Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Açık Kaynaklı Bir Laboratuvar Robotu Tarafından Otomatikleştirilmiş Av Tüfeği Proteomik Numune İşleme

3.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63092

⸱

28 Ekim 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Bu makalede

Özet

Deterjan giderme, protein sindirimi ve peptit tuzdan arındırma adımlarını kapsayan kütle spektrometresi deneyleri için yarı otomatik protein numunesi hazırlamayı gerçekleştirmek üzere açık kaynaklı bir robotik sıvı taşıma sisteminin çalıştırılması için ayrıntılı protokol ve üç Python komut dosyası sağlanmıştır.

Özet

Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik deneyleri, enzymatic protein sindirimi ve temizleme dahil olmak üzere, önemli kişi-saat tezgah işçiliği alabilen ve toplu olarak değişkenlik kaynağı sunabilen birden fazla numune hazırlama adımı gerektirir. Pipetleme robotları ile laboratuvar otomasyonu manuel çalışmayı azaltabilir, verimi en üst düzeye çıkarır ve araştırma tekrarlanabilirliğini artırabilir. Yine de, standart otomasyon istasyonlarının dik başlangıç fiyatları, onları birçok akademik laboratuvar için uygun hale getiremez hale getirse de. Bu makalede, yarı otomatik protein azaltma, alkilasyon, sindirim ve temizleme adımlarını ayarlama talimatları da dahil olmak üzere uygun fiyatlı, açık kaynaklı bir otomasyon sistemi (Opentrons OT-2) kullanılarak bir proteomik örnek hazırlama iş akışı açıklanmaktadır; yanı sıra, OT-2 sistemini uygulama programlama arayüzü aracılığıyla programlamak için açık kaynaklı Python komut dosyalarına eşlik eder.

Giriş

Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik, biyolojik numunelerdeki birçok proteinin bolluğunu aynı anda ölçmek için güçlü bir araçtır. Biyoinformatik analizi ile proteomik deneyler, biyobelirteçleri tanımlamak ve patolojik mekanizmaları destekleyen ilişkili biyolojik kompleksleri ve yolları keşfetmek için rutin olarak sunulur. Yüksek analit özgüllüğü ve potansiyel nicel doğruluğu ile av tüfeği proteomik, antikorlara güvenmeye gerek kalmadan klinik numune analizi için araştırma tesisleri ve tanı laboratuvarları tarafından benimsenmesi için mükemmel bir potansiyele sahiptir1,2.

Av tüfeği proteomik analizi için protein örnekleri hazırlamak için, biyolojik örneklerden (örneğin, hücreler ve dokular) çıkarılan proteinlerin tipik olarak, numune protein konsantrasyonunu, protein azaltmayı ve alkilasyonu ölçmek ve peptitlere enzimatik sindirim dahil olmak üzere uzun protokoller kullanılarak işlenmesi gerekir. Ayrıca, deterjan içeren yaygın lizis tamponlarında çıkarılan proteinler genellikle analizden önce ek tampon değişimi veya deterjan çıkarma adımları gerektirir, çünkü deterjan tripsin sindirimini engelleyebilir ve aşağı akış sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizinin performansını önemli ölçüde düşürebilir3. Peptitler tipik olarak enzymatic sindirimi takiben LC-MS/MS uyumlu çözücülerde daha fazla tuzdan arındırılır, kurutulur ve yeniden inşa edilir. Bu protein biyokimyası prosedürleri emek yoğun ve zaman alıcı olabilir. Böylece, proteomik iş akışlarının verimini sınırlamaya ve elde edilen verilerin değişkenliğine katkıda bulunmaya devam ederler4,5. İnsan hataları ve önyargıları, veri farkını ve tekrarlanabilirliğini etkileyen önemli faktörler olarak kabul edilmiştir6,7. Kütle spektrometresi numune hazırlama iş akışlarındaki insan hatalarını en aza indirmek için, otomatik pipetleme robotik sistemleri, av tüfeği proteomik ve hedefli kütle spektrometresi analizinden protein tanımlama ve nicelemenin verimini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmek için kullanılmıştır, burada bu tür gelişmeler kritik araştırma ve klinik ortamlarda proteomik teknolojilerin yaygın olarak benimsenmesi için itici güç olarak kabul edilmiştir8, 9,10,11,12,13. Bununla birlikte, mevcut protokollerin çoğu, akademik ortamdaki veya sınırlı bir bütçeyle birçok laboratuvarda yardımcı programlarını sınırlayan, önemli yatırım ve eğitim gerektiren robotik sıvı işleme platformlarını kullanır.

