Method Article

Açık Kaynaklı Bir Laboratuvar Robotu Tarafından Otomatikleştirilmiş Av Tüfeği Proteomik Numune İşleme

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deterjan giderme, protein sindirimi ve peptit tuzdan arındırma adımlarını kapsayan kütle spektrometresi deneyleri için yarı otomatik protein numunesi hazırlamayı gerçekleştirmek üzere açık kaynaklı bir robotik sıvı taşıma sisteminin çalıştırılması için ayrıntılı protokol ve üç Python komut dosyası sağlanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik deneyleri, enzymatic protein sindirimi ve temizleme dahil olmak üzere, önemli kişi-saat tezgah işçiliği alabilen ve toplu olarak değişkenlik kaynağı sunabilen birden fazla numune hazırlama adımı gerektirir. Pipetleme robotları ile laboratuvar otomasyonu manuel çalışmayı azaltabilir, verimi en üst düzeye çıkarır ve araştırma tekrarlanabilirliğini artırabilir. Yine de, standart otomasyon istasyonlarının dik başlangıç fiyatları, onları birçok akademik laboratuvar için uygun hale getiremez hale getirse de. Bu makalede, yarı otomatik protein azaltma, alkilasyon, sindirim ve temizleme adımlarını ayarlama talimatları da dahil olmak üzere uygun fiyatlı, açık kaynaklı bir otomasyon sistemi (Opentrons OT-2) kullanılarak bir proteomik örnek hazırlama iş akışı açıklanmaktadır; yanı sıra, OT-2 sistemini uygulama programlama arayüzü aracılığıyla programlamak için açık kaynaklı Python komut dosyalarına eşlik eder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik, biyolojik numunelerdeki birçok proteinin bolluğunu aynı anda ölçmek için güçlü bir araçtır. Biyoinformatik analizi ile proteomik deneyler, biyobelirteçleri tanımlamak ve patolojik mekanizmaları destekleyen ilişkili biyolojik kompleksleri ve yolları keşfetmek için rutin olarak sunulur. Yüksek analit özgüllüğü ve potansiyel nicel doğruluğu ile av tüfeği proteomik, antikorlara güvenmeye gerek kalmadan klinik numune analizi için araştırma tesisleri ve tanı laboratuvarları tarafından benimsenmesi için mükemmel bir potansiyele sahiptir1,2.

A....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geliştirilen Python komut dosyaları GitHub'a şu https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Komut dosyalarının bir kopyası Ek Dosya 1'de verilmiştir. Lütfen en son sürümler için GitHub deposuna bakın.

1. Deneysel hazırlıklar

  1. İletişim kuralını başlatmadan önce gerekli donanımı denetleyin.
    NOT: Aşağıdaki donanım bileşenleri gereklidir: OT-2 pipetler, pipet uçları, 4'ü 1 arada tüp raf seti, alüminyum blok seti, manyetik modül, sıcaklık modülü, 96 kuyu 2 mL derin kuyu plakaları (bkz. Malzeme Tablosu).

2. Tek proteinli sığır ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada OT-2 robotu ile uyumlu ve tek bir protein standart sığır serum albümin (teknik çoğalır n = 5 sindirim) ve deterjan içeren insan kalbi lysate örneği (n = 5 sindirim) ile kütle spektrometrisi proteomik için örnek hazırlama yapan üç Python betiği sağlanmıştır. Her sindirme ürünü iki peptit temizleme reaksiyonuna bölünür. BSA ve kalp örneklerinin her çalışmasında tanımlanan peptit spektrumlu eşleşmelerin (PSM' ler), peptitlerin ve proteinlerin sayısı Şekil 4 ve Şekil .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol içinde kritik adımlar
En iyi performans için Opentrons onaylı labware, modüller ve OT-2 ile uyumlu sarf malzemeleri kullanılmalıdır. Opentrons'un Reference14'teki talimatını takiben özel laboratuvar yazılımları oluşturulabilir. OT-2 destesini, pipetleri ve labware'i ilk kez kullanıldığında kalibre ettiğinizden emin olun. Peptit ve protein temizliği için boncuk hazırlamak için SP3 boncuk üreticisinin yönergelerine uymak da önemlidir. Özellikle, boncuk ve peptit bağlama .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri bir çakışma yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen NIH ödülleri F32-HL149191'den YH'ye desteklendi; R00-HL144829'dan EL'e; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278'den MPL'ye. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 web tabanlı bir bilim illüstrasyon aracı yardımıyla oluşturulmuştur, BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 ve mikro; L pipet uçlarıOpentrons
4'ü 1 arada tüp raf setiOpentronsHer set 2 taban standı ve 1.5 mL, 2 mL, 15 mL + 50 mL, 15 mL ve 50 mL olmak üzere 4 tüp tutucu üst içerir. Bu çalışmada 2 mL ve 15 mL + 50 mL tops kullanıyoruz.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC KolonuThermo Scientific# 1645683 & mu; m parçacığı; 100 > gözenek; 75 μ m x 150 mm
Asetonitril LC-MS sınıfıVWR#JT9829
Alüminyum blok setiOpentronsBu blok seti, 96 oyuklu, 2.0 mL tüplerle uyumlu 3 üst kısım ve OT-2 sıcaklık modülü ile kullanmak için bir PCR şeridi içerir. Bu yazıda 2.0 mL tüp tutucuyu kullanıyoruz.
Amonyum BikarbonatSigma-Aldrich# A6141
Sığır Serumu Albümin Standardı, 2 mg / mLThermo Scientific# 23210
Dimetilsülfoksit (DMSO) LC-MS sınıfıThermo Scientific# 85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray HPLC SütunlarıThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Etanol Korumalı 195-200Fisher# 04-355-720
Formik Asit LC-MS sınıfıThermo Scientific# 85178
İnsan kalbi lizatıNovus BiologicalsNB820-59217
İyodoasetamidSigma-Aldrich#I1149
Manyetik tüp rafıThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova ve diğerleri, 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini SantrifüjThermo Scientific#75004061hızlı sıkma için tezgah üstü mini santrifüj
NEST 2 mL 96 Kuyulu Derin Kuyu Plakası, V AltOpentrons
OT-2 manyetik modülOpentronsGEN1
OT-2 P300 tek kanallı pipetOpentronsGEN1
OT-2 P50 tek kanallı pipetOpentronsGEN1 OT-2
robot pipetleme robotuOpentronsOT-2
OT-2 sıcaklık modülüOpentronsGEN1
Pierce Kantitatif Kolorimetrik Peptit TestiThermo Scientific# 23275
Protein LoBind tüpleri 2.0 mLEppendorf#022431102
Protein Dizisi VeritabanıUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20İncelendi:Evet
Sera-Mag SpeedBead Karboksilat ile Modifiye Edilmiş Manyetik Parçacıklar, HidrofobikCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Karboksilat ile Modifiye Edilmiş Manyetik Parçacıklar, HidrofilikCytiva# 45152105050250
SpeedVacThermo ScientificVakum evaporatör
Thermo Q Exactive HF Kütle SpektrometresiThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Tripsin MS SınıfıThermo Scientific# 90057
Su LC-MS sınıfıVWR#BDH83645.400

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue anal....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Shotgun ProteomicsSample PreparationLab AutomationOpen Source RobotProtein DigestionMass SpectrometryLiquid Handling SystemPython Automation ScriptsProtein ReductionPeptide Cleanup

Related Articles