Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Urasil-DNA glikozilaz (UDG), sitozinin hidrolitik deaminasyonundan oluşan urasilin düzeltilmesi için baz eksizyon onarım yolunda önemli bir bileşendir. Bu nedenle, genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. UDG aktivitesini ölçmek için oldukça spesifik, etiketsiz, radyo-izotopik olmayan bir yöntem geliştirilmiştir. Bölgeye özgü bir urasil içeren sentetik bir DNA dubleks, UDG tarafından bölündü ve daha sonra Matris destekli Lazer Desorpsiyon / İyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) analizine tabi tutuldu. DNA'daki apurinik / apirimidinik bölge (AP) ürününü iplik kopmadan korumak için bir protokol oluşturuldu. Substrattan ürüne m/z değerindeki değişim, urasil hidrolizini UDG ile değerlendirmek için kullanıldı. UDG kinetik analizi için Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM / s ve Kcat = 9.31 s-1 veren bir G: U substratı kullanıldı. Bu yöntemin urasil glikozilaz inhibitörü (UGI) testine uygulanması, 7.6 pM'lik bir IC50 değeri vermiştir. Tek sarmallı ve çift sarmallı DNA substratları içinde çeşitli pozisyonlarda urasil kullanan UDG özgüllüğü, farklı bölünme verimlilikleri göstermiştir. Bu nedenle, bu basit, hızlı ve çok yönlü MALDI-TOF MS yöntemi, çeşitli monofonksiyonel DNA glikozilazları için mükemmel bir referans yöntemi olabilir. Aynı zamanda DNA glikozilaz inhibitörü taraması için bir araç olarak potansiyele sahiptir.
Giriş
Urasil RNA'da normal bir baz olmasına rağmen, genomik DNA'da sık görülen ve oldukça mutajenik bir lezyondur. Urasil, bir deoksisitidinin spontan/enzimatik hidrolitik deaminasyonundan kaynaklanabilir. Her canlı hücrede, bu deaminasyon fizyolojik koşullar altında günde 100-500 kez gerçekleşir1,2. Bu değişiklikler onarılmazsa, DNA dizisi bileşiminde mutasyona neden olan bir değişiklik olabilir. DNA'daki urasil, replikasyon sırasında dATP ile eşleşmeyi tercih ettiğinden, sitozin urasil'e deaminasyon yaparsa, iki replikasyon olayında, döl DNA3'ün yarısında yeni bir G: C'den A: T'ye geçiş mut....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Substrat/şablon hazırlama
- Dubleks bölge için ~50 ± %10 dengeli G + C içeriğine ve minimum 50 °C erime sıcaklığına sahip urasil substrat/şablon dubleks tasarlayın.
NOT: 18 nt substratlar ve 19 nt şablonları arasındaki bir nükleotid farkı (Tablo 1 ve Şekil 1) daha iyi MS sinyali yorumlamasına ve uygun tavlamaya yardımcı olur. Şablon iplikçik, A-U veya G-U uyumsuzlukları üretmek için tamamlayıcı DNA görevi görür (Tablo 1), ancak MS ölçümlerinde referans sinyali olarak da kullanılabilir. HPLC saflaştırılmış sentetik oligonükleotidlerin kullanımı bu çalışma için tatmin edicidir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şablonlar ve alt tabakalar
Örnek olarak bir G şablonu ile eşleştirilmiş merkezde U ile sentetik oligonükleotidler (U + 9) alındığında (Şekil 1A), sentetik oligonükleotid saflığının kalite kontrolü için eşdeğer miktarda şablon ve urasil içeren substratın boş bir kontrolü kullanılabilir (Şekil 1B; sinyaller belirlenen m / z ve düşük arka plan gürültüsü ile eşleşir). MS veri analizi için tepe yükseklikleri ölçüldü (Şekil 2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, AP içeren DNA ürünlerini doğrudan tespit etmek için UDG MALDI-TOF MS tahlil yönteminin kullanılması için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu yöntemin temel avantajları, urasil içeren substratların etiketsiz, ölçeklenebilir, kullanımı kolay olması ve substrat tasarımında daha fazla esneklik sağlamasıdır.
