarak temas halinde olan hücreleri, aynı kültürde öngörülen bir mesafe içinde iyi karakterize eder.

Bu makalede, farklı biyobozunur materyaller için sitouyumluluk testinin ve bunların model hücrelerle, yani kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle (BMSC'ler) etkileşimlerinin ayrıntılı bir açıklaması sunulmaktadır. Protokoller, hücrelerin toplanmasını, kültürlenmesini, tohumlanmasını, sabitlenmesini, boyanmasını ve görüntülenmesini, ayrıca çeşitli biyolojik olarak parçalanabilir implant materyalleri ve çok çeşitli hücre tipleri için geçerli olan postkültür materyallerinin ve ortamlarının analizlerini içerir. Bu yöntemler, in vitro hücre yanıtları ve sitouyumluluk açısından farklı biyomedikal uygulamalar için biyobozunur materyallerin taranmasında yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, hücre ve doku hasadı için Riverside'daki Kaliforniya Üniversitesi'ndeki (UCR) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Videoda örnek olarak 12 haftalık dişi bir Sprague-Dawley (SD) sıçanı gösteriliyor. Genç dişi ve erkek sıçanlar tercih edilir.

1. Hücre kültürü hazırlama

Not: Bu makalede açıklanan üç kültür yöntemi genellikle yapışkan farklı hücre türleri için geçerlidir. Burada, sıçan sütten kesilenlerden toplanan BMSC'ler, hücre kültürü hazırlığı için bir örnek olarak tanıtılacaktır. Belirli tıbbi uygulamalarla ilgilerine bağlı olarak, hayvanlardan veya insan donörlerinden toplanan birincil hücreler ve bir hücre / doku bankasından hücre hatları dahil olmak üzere farklı hücre tipleri kullanılabilir.