Bu makalede, tipik bir av tüfeği proteomik numune hazırlama iş akışını yarı otomatikleştirmek için düşük maliyetli, açık kaynaklı robotik sıvı taşıma sistemi OT-2'yi kullanan bir protokol açıklanmaktadır. OT-2, diğer birçok robotik sıvı taşıma sisteminden daha düşük bir maliyete sahiptir ve yazma sırasında yaklaşık 5.000 ABD dolarına mal olur. Farklı modüllerin ve laboratuvar yazılımlarının fiyatlarını hesaba katırken, bu protokolde yazma sırasında deneyler kurmanın toplam maliyeti yaklaşık 10.000 $ 'dır, bu da onu daha pahalı seçenekler üzerinde önemli ölçüde daha geniş bir laboratuvar kümesi için daha uygun hale getirir. OT-2, Python komut dosyaları aracılığıyla açık kaynaklı programlama ile uyumludur ve kullanıcı tanımlı DIY protokol tasarımında büyük esneklikler sunar. Şirket içinde geliştirilen üç komut dosyası kullanılarak, aşağıdaki protokoller, ot-2 istasyonunda tipik bir av tüfeği proteomik örnek hazırlama iş akışını arketipik bir protein standardıyla (sığır serum albümin; BSA) ve normal bir insan kalp lisatının karmaşık bir protein örneğidir (Şekil 1). (1) BSA örneği ve (2) karmaşık bir kardiyak lisat örneğinin işlenmesine ilişkin prosedürler sırasıyla Protokol 1, 2, 5, 6 ve 3, 4, 5, 6 bölümlerinde ayrıntılı olarak yer haline gelir. Sera-Mag karboksilat modifiye manyetik boncuklar, protein ve peptit numunelerindeki deterjanları ve tuzları çıkarmak için tek pot katı fazlı geliştirilmiş numune hazırlamada (SP3) kullanılır. Sığır serum albümin ve insan kalp proteinlerinden elde edilen triptik sindirimler SP3 boncukları tarafından daha fazla temizlenir ve LC-MS/MS analizi için gönderilir. Kütle spektrumları daha sonra peptit ve protein tanımlama için MaxQuant yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bizim tarafından gerçekleştirilen temsili sonuçlar, protokolün tezgah zaman tasarrufu sağlarken mükemmel teknik değişim katsayıları (CV) elde ettiğini ve el sindirmeden daha düşük olmadığını göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Geliştirilen Python komut dosyaları GitHub'a şu https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Komut dosyalarının bir kopyası Ek Dosya 1'de verilmiştir. Lütfen en son sürümler için GitHub deposuna bakın.

1. Deneysel hazırlıklar

  1. İletişim kuralını başlatmadan önce gerekli donanımı denetleyin.
    NOT: Aşağıdaki donanım bileşenleri gereklidir: OT-2 pipetler, pipet uçları, 4'ü 1 arada tüp raf seti, alüminyum blok seti, manyetik modül, sıcaklık modülü, 96 kuyu 2 mL derin kuyu plakaları (bkz. Malzeme Tablosu).