UDG tedarikçisi tarafından önerilen fenol / kloroform ekstraksiyonu, ürün DNA'sının bozulmasını önlemek için enzimin inaktivasyonunu sağlar. Bununla birlikte, fenol ekstraksiyon.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
NCFPB Fonksiyonel Genomik Entegre Çekirdek Tesisi'ne (Taipei, Tayvan) ve NRPB Farmakogenomik Laboratuvarı'na (Taipei, Tayvan) teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Tayvan, R.O..C. Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenmiştir [hibe numarası MOST109-2314-B-002 -186 - K.-Y.S., ÇOĞU 107-2320-B-002-016-MY3 - S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 - W.-h.F.]. H.-L.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi'nden doktora bursu almıştır. Açık erişim ücreti için finansman: Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, R.O.C.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-Amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol (Tris bazı) | J.T baker | Protokolü 1,2 | |
| Otoklavlanmış deiyonize su | MILLIPORE | Protokolü 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protokolü 1,2 | |
| Eldivenler | AQUAGLOVE | Protokolü 1,2,3 | |
| Hidroklorik asit (HCl) | SIGMA | Protokolü 1,2 | |
| Buz kovası | Taiwan.Inc | Protokolü 2 | |
| Düşük tutma pipet uçları (0.5-10 & L) | ekstra gen | Protokolü 1,2 | |
| Düşük tutma pipet uçları (1,250 &mikro; L) | ulusal bilimsel tedarik co, Inc. | Protokol 1,2 | |
| Düşük tutma noktalı pipet uçları (200 & mikro; L) | ulusal bilimsel tedarik co, Inc. | Protokol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Kütle spektrometresi kontrol programları arasında Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE ve Start RT Process bulunur. | |
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protokolü 3 |
| Mikrosantrifüj | Kubota | Protokolü 2 | |
| Mikrosantrifüj | Clubio | Protokolü 2 | |
| Mikrosantrifüj tüpü (1.5 mL) | Ulusal bilimsel tedarik co, Inc. | Protokol 2 | |
| Mikrosantrifüj tüp rafı | Taiwan.Inc | Protokol 1,2 | |
| Mikropipet ve nbsp; (P1000) | Gilson | Protokolü 1,2 | |
| Mikropipet ve nbsp; (P2) | Gilson | Protokolü 1,2 | |
| Mikropipet (P10) | Gilson | Protokolü 1,2 | |
| Mikropipet (P100) | Gilson | Protokolü 1,2 | |
| Mikropipet (P200) | Gilson | Protokolü 1,2 | |
| Mikropipet (SL2) | Rainin | Protokolü 1,2 | |
| Oligonükleotidler | Entegre DNA Teknolojileri (Singapur) | Protokol 1,2 | |
| Görev Grafiği IC50 Hesap Makinesi (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Şekil 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 | |
| Sodyum hidroksit (NaOH) | WAKO | Protokolü 2 | |
| SpectroCHIP dizisi | Agena Bioscience, CA | # 01509 | Protokol 3, 5 |
| Zamanlayıcı | Taiwan.Inc | Protokol 2 | |
| Typer 4.0 yazılımı | Agena Bioscience, CA | # 10145 | Protokolü 6 Typer 4.0, Test Tasarımcısı, Test Editörü, Plaka Editörü ve Typer Analizörü dahil olmak üzere dört programdan oluşur. |
| UDG Reaksiyon Tamponu (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protokol 2 |
| Urasil Glikozilaz İnhibitörü | New England Biolabs, MA | M0281S | Protokol 2 |
| Urasil-DNA Glikozilaz | New England Biolabs, MA | M0280L | Protokol 2 |
| UV-VISBLE spektrofotometre UV-1601 | SHIMADZU | Protokol 1 | |
| Su banyosu | ZETA ZC-4000 ( Tayvan.Inc) | Protokol 2 |
Kaynaklar
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