  1. BMSC'lerin sıçan sütten kesilmelerinden toplanması
    NOT: Şekil 1'deki şematik diyagram, sıçan sütten kesilen bitkilerden BMSC'leri toplama adımlarını göstermektedir.
    1. Sprague Dawley (SD) sıçanını CO2 inhalasyonu ile ötenazileştirin.
    2. Femuru ötenazi sıçandan çıkarmak için deri, kas ve bağ dokularını çıkarın. Femur kemiklerini hücre kültürü ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe (polipropilen) yerleştirin. Konik tüpleri, hücre ekstraksiyonu yapılana kadar buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Tibia ayrıca BMSC'leri hasat etmek için de kullanılabilir. Hücre kültürü ortamı, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamıdır (DMEM).
    3. Kemikleri biyolojik güvenlik kabinindeki bir Petri kabına aktarın. Cerrahi bir bıçak kullanarak kemiğin uçlarını kesin ve kemik iliğini 50 mL'lik bir konik tüpe (polipropilen) yıkayarak kemik iliği boşluğunu 251/2 G iğneli bir şırınga kullanarak hücre kültürü ortamıyla yıkayın.
      NOT: Kemik iliği ile ortama 18 G iğneli bir şırınga yerleştirin. Yavaşça ve nazikçe, görünür hücre / doku aglomeraları bulunmayana kadar büyük kemik iliği parçasını parçalamak için medyayı alın ve dağıtın.
    4. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin, ardından hücre peletlerini almak için 5 dakika boyunca 126 × g'da (1.000 rpm) santrifüjleme yapın.
    5. Süpernatant medyayı aspire edin ve 10 mL taze medya ile doldurun. 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın.
    6. Süspansiyonu doğrudan bir T-75 şişesinin iç dibine pipetleyin ve ses seviyesini 25 mL'ye çıkarmak için ortam ekleyin. Bir inkübatördeki hücreleri standart bir steril hücre kültürü ortamında (yani, 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 hava ile nemlendirilmiş atmosfer) kültürleyin.
    7. 3-7 gün sonra, eski ortamı aspire ederek ve taze ortamla doldurarak yapışkan olmayan hücreleri durulayın. Hücre geçişine, donmaya veya bir deneyde kullanıma hazır olana kadar hücreleri taze ortamla kültürlemeye ve beslemeye devam edin.
  2. Hücre bakımı
    1. Hücresel atık ürünleri uzaklaştırmak için hücre kültürü ortamını düzenli olarak değiştirin ve hücreler% 90 -% 100 birleşene kadar besinleri yaklaşık her gün yenileyin. % 90 akıcılıkta, geçiş, donma veya hücreleri bir deneyde kullanın.
    2. Pasör hücreler
      NOT: Alt kültürleme olarak da adlandırılan pasaj, hücreler bir kültürden diğerine aktarıldığında geçerli olan bir terimdir. Taze hasat edilmiş hücreler geçiş aşaması 0'dadır (P0). Bu makalede açıklanan tripsin-etilendiamintetraasetik asit çözeltisi (tripsin-EDTA) ve ortam miktarları bir T-75 şişesi içindir.
      1. Hücrelerin% 90 birleşik olduğunu doğrulamak için optik mikroskop altında hücreleri kontrol edin.
      2. Ortamı hücre şişesinden aspire edin.
      3. Serolojik pipet kullanarak şişeye 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) dağıtın. PBS ile hücreleri durulamak için şişeyi hafifçe sallayın; tüm PBS'yi aspire edin.
        NOT: Bu adım, geçiş sırasında ölü hücrelerin veya hücresel atıkların aktarılmamasını sağlamak için ekstra bir durulama görevi görür.