2. Tek proteinli sığır serum albümin (BSA) ile kütle spektrometresi (MS) numune hazırlama

  1. NoSP3_digestion.py komut dosyasını bir metin düzenleyicisinde açın ve yalnızca BURADA ÖZELLeştİr bölümünde denemeye özgü değişkenleri gerektiği gibi belirtin.
    NOT: Deneye özgü değişkenler, örnek sayısını ve çoğaltmayı içerir; numune konsantrasyonu; reaktiflerin hacmi dithiothreitol - DTT, iodoacetamid - IAA ve tripsin; DTT ve IAA kuluçka süresi ve pipet P20/P50 ve P300 için başlangıç ucu).
    1. Opentrons Uygulamasını açın ve komut dosyasını Opentrons Uygulamasındaki PROTOCOL sekmesine yükleyin.
      NOT: Opentrons Uygulaması Reference14'ten yerel bir bilgisayara indirilebilir. Yazarken, Opentrons P50 elektronik pipeti Opentrons mağazasından satın alınamaz. Protokolde belirtilen birimlerle uyumlu P20 tek kanallı elektronik pipet ile değiştirilmiştir. P50 pipeti P20 pipeti ile değiştirmek için komut dosyasında notlar ve talimatlar yapılmıştır. Kullanıcıların Opentrons API yönergesini takiben belirli pipetlerin bu protokolle uyumluluğunu test etmesi ve doğrulaması gerekebilir.
  2. OPENTRONS Uygulamasındaki adım adım ekran talimatlarını izleyerek ROBOT sekmesinde ROBOT sekmesini açın ve robot güverte kalibrasyonu Kalibre Destesi gerçekleştirin.
    NOT: Bu adım yalnızca daha önce uygulanmamışsa veya robot yakın zamanda yerinden çıkmışsa gereklidir.
  3. Uç uzunluğu kalibrasyonunu gerçekleştirmek için PIPETLERI YÖNET düğmesine tıklayın, ardından varsayılan uç ve pipet kombinasyonu konumunu kalibre etmek için pipet ofset kalibrasyonuna tıklayın.
    NOT: Pipet ilk kez kullanılıyorsa bu adım gereklidir.
  4. Gerekli labware ve pipetleri Python komut dosyasında belirtilen OT-2 destesinde ilgili konuma yerleştirin (Şekil 2).
    NOT: Sıcaklık modülünün bağlı ve açık olduğundan ve alüminyum bloğun sıcaklık modülünün üzerine yerleştirildiğından emin olun.
  5. KALIBRASYON sekmesini açın ve bu python komut dosyasında gerekli olan labware ve pipetlerin kombinasyonu için kalibrasyon gerçekleştirin.
    NOT: Opentrons Uygulaması, aynı labware ve pipetlerle gelecekteki uygulamalar için gerekli olmayan kalibrasyon parametrelerini kaydeder.
  6. Kütle spektrometresi sınıfı suda 39,53 mg ABC'yi 15 mL konik tüpte toplam 5 mL hacme çözerek 5 mL 100 mM amonyum bikarbonat (ABC) (pH ~8,0) çözeltisi hazırlayın. Amonyum bikarbonat tamponu, 15 mL + 50 mL tüp tutucu üst kısmı ile 4'si 1'i 1'de 4 tüp rafının A1 kuyusuna yerleştirin.
  7. 2,0 mL protein düşük bağlayıcı tüpte 1 mL sığır serum albümin (BSA) proteini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Numuneyi 2 mL tüp tutucu üst kısmına sahip 4'si 1'i 1'de 4 tüp rafının A1 kuyusuna yerleştirin.
  8. A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2 vb.
    NOT: Robotik pipet, örnekleri varsayılan olarak son örneğe kadar A1'den (ilk örnek) başlayarak dikey sırada dağıtacaktır. Yatay dağıtım belirtilebilir. Ayrıntılar için15'e bakın. Hazırlanması gereken toplam tüp sayısı, toplam numune sayısına eşit olmalıdır (yani, biyolojik numune sayısı, numune başına teknik çoğaltma sayısı ile çarpılır).
  9. Kütle spektrometresi sınıfı suda 9,26 mg DTT katı maddeyi toplam 1 mL hacme çözerek 60 mM DTT'nin 1 mL'sini hazırlayın. DTT'i 2 mL tüp tutucu üst kısmı ile 4'si 1'de 4 tüp rafının A6 kuyusuna yerleştirin.
    DİkKAT: DTT insan gözlerine, cilde ve solunum sistemine zararlıdır. KKD giyin ve kimyasal bir kaputun altına takın. Uygun prosedürler için üreticinin güvenlik veri sayfasına bakın.
  10. Robot, alüminyum bloktaki numune tüplerine uygun miktarda ABC tamponu aktarırken gözlemleyin.
    NOT: Her tüpteki toplam ABC ve protein karışımı hacmi 100 μL'dir ve ABC tamponunun hacmi betikte hesaplanır (V = 100 μL, 100 μg protein numunesi hacmi).
  11. Robotun ABC tamponlu her tüpe 100 μg BSA proteini aktardığından emin olun.
    NOT: Tipik bir deney, protein sindirimi için 100 μg'ye kadar protein kullanabilir, yani bu BSA örneği için 50 μL 2.0 μg/ μL.