      4. 3 mL tripsin-EDTA'yı hücre şişesine doğrudan hücrelerin yüzeyine dağıtın. Hücrelerle birlikte tüm yüzeyin tripsin-EDTA tarafından kaplandığından emin olmak için şişeyi yavaşça sallayın.
      5. Hücrelerin ayrılmasına izin vermek için tripsin-EDTA ile hücre şişesini 5 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.
      6. İnkübatörde 5 dakika sonra, hücrelerin ayrıldığını doğrulamak için hücreleri optik mikroskop altında kontrol edin. Bazı hücreler ayrılmadıysa, hücre şişesinin yan tarafına hafifçe dokunun ve şişeyi tekrar kontrol edin.
      7. Tripsin-EDTA'yı seyreltmek için hücre şişesine 9 mL taze ortam ekleyin. Bu, tripsin-EDTA'nın hücreleri lize etmek yerine bağlanması için daha erişilebilir proteinler sağlar.
      8. Ortamdaki hücreleri pipetle ve tripsin-EDTA'dan çıkarın ve 15 mL'lik bir konik tüpe dağıtın. Hücreleri 5 dakika boyunca 126 × g'da (1.000 rpm) santrifüj yapın.
      9. Hücre peletini rahatsız etmeden, ortamı tripsin-EDTA ile aspire edin.
      10. Santrifüj tüpüne 5-10 mL taze ortam ekleyin ve 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak ortamdaki hücreleri nazikçe yeniden askıya alın.
      11. Santrifüj tüpünden orta derecede asılı hücreleri pipetleyin ve hacmi 2-3 taze kültür şişesine bölün. Her şişe için toplam orta hacmi 25 mL'ye getirmek için yeterli ortam ekleyin.
        NOT: Alt kültür sırasındaki bölünme oranı, hücre tiplerine ve spesifik büyüme özelliklerine bağlı olarak değişebilir.
      12. Hücreleri optik mikroskop altında kontrol edin ve inkübatöre geri yerleştirin.
    3. Dondurucu hücreler
      1. Hücrelerin% 90 birleşik olduğunu doğrulamak için optik mikroskop altında hücreleri kontrol edin.
      2. 1.2.2.2 ile 1.2.2.9 arasındaki adımları yineleyin.
      3. Santrifüj tüpüne 100-1000 μL mikropipet ile 900 μL taze ortam ekleyin. Aynı mikropipeti kullanarak ortamdaki hücreleri yavaşça ve nazikçe yeniden askıya alın.
      4. 900 μL hücre süspansiyonunu bir kriyovyal içine aktarın. 100 μL dimetilsülfoksit (DMSO) ekleyin.
      5. Mümkün olan en kısa sürede, kriyovyali sıcaklık düşüşünü düzenlemek için tasarlanmış silindirik bir köpük kaba yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Köpük kabı -80 °C dondurucuya yerleştirin.
    4. Çözme hücreleri
      1. Donmuş hücreleri su banyosunda çözün. 5 mL taze ortamla doldurulmuş steril bir 15 mL konik tüp alın, hücreleri konik tüpe yerleştirin ve 5 dakika boyunca 126 × g'da (1.000 rpm) santrifüj yapın.
      2. DMSO içeren ortamı aspire edin.
      3. 15 mL konik hücre tüpüne 5-10 mL taze ortam ekleyin. Hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça ve yavaşça yukarı ve aşağı pipet çekin.
      4. Pipet, 15 mL konik tüpün ortasında asılı hücreleri pipetleyin ve yeni bir T-75 şişesine dağıtın. Hücreleri dağıtırken, hücreleri hücre şişesinin dibinde mümkün olduğunca eşit bir şekilde dağıtmak için süpürme hareketi kullanın.
      5. Her T-75 şişesi için toplam orta hacmi 25 mL'ye getirmek için yeterli miktarda taze ortam ekleyin.
      6. Hücreleri optik mikroskop altında kontrol edin ve hücre şişesini tekrar inkübatöre yerleştirin.

2. Numune hazırlama ve sterilizasyon

  1. Numune hazırlama
    1. Bu makalede açıklanan hücre kültürü deneyleri için 6, 12, 24, 48 veya 96 kuyucuklu plakalar gibi doku kültürü ile işlenmiş plakalar kullanın. Numune boyutu gibi farklı deneysel tasarımlara dayanarak doku kültürü plakalarının tipini ve her kuyudaki ortam hacmini seçin.
  2. Hücre kültüründen önce biyolojik olarak parçalanabilen tüm numuneleri sterilize edin veya dezenfekte edin.
    NOT: Dezenfeksiyon şunlar için kabul edilebilir: in vitro numunelerin yüksek ısı, oksitleyici ve/veya radikaller içeren bazı sterilizasyon koşulları altında kimyasal ve/veya yüzey değişikliklerine eğilimli olduğu durumlarda yapılan çalışmalar. Farklı numune tipleri için sterilizasyon veya dezenfeksiyon yöntemleri, polimerler, metaller ve seramikler gibi malzemelerin farklı özelliklerine bağlı olarak değişir. Sterilizasyon veya dezenfeksiyon işlemi ısı, gaz, radyasyon, kimyasallar, yüksek basınç veya bunların bir kombinasyonunu içerebilir.
    1. Biyobozunur metaller
      1. Genel olarak, in vitro çalışmalar için biyolojik olarak parçalanabilen metalleri dezenfekte etmek için ultraviyole (UV) radyasyon kullanın.
        NOT: Örneğin, Zhang ve ark., saf magnezyum (Mg) ve ZC21 Mg alaşım numunelerinin, hücre çalışmalarında kullanılmadan önce UV radyasyonu altında 4 saat boyunca dezenfekte edildiğini bildirmiştir1. İn vivo çalışmalar için, numunelerin genellikle sterilize edilmesi gerekir. Magnezyum veya magnezyum alaşımları gibi biyolojik olarak parçalanabilen birçok metal için, buhar kullanarak otoklavlamadan kaçınılmalıdır, çünkü bu numuneler suda oksitlenebilir veya korozyona uğrayabilir6. UV dezenfeksiyonu için bir kuvars kabı önerilir, çünkü çoğu bardak ve plastikten daha iyi UV şeffaflığı sağlar.
      2. Mg alaşımlı numuneleri kuru ısı altında bir fırında veya otoklavda 100-200 °C sıcaklık aralığında sterilize edin.
        NOT: Bazı metalik alaşımlar havadaki yüksek sıcaklıklarda yüzeyde hala oksitlenebildiğinden, bazı durumlarda alternatif olarak yüksek yoğunluklu radyasyon kullanılabilir. Bununla birlikte, ince metalik folyoları sterilize ederken alfa veya gama radyasyonu gibi yüksek yoğunluklu radyasyondan kaçınılmalıdır. Malzemeler içinde atom yer değiştirmesine, malzemelerin mikroyapısını değiştirmesine neden olabilir.
      3. Isıya ve radyasyona duyarlı biyolojik olarak parçalanabilen metaller için alternatif bir yöntem olarak etilen oksit (EtO) gazı sterilizasyonu kullanın26.
    2. Biyobozunur seramikler
      1. Genel olarak, in vitro çalışmalardan önce UV radyasyonu veya% 70 etanol çözeltisi kullanarak biyolojik olarak parçalanabilen seramikleri dezenfekte edin.
        NOT: Örneğin, Liu ve ark., kalsiyum fosfat örneklerinin in vitro sitouyumluluk testlerinde kullanılmadan önce 1 saat boyunca %70 etanol içine daldırma ve her iki tarafta 12 saat boyunca UV ışığına maruz kalma yoluyla dezenfekte edildiğini bildirmiştir27.
      2. Yüksek sıcaklık ve su buharı kompostlarına ve mikro yapılarına zarar vermezse, biyolojik olarak parçalanabilen seramikleri sterilize etmek için otoklavlar kullanın.
        NOT: Bazı seramikler otoklavlamadan etkilenebilir. Örneğin, yttria stabilize zirkonya seramikleri 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlandığında faz değişimi ve yüzey pürüzlenmesi bulunmuştur. Ek olarak, TBM'ler buharla otoklavlama yoluyla sterilize edilemez, çünkü numuneler su ile reaksiyona girer.
      3. Yukarıda belirtilen ittriya stabilize zirkonya seramikleri ve CPC numuneleri için Kobalt-60 radyasyonu gibi alternatif sterilizasyon yöntemleri kullanın28.
    3. Biyobozunur polimerler
      1. Genel olarak, biyolojik olarak parçalanabilen polimerleri, in vitro hücre çalışmalarında kullanmadan önce UV radyasyonu veya% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin.
        NOT: Bazı polimerler UV radyasyonu altında kimyasal değişikliklere uğrayabilir. Sterilizasyon için, Kobalt-60 radyasyonu gibi gama ışını tedavisi kullanılabilir. Örneğin, nişasta tozları, in vitro hücre çalışmalarında kullanılmadan önce Kobalt-60 radyasyonu altında sterilize edilmiştir29.
      2. Yüksek sıcaklığa ve neme dayanabilen otoklav polimer malzemeler.
        NOT: Örneğin, polipropilen gibi polimerler, otoklavlama sıcaklıklarını (yani 121-134 ° C) tolere edebildikleri için otoklavlanabilir. Polikaprolakton (PCL) gibi bazı polimerler, nispeten düşük erime noktaları (yani, yaklaşık 60 ° C) nedeniyle otoklavlanamaz30.
      3. Isıya veya radyasyona duyarlı polimerik malzemeleri sterilize etmek için EtO gazı kullanın.