  12. Robot programın duraklatıldığını manuel olarak doğrulayın ve şu mesajı görüntüler: Protokole devam etmeden önce DTT'nin yuva 4'te bulunan 2 mL tüp rafının A6'sına yüklendiğinden emin olun. A6 kuyusuna bir DTT tüpü yerleştirildiğından emin olun ve kapağını açın. Devam etmek için Opentrons uygulamasındaki Özgeçmiş düğmesine tıklayın. Robotun her numuneye 10 μL DTT çözeltisini iyi aktardığından ve ardından beş karıştırma mermisi aktardığından emin olun.
  13. Robot programın duraklatıldığından ve şu mesajı görüntülediğine emin olun: Örnek tüplerdeki kapakları kapattığından emin olun. Tüplerin kapaklarını manuel olarak kapatın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robotun sıcaklık modülü, sıcaklık 55 °C'ye ulaşana kadar alüminyum bloğu ısıtmaya başlayana kadar bekleyin, ardından numunelerin 55 °C'ye ulaşmasını sağlamak için 5 dakikalık bir inkübasyon.
    NOT: Robot, kuluçka sırasında DTT tarafından protein azaltımını sağlamak için sıcaklığı 30 dakika boyunca 55 °C'de tutacaktır.
  14. 30 dakikalık DTT inkübasyonu sırasında, ABC tamponunda 34,68 mg IAA'yı toplam 1 mL hacme çözerek 187,5 mM Iodoasetamid (IAA) 1 mL hazırlayın. Işığa maruz kalmamak için IAA çözeltisini alüminyum folyo ile manuel olarak sarın.
    DİkKAT: IAA şiddetli göz ve solunum tahrişi neden olabilir. Uygun KKD giyen kimyasal bir kaputun altına tak.
  15. 30 dk DTT kuluçka adımını tamamladıktan sonra robotun sıcaklık modülünün soğuduğundan emin olun.
    NOT: Modülün sıcaklığı 22 °C'ye ulaştıktan sonra, numunelerin tamamen soğumasını sağlamak için modül sıcaklığı 5 dakika boyunca korur.
  16. Robotun programı duraklatıldığında örnek tüplerin kapağını açın ve uyarı mesajını görüntüleyin: Numune tüplerinde kapakları açtığından emin olun. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın.
  17. Robotun programının bir uyarı mesajıyla duraklatıldığını manuel olarak doğrulayın: Protokolü sürdürmeden önce IAA'nın yuva 4'te bulunan 2 mL tüp rafının B6'sına yüklendiğinden emin olun. IAA tüpünün raf konumunu onaylayın ve tüp kapağını açın. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın. Robotun her numune tüpüne 10 μL IAA ve ardından beş karıştırma mermisi aktardığından emin olun.
  18. Robotun programı duraklatıldığında örnek tüpleri kaplayın ve mesajı görüntüleyin: Numune tüplerindeki kapakları kapatın ve numune tüplerini folyo ile örtün. Tüm alüminyum bloğu temiz bir folyo parçası ile örtün. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın. Numuneler 22 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırılana kadar bekleyin. IAA inkübasyonu tamamlandıktan sonra robotun sıcaklık modülünün devre dışı olduğundan emin olun.
  19. IAA inkübasyonu sırasında (adım 2.19) 0.2 μg/μL'lik son konsantrasyonda tripsin çözeltisinin bir karışımını hazırlayın: 100 μL MS sınıfı suda 20 μg kütle spektrometresi / dizileme sınıfı tripsin çözün.
  20. Trypsin çözeltisini, robotun programı duraklatıldığında ve uyarı mesajını görüntülediğinde tüp kapağı açık olan 2 mL tüp rafının C6 kuyusuna yerleştirin: Trypsin'in, devam protokolünden önce yuva 4'te bulunan 2 mL tüp rafının C6'sına yüklendiğinden emin olun. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın.
  21. Robotun programının duraklatılıp duraklatılmadığını kontrol edin ve uyarı mesajını görüntüler: Sıcaklık modülündeki örnek tüplerde kapakları açın. Örnek tüplerin kapağını çözün ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robot her numune tüpüne 10 μL tripsin ve ardından beş karıştırma mermisi aktarırken beklemede kalın.
  22. Numune tüp kapaklarını parafin filmi ile sarın, tüm numuneleri sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya aktarın ve 600 rpm sallama ile 16-20 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Tripsin sindirimi doğrudan 37 °C'deki sıcaklık modülünde de yapılabilir.