3. Hücre kültürü yöntemleri

  1. Doğrudan kültür yöntemleri
    NOT: Şekil 2A'daki şematik diyagram, doğrudan kültür yönteminin adımlarını gösterir. Bu makalede, BMSC'ler, kültür yöntemini göstermek için örnek olarak 12 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın kuyucuklarının içine yerleştirilmiş Mg türevi bir plaka üzerinde kültürlenmiştir.
    1. Hücre süspansiyonunu elde etmek için 1.2.2.1-1.2.2.10 adımlarında açıklanan adımları izleyin.
    2. Bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyonundaki hücre konsantrasyonunu belirlemek için% 90 akıcı bir şişe kullanın. Hücre süspansiyonunu, taze ortam kullanarak, in vitro hücre çalışması için gerekli olan öngörülen bir hücre konsantrasyonuna seyreltin.
      NOT: Hücrelerin tohumlama yoğunluğu deneysel tasarım ile belirlenir. Örneğin, biyolojik olarak parçalanabilen materyallerle farklı hücre çalışmalarında 2.000-40.000 hücre / cm2 hücre yoğunlukları kullanılmıştır.
    3. Numuneleri (Mg plaka) iyi işlenmiş 12 iyi işlenmiş doku kültürü plakasının ortasına yerleştirin. Sırasıyla, steril koşullar altında ozmotik basıncı kalibre etmek için kültür plakalarını 2 mL PBS ve 2 mL DMEM ile durulayın. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 3 mL'sini, ilgilenilen numunelerin üzerine her bir kuyucuğa ekleyin.
    4. Hücreleri bir inkübatörde 24 saat boyunca standart hücre kültürü koşulları altında kültürleyin.
      NOT: Kültür süresi, deneysel tasarıma bağlı olarak 24 saatten daha uzun veya daha kısa olabilir.
  2. Doğrudan maruz kalma kültürleri
    NOT: Şekil 2B'deki şematik diyagram, doğrudan maruz kalma kültürünün adımlarını göstermektedir.
    1. Adım 3.1.1 ve 3.1.2'de açıklandığı gibi, hücre süspansiyonunu, farklı hücre tipleri ve amaçlanan uygulamalar için deneysel tasarıma dayanan gerekli hücre konsantrasyonlarıyla hazırlayın.
    2. Ozmotik basıncı steril koşullar altında kalibre etmek için kültür plakalarını sırasıyla 2 mL PBS ve 2 mL DMEM ile durulayın. Her bir kuyucuğa seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 3 mL'sini ekleyin. Nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında 24 saat boyunca veya hücreler% 50-80 birleşime ulaşana kadar kültürleyin.
      NOT: Hücre birleşim düzeyi farklı hücre tiplerine ve deneysel tasarıma göre değişebilir.
    3. 24 saat sonra, yüzen ölü hücreleri çıkarmak için bir pipet kullanarak kuyu plakasındaki hücreleri PBS ile durulayın.
    4. Dezenfekte edilmiş veya sterilize edilmiş numuneleri doğrudan yapıştırılmış hücrelerin üzerine yerleştirin. Her bir kuyucuğa 3 mL taze ortam ekleyin.
    5. Hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında 24 saat daha kültürleyin.
      NOT: Kültür süresi, deneysel tasarıma bağlı olarak 24 saatten daha uzun veya daha kısa olabilir.
  3. Maruz kalma kültürleri
    NOT: Şekil 2C'deki şematik diyagram, maruz kalma kültürü yönteminin adımlarını gösterir.
    1. Hücre hazırlığı için ilk adımlar, maruz kalma kültürü ile aynıdır. Adım 3.1.1 ve 3.1.2'de açıklandığı gibi, hücre süspansiyonunu istenen hücrelerle hazırlayın. Adım 3.2.1 ve 3.2.2'ye benzer şekilde, kuyu plakasındaki hücreleri istenen yoğunlukta tohumlayın ve 24 saat boyunca standart hücre kültürü koşulları altında bir inkübatörde kültürleyin.
    2. 24 saat sonra, yüzen ölü hücreleri çıkarmak için yapışkan hücreleri PBS ile durulayın, ardından her bir oyuğa 3 mL taze ortam ekleyin.
    3. Daha sonra, numuneleri membran gözenek boyutu 0,4 μm olan kuyu eklerine yerleştirin ve numunelerle birlikte kuyu eklerini hücrelerle birlikte her bir kuyucuğa yerleştirin.
    4. Hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında 24 saat daha kültürleyin.
      NOT: Kültür süresi, deneysel tasarıma bağlı olarak 24 saatten daha uzun veya daha kısa olabilir.

4. Hücrelerin postkültür karakterizasyonu

NOT: Doğrudan kültür ve doğrudan maruz kalma kültürü için, hem kuyu plakalarına hem de numunelere yapışan hücreleri sabitleyin, lekeleyin, görüntüleyin ve analiz edin. Maruz kalma kültürü için, kuyu plakalarına yapışan hücreleri analiz edin.

  1. Hücre fiksasyonu
    1. Daha fazla analiz için postkültür ortamını her bir kuyucuktan karşılık gelen 15 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Daha fazla analiz için kültürden sonra tüm örnekleri toplayın.
    2. PBS kullanarak hem numunelere hem de kuyu plakalarına yapışan hücreleri 3 kez durulayın.
    3. Her bir kuyucuk plakasına 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA,% 10 nötr tamponlu formalin) ekleyin. Kapağı tekrar kuyu plakasına yerleştirin ve PFA'nın 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin.
    4. 20 dakika sonra, PFA'yı aspire edin ve bir atık şişesine dağıtın. PFA'yı çıkarmak için PBS kullanarak kuyu plakasını 3 kez durulayın ve atıkları atık şişesine aktarın.
  2. Hücre boyama
    1. Boyama maddelerinin çalışma stoklarını üreticilerin talimatlarını izleyerek hazırlayın.
      NOT: Örneğin, Alexa Fluor 488 Phalloidin, F-aktini boyamak için kullanılır ve hücre çekirdeklerini boyamak için 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanılır. Boyama solüsyonlarında numuneler hızla bozulursa boyama süresi kısalabilir.
    2. Kuyu plakasındaki hücreleri ve numuneyi örtmek için her bir kuyucuğa 200-400 μL seyreltilmiş Alexa Fluor 488 Phalloidin boyama maddesi ekleyin. Işığa maruz kalmayı önlemek için kuyu plakasını alüminyum folyoya sarın ve Alexa Fluor 488 Phalloidin'in oda sıcaklığında 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin.
    3. Alexa Fluor 488 Phalloidin boyama maddesini toplayın ve ilgili atık şişesine dağıtın. Fazla Alexa Fluor 488 Phalloidin'i çıkarmak için PBS kullanarak kuyu plakasını 3 kez durulayın ve kullanılmış PBS'yi ilgili atık şişesine dağıtın.
    4. Kuyudaki ve numunedeki hücreleri örtmek için her bir kuyucuğa 200-400 μL seyreltilmiş DAPI ekleyin. Kuyu plakasını alüminyum folyoya sarın ve DAPI'nin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin.
    5. DAPI'yi toplayın ve ilgili atık şişesine dağıtın. DAPI'yi çıkarmak için PBS kullanarak kuyu plakasını 3 kez durulayın ve kullanılmış PBS'yi ilgili atık şişesine dağıtın.
  3. Hücre görüntüleme
    1. Boyama işleminden sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak hücreleri görüntüleyin. Mümkün olduğunda, floresan görüntülere ek olarak hücrelerin faz kontrastlı görüntülerini alın. Biyolojik olarak parçalanabilen numunelerdeki hücreleri, numunelerin sürekli bozulmasından kaynaklanan olası değişiklikleri önlemek veya azaltmak için mümkün olan en kısa sürede veya boyamadan hemen sonra görüntüleyin. Hücreleri kuyu plakalarında fiksasyondan sonra 2-8 ° C'de bir tampon çözeltisinde saklayın ve floresan sinyallerinin kaybını önlemek için boyamadan sonra hücreleri mümkün olan en kısa sürede görüntüleyin.
    2. Doğrudan kültür ve doğrudan maruz kalma kültürü için, iki tip hücreyi görüntüleyin ve değerlendirin: (1) numuneler üzerindeki hücreler (numunelerle doğrudan temas halinde) ve (2) Şekil 3A'da gösterildiği gibi numuneleri çevreleyen kuyu plakasına yapışan hücreler (numunelerle dolaylı temas).
    3. Pozlama kültürü için, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, hücre yanıtının örneklerin dinamik bozunma gradyanına yanıt olarak farklı olup olmayacağını belirlemek için hücrelerin floresan görüntülerini alırken bir görüntü kılavuzu kullanın. İç halka içindeki alanda (merkezden 3,5 mm uzakta) ve dış halkada (merkezden 7 mm uzakta) bulunan hücreleri ayrı ayrı görüntüleyin ve analiz edin.
      NOT: Görüntü kılavuzu, hücreler ve örnekler arasındaki mesafeyi tanımlamak için kullanılır.
    4. Her örnek için ve kültür plakalarındaki kuyu için, hücrelerin önceden tanımlanmış bir mesafedeki numunelerle doğrudan temas halinde veya dolaylı temas halinde olduğu her ilgi alanından rastgele en az beş görüntü alın.
  4. Görüntü analizi
    1. Adım 4.3'ten elde edilen tüm hücre görüntüleri için, görüntü analizi için ImageJ gibi bir yazılım kullanarak hücre yayılma alanını ve en boy oranını ölçerek hücre morfolojisini ölçün.
    2. Her görüntü alanındaki hücre sayısını sayın. Doğrudan ve dolaylı temas koşulları altında hücre yapışma yoğunluğunu, birim alan başına düşen hücre sayısı olarak hesaplayın.