3. SP3 paramanyetik boncuklar kullanarak peptit temizliği

  1. Bir gecede tripsin sindirimden sonraki gün, numuneleri bir tezgah üstü mikrosantrifüj (≤2.000 x g) kullanarak kısa bir süre döndürün (bkz. Malzeme Tablosu) ve örnekleri manyetik bir tüp rafı üzerine yerleştirin. Örneklerin 2 dakika bekletilsin.
    1. Süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni bir protein düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri kümesine aktarın. Numuneleri buzdolabında tutun ve 3.2-3.9 arası adımlara geçin.
      NOT: Uzun süreli depolama için numuneleri -80 °C'de saklayın.
  2. SP3_peptide_cleanup.py Python komut dosyasını bir metin düzenleyicisinde açın ve YALNıZCA BURADA ÖZELLeştİr bölümünde gerektiği gibi belirtin.
    NOT: Deneye özgü değişkenler arasında numune ve çoğaltma sayısı, aktarılacak peptitlerin hacmi, reaktiflerin hacmi (boncuklar, asetonitril, DMSO), P20/P50 ve P300 pipetleri için başlangıç ucu ve manyetik modüldeki derin kuyu plakasında iyi başlangıç bulunur. Her BSA sindirim örneği, her bir yinelemede 55 μL ile iki teknik kopyaya dönüştürülecek yaklaşık 120 μL sindirim hacmi içerir. Yalnızca özetin yarısını temizlemek için çoğaltma numarası değişkenini 1 olarak değiştirin.
  3. Komut dosyasını Opentrons uygulamasındaki PROTOKOL sekmesine yükleyin.
  4. Gerekli labware ve pipetleri Python komut dosyasında belirtilen OT-2 destesinde ilgili konuma yerleştirin (Şekil 3). Manyetik modülün açık olduğundan ve robota bağlı olduğundan emin olun. Manyetik modülün üstüne yeni bir 2 mL 96 kuyu derin kuyu plakası (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin.
  5. KALIBRASYON sekmesini açın ve bu Python komut dosyasında gereken labware ve pipetlerin kombinasyonu için kalibrasyon gerçekleştirin.
    NOT: Aynı labware ve pipet kombinasyonları için kalibrasyonun yalnızca bir kez yapılması gerekir ve Opentrons Uygulaması kalibrasyon parametrelerini kaydeder.
  6. Sindirilen örnekleri (adım 3.1'de toplanan süpernatant) 2.0 mL tüp rafı için A1, B1 kuyularında dikey sırayla yerleştirin....
  7. 50 mL konik bir tüpte 15 mL LC-MS/MS uyumlu asetonitril hazırlayın ve tüpü 15 mL + 50 mL tüp tutucu üst kısmı ile 4'ü 1 arada tüp rafında kuyu A3'e yerleştirin.
  8. 15 mL konik tüpe 4,9 mL kütle spektrometresi sınıfı su ile 100 μL DMSO ekleyerek % 2 DMSO'nun 5 mL'sini hazırlayın. Tüpü 15mL + 50mL tüp rafında kuyu A1'e yerleştirin.
  9. Boş bir 50 mL konik tüpü Atık olarak etiketleyin ve 15mL + 50mL tüp rafındaki kuyu B3'e yerleştirin.
  10. Sp3 boncuklarını Reference16'dan sonra hazırlayın.
    1. 2,0 mL mikrosantrifüj tüpünde uygun miktarda karışık boncuk hazırlayın.
      NOT: Her peptit temizleme reaksiyonunda 10 μL karışık boncuk gerekir. Örneğin, dört temizleme reaksiyonları için en az 40 μL karışık boncuk hazırlayın.
    2. Boncuk karışımını manyetik standda 2 dakika bekletin. Üstnatant bir pipet ile dikkatlice çıkarın ve bir pipet ile süpernatant hacmini ölçün.
    3. Kalan boncuk hacmini hesaplayın ve kütle spektrometresi sınıfı suyun 5-10 katı (örneğin, 20 μL boncuk için 100-200 μL su) ve 10 sn için girdap (hız 10) ekleyin. Boncukları manyetik standa 2 dakika oturt.
    4. Toplam üç yıkama için su yıkama adımlarını tekrarlayın.
    5. MS sınıfı sudaki son boncukları 50 μg/μL'lik son konsantrasyona yeniden depolayın.
      NOT: Boncukların 10 μg/μL16 konsantrasyonda yeniden kullanılması önerilir. Mevcut optimizasyon çabasında, boncuk-peptit-asetonitril karışımının toplam hacmini en aza indirmek için son konsantrasyon 50 μg / μL olarak değiştirildi.
  11. Robotun sindirilen numunelerin 55 μL'lik kısmını manyetik modüldeki derin kuyu plakalarındaki kuyulara aktardığından emin olun.
  12. Robot protokolünün duraklatıldığını doğrulayın ve mesajı görüntüler: Protokole devam etmeden önce hazırlanan boncukların yuva 4'te bulunan 2 mL tüp rafının A6'sına yüklendiğinden emin olun. Boncukları vorteks edin ve ardından mini bir tezgah üstü santrifüj üzerinde 5 sn boyunca kısa bir süre aşağı çevirin ve boncukları kapak açık olan 2 mL tüp rafının A6 kuyusuna yerleştirin. Robot boncukları yukarı ve aşağı pipetleme ile beş tur boyunca 10 kez karıştırırken beklemede kalın.