5. Medya ve örneklerin postkültür analizleri

  1. Postkültür ortamının pH'ını ölçün.
    NOT: Bazı numuneler, bozunmaları sırasında ortamın pH değerini değiştirir. Örneğin, magnezyum alaşımları gibi biyolojik olarak parçalanabilen metaller genellikle bozunmaları nedeniyle ortamın pH değerini arttırır31. Buna karşılık, PLGA gibi biyolojik olarak parçalanabilen polimerler, bozunduklarında genellikle ortamın pH değerini düşürür32. Postkültür ortamının pH değerinin ölçülmesi, bu numunelerin in vitro olarak bozulmasını gösterebilir.
    1. Hücre fiksasyonundan önce, adım 4.1.1'deki gibi postkültür ortamını toplayın.
    2. Önceden kalibre edilmiş bir pH metre kullanarak, toplama işleminden hemen sonra her bir kuyucuktaki postkültür ortamının pH değerlerini ölçün.
      NOT: Ortamın pH'ı, dikkate alınması gereken CO2 seviyesi ve sıcaklık gibi çevresel koşullar nedeniyle zamanla kayabilir.
  2. Biyolojik olarak parçalanabilen numunelerin bozunma davranışı için ortam bileşimlerini analiz edin. Ortamın renk değişimine neden olan bazı örnekler için, bozulma davranışını belirlemek için bir spektrofotometre veya bir mikroplaka okuyucu kullanarak postkültür ortamının optik yoğunluk (O.D.) değerini ölçün. Alternatif olarak, post-kültür ortamındaki bozunma ürünlerini analiz etmek için ultraviyole görünür spektroskopi (UV-VIS) ve Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopi-zayıflatılmış toplam yansıma (FTIR-ATR) kullanın.
    NOT: Bozunma ürünlerinin kültür sonrası ortamda ölçülmesi, numunelerin bozunma davranışını anlamak için değerlidir. En yaygın yaklaşımlardan biri, endüktif olarak eşleşmiş plazma-optik emisyon spektrometresi (ICP-OES) kullanarak postkültür ortamına ilgi iyonlarını ölçmektir. ICP-OES, metallerin ve seramiklerin postkültür ortamının bileşimlerini ölçmek için kullanılabilir, ancak polimerler için uygun olmayabilir. Polimerler genellikle karbon, hidrojen ve oksijenden oluşur ve bu elementlerin doğru bir şekilde ölçülmesi ICP-OES için zordur.
    1. pH ölçümü için adım 5.1.2'yi takiben, iyon konsantrasyonlarının optimum ölçümleri için istenen bir seyreltme faktörü kullanarak ortamı toplayın ve seyreltin.
    2. Bir ICP-OES kullanarak postkültür ortamındaki ilgi iyonlarının konsantrasyonlarını ölçün.
  3. Örneklerin postkültür analizi
    NOT: İn vitro hücre çalışmasından sonra, biyolojik olarak parçalanabilen numuneler boyut, kütle, yüzey morfolojisi, mikroyapı ve bileşimde değişebilir. Örneklerin kültür sonrası analizi, örneklerin bozunma mekanizmasını anlamaya yardımcı olur.
    1. Hücre kültüründen sonra, örnek boyutu, rengi, morfolojisi ve diğer görünür özelliklerdeki olası değişiklikleri göstermek için örneklerin fotoğraflarını çekin.
    2. Kültür sonrası numuneleri kurutun veya kurutun ve kütle, boyut ve hacimdeki değişiklikleri ölçmek için numune kütlesini, boyutunu ve hacmini ölçün.
    3. Örneklerin mikroyapısını ve morfolojisini karakterize etmek için bir taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanın. Numuneler üzerindeki bozunma ürünlerinin bileşimini ve fazını karakterize etmek için enerji dağıtıcı X-Işını spektroskopisi (EDX) ve X-ışını kırınımı (XRD) kullanın. Numune yüzeylerindeki kimyasal yapışmayı tespit etmek için FTIR-ATR kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 4, BMSC'lerin farklı kültür yöntemleri kullanılarak doğrudan ve dolaylı temas koşulları altında temsili floresan görüntülerini göstermektedir. Şekil 4A,B, ZC21 magnezyum alaşımları ile aynı 24 saat doğrudan kültürden sonra BMSC'leri doğrudan ve dolaylı temas koşulları altında göstermektedir1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İn vivo uygulamaların çeşitli yönleri için ilgilenilen biyomateryallerin in vitro sitouyumluluğunu değerlendirmek için farklı hücre kültürü yöntemleri kullanılabilir. Bu makalede, insan vücudunda biyolojik olarak parçalanabilen implant materyallerinin kullanıldığı farklı in vivo senaryoları taklit etmek için üç in vitro kültür yöntemi, yani doğrudan kültür, doğrudan maruz kalma kültürü ve maruz kalma kültürü gösterilmektedir. Doğrudan kültür yöntemi esas olarak implant materyallerine d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, ABD Ulusal Bilim Vakfı (NSF CBET ödül 1512764 ve NSF PIRE 1545852), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH NIDCR 1R03DE028631), Kaliforniya Üniversitesi (UC) Regents Fakülte Geliştirme Bursu ve Araştırma Tohumu Hibe Komitesi (Huinan Liu) ve UC-Riverside Tez Araştırma Bursu (Jiajia Lin) 'den gelen finansal desteği takdir etmektedir. Yazarlar, SEM / EDS kullanımı için UC-Riverside'daki Gelişmiş Mikroskopi ve Mikroanaliz Merkezi Tesisi'ni (CFAMM) ve XRD cihazlarının kullanımı için Dr. Perry Cheung'u takdir etmektedir. Yazarlar ayrıca kısmi düzenleme için Thanh Vy Nguyen ve Queenie Xu'ya teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca videonun anlatımını kaydettiği için Cindy Lee'ye teşekkür eder. Bu makalede ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazarlara aittir ve Ulusal Bilim Vakfı veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL serolojik pipetVWR490019-704
12 oyuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plakalarThermo Fisher Scientific353043
15 mL konik tüp (Polipropilen)VWR89039-666
18 G iğneBD305196
25½ G iğnesiBD305122
4 & prime ;, 6-diamidino-2-fenilindol dilaktat (DAPI)İnvitrojenD3571
50 mL konik tüp (Polipropilen)VWR89039-658
70 & mu; m naylon süzgeçFisher Scientific50-105-0135
Alexa Un 488-phalloidinYaşam teknolojileriA12379
Biyolojik güvenlik kabiniLABCONCOSınıf II, Tip A2
SantrifüjEppendorfRotor F-35-6-30, Santrifüj5430
Şeffaf Sigortalı Kuvars Yuvarlak ÇanakAdValue TeknolojisiFQ-4085
CO2 inkübatörüSANYOMCO-19AIC
CoolCell Dondurucu KabıCorning432000sıcaklık düşüşünü düzenlemek için tasarlanmış köpük kap
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Sigma-AldrichD5648
EDX analiz yazılımıOxford InstrumentsAztecSynergy
Enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.
Floresan mikroskobuNikonEclipse Ti Formaldehit
VWR100496-496
HematitometreHausser Scientific3520
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon Laboratuvarı (LOCI, Wisconsin Üniversitesi)
Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma
optik emisyon spektrometresi (ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
Optik mikroskopVWRVistaVision
Penisilin/streptomisin (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
pH metreVWRmodeli SB70P
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)VWR97062-730
Taramalı elektronik mikroskop (SEM)FEINova NanoSEM 450
cerrahi bıçakVWR76353-728
Doku Kültürü ŞişeleriVWRT-75, MSPP-90076
Transwell uçlarCorning3460
Tripsin-etilendiamintetraasetik asit çözeltisi (Tripsin-EDTA)Sigma-AldrichT4049
X-ışını kırınım cihazı (XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2
SH30910

Kaynaklar

  1. Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
  2. Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
  3. Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212(2018).
  4. Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
  5. Wu, C. -C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
  6. Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
  7. Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614(2020).
  8. Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
  9. Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
  10. Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
  11. Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
  12. Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
  13. Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
  14. Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
  15. Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410(2017).
  16. Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
  17. Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
  18. Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
  19. Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
  20. Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
  21. Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
  22. Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
  23. Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
  24. Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
  25. Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
  26. Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
  27. Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
  28. Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904(2020).
  29. Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018(2018).
  30. Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157(2014).
  31. Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
  32. Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
  33. Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
  34. Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
  35. Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
  36. Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
  37. Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
  38. Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
  39. Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
  40. Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
  41. Wetteland, C. L., Nguyen, N. -Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
  42. Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
  43. Wang, H. Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , The Ohio State University. (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

n Vitro SitouyumlulukDo rudan K lt r Y ntemiMaruziyet K lt r Y ntemiKemik li i K k H creleriH cre Adezyon Yo unlu uTaramal Elektron MikroskobuEnerji Da l ml X I nMagnezyum yon KonsantrasyonuISO Biyomalzeme Standartlar

İlgili makaleler