    NOT: Robot, derin kuyu plakalarındaki sindirilen her numuneye 10 μL boncuk aktarır ve ardından beş kez karıştırılır.
  13. Robotun her kuyuya 1.292 μL asetonitril transfer etmesini sağlayın ve peptitlerin ve boncukların bağlanmasını kolaylaştırmak için yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hemen 10 kez karıştırın.
    NOT: P300 pipet aynı anda sadece 300 μL'ye kadar aktarabildiğinden, her aktarım birkaç turda tamamlanır.
  14. Robotun derin kuyu plakasında yukarı ve aşağı pipetleme yaparak tüm örnekleri beş kez karıştırdığından emin olun.
  15. Manyetik modül devreye girene ve numuneler modülde 2 dakika boyunca inkübe edilene kadar bekleyin.
  16. Pipetleme aspirasyonu ve dağıtım hızları varsayılan 150 μL/sn'den 25 μL/s'de yavaşlarken beklemede kalın.
    NOT: Robot, manyetik modül devreye girerken süpernatantı her kuyudan yavaşça çıkarır ve Atık tüpüne atar.
  17. Pipetleme aspirasyonu ve dağıtma hızları varsayılan ayara dönene kadar bekleyin. Manyetik modülün devre dışı olduğunu gözlemleyin.
  18. Robotun programının duraklatıldığını doğrulayın ve şu mesajı görüntüler: ACN tüp kapağının kapalı olduğundan emin olun. Asetonitril tüpün kapağını manuel olarak çözün ve tüp rafı yerine yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın. Robotun her numuneyi yıkamak için 1 mL asetonitril transfer ettiğinden ve hemen 10 kez karıştırdığından emin olun.
  19. Robotun numuneleri yıkamak için tüm örnekleri 10 kez karıştırdığından emin olun.
  20. Manyetik modül çalışırken beklemede kalın ve numuneleri 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  21. Robot pipet aspirasyon hızını yavaş ve yavaşça üsttanı çıkarıp Atık tüpüne dağıtana kadar bekleyin.
  22. Robot, artık asetonitrilin buharlaşmasına izin vermek için manyetik modüldeki örnekleri 60 s kuluçkaya yatırırken gözlemleyin, ardından pipetleme aspirasyon hızlarını varsayılana geri döndürün. Manyetik modülün devre dışı bırakılıp dağdığını gözlemleyin.
  23. Robotun programının duraklatıldıkını doğrulayın ve mesajı görüntüler: Vortex DMSO tekrar ve kapakları açın. 10 sn için % 2 DMSO'yu manuel olarak girdaplayın ve 15 mL-50 mL tüp rafında A1 kuyusuna geri yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın.
  24. Robotun her kuyuya %2 DMSO'luk 80 μL aktardığından ve hemen 10 kez karıştırdığından emin olun.
  25. Robotun ek beş tur için tüm örnekleri 10 kez karıştırdığından emin olun.
  26. Manyetik modül çalışırken beklemede kalın ve numuneleri 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  27. Robot pipet aspirasyon hızını yavaş (25 μL/ s) olarak değiştirirken ve süpernatant'ı yavaşça derin kuyu plakasındaki boş kuyulara aktarırken gözlemleyin.
  28. Robot, numunelerdeki artık boncukları çıkarmak için manyetik modüldeki örnekleri 2 dakika boyunca inkübe edene kadar bekleyin.
  29. Robotun programının duraklatıldığından emin olun ve şu mesajı görüntüler: 2 mL'lik tüp rafı içine yeni 2 mL tüpler yerleştirin ve tüp sayısının toplam numune sayısıyla eşleştiğinden emin olun.
  30. İlk 2 mL mikrosantrifüj tüpünü son BSA sindirim örneğinden hemen sonra kuyuya yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın.
    NOT: Örneğin, bu protokolde test edilen altı BSA sindirme örneği A1, B1, C1, D1, A2 ve B2 kuyularındadır. Bu nedenle, yeni 2.0 mL tüp seti B3, C3, D3, ... vesaire.
  31. Robot, derin kuyu plakasındaki kuyulardan 88 μL numuneyi yeni 2,0 mL tüp setine aktarırken gözlemleyin.
    NOT: Protokoldeki aktarılan hacim (1,1 x 80 μL), numunenin tüm hacminin pipet uçlarına emişli olduğundan emin olmak için optimize edilmiştir.
  32. Robot pipet aspirasyon hızını varsayılan olarak değiştirirken ve manyetik modülü devre dışı bırakarken beklemede kalın.
  33. Temizlenmiş peptitleri bir vakum evaporatörde manuel olarak kurutun ( bkz. Malzeme Tablosu) ve bölüm 5'e geçin veya kurutulmuş numuneleri -20 °C'de saklayın.

4. SP3 paramanyetik boncuklu insan kalbinin protein lösesi (5 mg/mL) ile MS numunesi hazırlama

  1. python komut dosyasını SP3_digestion.py açın ve YALNıZCA BURADA ÖZELLeştİr bölümünde değişkenlerin değerlerini belirtin.
    NOT: Değişkenler arasında numune ve çoğaltma sayısı, numune konsantrasyonu, reaktiflerin hacmi (DTT, IAA, tripsin, boncuklar, %100 ve %80 etanol), DTT ve IAA inkübasyon süresi, P20/P50 ve P300 pipetleri için başlangıç ucu ve manyetik modüldeki derin kuyu plakasında iyi başlangıç.
  2. DTT ve IAA inkübasyonu için tek proteinli sığır serum albümin ile MS numunesi hazırlama için bölüm 2'deki 2.2-2.23 adımlarını izleyin. Bu adımlarda robot destesi kurulumu için Şekil 1'e bakın.
  3. DTT ve IAA kuluçka adımları (adım 2.15 ve 2.19) sırasında protein temizleme için yeni bir SP3 boncuk karışımı (temizleme reaksiyonunda 20 μL boncuk) hazırlayın (adım 3.10'da belirtildiği gibi). Boncukları D6 kuyusuna 2 mL tüp rafı üzerine yerleştirin.
  4. Robotun programının şu mesajla duraklatıldıklarını doğrulayın: Tüp kapaklarını açın. Sıcaklık modülünün üstündeki alüminyum bloktaki numune tüplerinin kapağını manuel olarak çözün ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.
  5. Robotun tüm numuneleri 2,0 mL tüplerden manyetik modülün üstündeki yeni bir derin kuyu plakasına aktardığından emin olun.
  6. Robotun programının duraklatıldığını ve mesajı görüntülediğinden emin olun: Protokole devam etmeden önce hazırlanan boncukların yuva 4'te bulunan 2 mL tüp rafının D6'sına yüklendiğinden emin olun. Boncuk tüp kapağını açın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.
  7. Robot, boncukların beş tur karıştırılması ve numune boncukları karışımının beş tur karıştırılması ile derin kuyu plakasındaki her kuyuya 20 μL boncuk aktarırken gözlemleyin.
  8. Robotun programının duraklatıldığını doğrulayın ve şu mesajı görüntüler: Protokolü sürdürmeden önce yuva 5'te bulunan 15 mL-50 mL tüp rafının A3'üne yüzde 100 etanol yüklendiğinden emin olun. 50 mL konik bir tüpte 10-20 mL%100 etanol (yani 200 prova etanol, bkz. Malzeme Masası) hazırlayın ve rafın A3 kuyusuna yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın.
  9. Robot, plakadaki her kuyuya 140 μL%100 etanol aktarırken, peptitlerin boncuklara bağlanmasını kolaylaştırmak için hemen ardından 10 tur karıştırmayı takip edin.
  10. Robotun her numuneyi, toplam beş tur karıştırma için her turda 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırdığından emin olun.
  11. Manyetik modül devreye girerken beklemede kalın ve modüldeki örnekleri 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  12. Robot pipetleme hızını yavaş (25 μL/s) olarak değiştirirken ve her kuyudan süpernatantı aspire ederken ve Atık tüpüne dağıtırken gözlemleyin.
  13. Robot pipetleme hızını varsayılana döndürüp manyetik modülü devre dışı bırakana kadar bekleyin.
  14. Robotun programının duraklatıldığını doğrulayın ve şu mesajı görüntüler: Protokolü sürdürmeden önce yuva 5'te bulunan 15 mL-50 mL tüp rafının A4'üne yüzde 80 etanol yüklendiğinden emin olun. 4 mL MS sınıfı suyu 16 mL%100 etanol (yani 200 kanıt) ile karıştırarak 20 mL%80 etanol hazırlayın. % 80 etanolünü A4 kuyusuna tüp rafında yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın. Robotun her kuyuya 1 mL%80 etanol aktardığından ve hemen 10 kez karıştırdığından emin olun.
  15. Robot pipetleme hızını yavaş (25 μL/sn) olarak değiştirirken, her kuyudan süpernatantı aspire ederken ve Atık tüpüne dağıtırken gözlemleyin. Robot pipetleme hızını varsayılana döndürüp manyetik modülü devre dışı bırakana kadar bekleyin.
  16. Robotun programı duraklatıldığında ABC çözümünün kapağını açın ve şu mesajı görüntüler: ABC tüpünde kapağı açın. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın. Robot manyetik modülü devre dışı bırakıp her kuyuya 250 μL ABC aktarırken ve hemen 10 kez karıştırırken beklemede kalın.
    NOT: Bu adım, örnekleri ABC ile yıkamaktır.
  17. Robotun manyetik modülü devreye sokup modüldeki örnekleri 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırdığından emin olun.
  18. Robot pipetleme hızını yavaş (25 μL/s) olarak değiştirirken gözlemleyin ve süpernatantı her kuyudan Atık tüpüne aktarın. Robot her kuyuya 100 μL ABC tamponu aktarana ve hemen 10 kez karışana kadar bekleyin.
  19. Robotun programının duraklatıldığını doğrulayın ve şu mesajı görüntüler: Protokol devam etmeden önce yeni toplama tüplerinin 2,0 mL alüminyum bloğa yerleştirildiklerinden emin olun. Başlangıçta bloktaki son numune tüpünden hemen sonra alüminyum bloğa yeni bir düşük protein tutma mikrosantrifüj tüpü seti yerleştirin. Devam etmek için Devam Et'i tıklatın. Robot, ABC tamponundaki her numuneyi yeni 2,0 mL tüplere aktarırken beklemede kalın.
    NOT: Kuyuları inceleyin ve gerekirse kalan numuneleri tüplere manuel olarak aktarın.
  20. MS sınıfı suda 20 μg MS sınıfı tripsin çözerek uygun miktarda MS sınıfı tripsin (numune başına 10 μL) hazırlayın. robotun programı duraklatılır ve şu mesajı görüntüler: Trypsin'in (0,2 μg/μL) devam protokolünden önce yuva 4'te bulunan 2 mL'lik tüp rafının C6'sına yüklendiğinden emin olun. Robotun her numune tüpüne 10 μL tripsin aktardığından ve ardından beş tur karıştırma yaptığından emin olun.
  21. Numune tüp kapaklarını parafin filmi ile sarın, tüm numuneleri sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya aktarın ve 1.000 rpm sallama ile 16-20 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Gece kuluçka sırasında boncukların yağışını en aza indirmek için sindirimin 1.000 rpm sallama ile gerçekleştirilmesi önerilir.

5. SP3 paramanyetik boncuklar kullanılarak peptit temizliği

  1. SP3 paramanyetik boncuklar kullanarak peptit temizleme adımı 2'deki adım adım yönergeleri izleyin.

6. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi

  1. MS suyunda 1 mL LC-MS sınıfı %99 formik asit ekleyerek toplam 1 L hacme bsa (adım 2-3) ve kalp lisat (adım 4) peptitlerini %0,1 formik asitte yeniden uygulayın.
    DİkKAT: Formik asit güçlü bir asittir. Gözlere, cilde ve solunum sistemine oldukça aşındırıcıdır. KKD giyen kimyasal bir başlık altında özenle ele alın.
  2. Nicel peptit test kiti17 kullanarak sindirim sonrası peptit konsantrasyonunun ölçülmesini ve LC-MS/MS analizi için 0,5 μg BSA sindirimi ve 1,5 μg kalp sindirimi enjekte edin.
  3. LC-MS/MS analizi için sıvı kromatografi programını ayarlayın.
    NOT: Tipik bir kurulumda peptit sindirmeleri, Ek Dosya 2'de sağlanan parametreler kullanılarak ters fazlı bir C18 sütununa (3 μm parçacık; 100 şgözenek; 75 μm x 150 mm; bkz. Malzeme Tablosu) yüklenebilir.
  4. Ek Dosya 3'te sağlanan parametreleri kullanarak bir kütle spektrometresi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak av tüfeği proteomik verilerini elde edin.
  5. Protein veritabanında protein tanımlaması için arama yapın.
    1. Gerekli yazılımı indirip yükleyin, MaxQuant.
      NOT: MaxQuant yazılımı (v.1.6.10.43) aşağıdaki adımlar için kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Küratörlüğünü yaptığı insan proteom veritabanını yüksek kaliteli protein dizisi veritabanından (UniProt/SwissProt) indirin (bkz. Malzeme Tablosu). İndir düğmesine tıklayın ve FASTA (kurallı) seçeneğini belirleyin.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, istenirse her genin protein izoformlarını veritabanına dahil etmek için FASTA'yı (kurallı olmayan) indirin.
    3. MaxQuant yazılım arabiriminde, Global Parametreler paneline geçerek protein veritabanı olarak kullanılacak FASTA dosyasını belirtin ve Sıralar sekmesine tıklayın; ardından, FASTA dosyasının dosya yolunu belirtmek için Ekle düğmesini tıklatın.
    4. MaxQuant yazılım arayüzünde, Ham Veri paneline gidip Yükle düğmesine tıklayarak analiz edilecek elde edilen ham kütle spektrum dosyalarını belirtin ve ham dosyaları seçin.
    5. Tablo 1'de gösterildiği gibi arama parametrelerini ayarlayın. Gerekirse etiketsiz niceleleştirmeyi (LFQ) etkinleştirin.
    6. Aramanın tamamlanmasını bekleyin ve /combined/txt klasöründeki MSMS.txt dosyasında FDR%1 eşiklerini geçen peptit spektrumlu eşleşmelerin (PSM) sayısını bulun.
      NOT: Temsili sonuçlar bölümü için burada yapılan karşılaştırmalarda, birden fazla proteinle eşlenen PSM'ler filtrelenmiş ve PSM' ler, peptitler ve proteinlerin sayısını saymak için bir benzersiz proteinle eşlenen PSM'ler korunmuştur (Şekil 4 ve Şekil 5).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada OT-2 robotu ile uyumlu ve tek bir protein standart sığır serum albümin (teknik çoğalır n = 5 sindirim) ve deterjan içeren insan kalbi lysate örneği (n = 5 sindirim) ile kütle spektrometrisi proteomik için örnek hazırlama yapan üç Python betiği sağlanmıştır. Her sindirme ürünü iki peptit temizleme reaksiyonuna bölünür. BSA ve kalp örneklerinin her çalışmasında tanımlanan peptit spektrumlu eşleşmelerin (PSM' ler), peptitlerin ve proteinlerin sayısı Şekil 4 ve Şekil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protokol içinde kritik adımlar
En iyi performans için Opentrons onaylı labware, modüller ve OT-2 ile uyumlu sarf malzemeleri kullanılmalıdır. Opentrons'un Reference14'teki talimatını takiben özel laboratuvar yazılımları oluşturulabilir. OT-2 destesini, pipetleri ve labware'i ilk kez kullanıldığında kalibre ettiğinizden emin olun. Peptit ve protein temizliği için boncuk hazırlamak için SP3 boncuk üreticisinin yönergelerine uymak da önemlidir. Özellikle, boncuk ve peptit bağlama ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çakışma yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen NIH ödülleri F32-HL149191'den YH'ye desteklendi; R00-HL144829'dan EL'e; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278'den MPL'ye. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 web tabanlı bir bilim illüstrasyon aracı yardımıyla oluşturulmuştur, BioRender.com.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
300 ve mikro; L pipet uçlarıOpentrons
4'ü 1 arada tüp raf setiOpentronsHer set 2 taban standı ve 1.5 mL, 2 mL, 15 mL + 50 mL, 15 mL ve 50 mL olmak üzere 4 tüp tutucu üst içerir. Bu çalışmada 2 mL ve 15 mL + 50 mL tops kullanıyoruz.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC KolonuThermo Scientific# 1645683 & mu; m parçacığı; 100 > gözenek; 75 μ m x 150 mm
Asetonitril LC-MS sınıfıVWR#JT9829
Alüminyum blok setiOpentronsBu blok seti, 96 oyuklu, 2.0 mL tüplerle uyumlu 3 üst kısım ve OT-2 sıcaklık modülü ile kullanmak için bir PCR şeridi içerir. Bu yazıda 2.0 mL tüp tutucuyu kullanıyoruz.
Amonyum BikarbonatSigma-Aldrich# A6141
Sığır Serumu Albümin Standardı, 2 mg / mLThermo Scientific# 23210
Dimetilsülfoksit (DMSO) LC-MS sınıfıThermo Scientific# 85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray HPLC SütunlarıThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Etanol Korumalı 195-200Fisher# 04-355-720
Formik Asit LC-MS sınıfıThermo Scientific# 85178
İnsan kalbi lizatıNovus BiologicalsNB820-59217
İyodoasetamidSigma-Aldrich#I1149
Manyetik tüp rafıThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova ve diğerleri, 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini SantrifüjThermo Scientific#75004061hızlı sıkma için tezgah üstü mini santrifüj
NEST 2 mL 96 Kuyulu Derin Kuyu Plakası, V AltOpentrons
OT-2 manyetik modülOpentronsGEN1
OT-2 P300 tek kanallı pipetOpentronsGEN1
OT-2 P50 tek kanallı pipetOpentronsGEN1 OT-2
robot pipetleme robotuOpentronsOT-2
OT-2 sıcaklık modülüOpentronsGEN1
Pierce Kantitatif Kolorimetrik Peptit TestiThermo Scientific# 23275
Protein LoBind tüpleri 2.0 mLEppendorf#022431102
Protein Dizisi VeritabanıUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20İncelendi:Evet
Sera-Mag SpeedBead Karboksilat ile Modifiye Edilmiş Manyetik Parçacıklar, HidrofobikCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Karboksilat ile Modifiye Edilmiş Manyetik Parçacıklar, HidrofilikCytiva# 45152105050250
SpeedVacThermo ScientificVakum evaporatör
Thermo Q Exactive HF Kütle SpektrometresiThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Tripsin MS SınıfıThermo Scientific# 90057
Su LC-MS sınıfıVWR#BDH83645.400

Kaynaklar

  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
  3. Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
  4. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  5. Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
  6. Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
  7. Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
  8. van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
  9. Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).
  10. Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  11. Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
  12. Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Numune HazırlamaLab OtomasyonuAçık Kaynaklı RobotProtein SindirimiKütle SpektrometrisiSıvı Aktarım SistemiPython Otomasyon BetikleriProtein RedüksiyonuPeptid Temizleme
Açık Kaynaklı Bir Laboratuvar Robotu Tarafından Otomatikleştirilmiş Av Tüfeği Proteomik Numune İşleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.