Method Article

Nöral Kök Hücre Aktivasyon Durumunun İn Vitro Otofloresan Kullanılarak Sınıflandırılması

DOI:

10.3791/63110

⸱

April 12th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, i) konfokal bir mikroskop, ii) yoğunluk görüntülemesi yapmak için bir floresan aktive hücre sıralayıcısı veya iii) floresan ömür boyu görüntüleme gerçekleştirmek için bir çoklu foton mikroskobu kullanarak otofloresan görüntüleme yoluyla birincil yetişkin fare nöral kök hücre kültürlerinde hücre durumunu tanımlama ve zenginleştirme stratejilerini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral kök hücreler (NSC'ler), yetişkin nörojenezi adı verilen bir süreçle yetişkin beyninde yeni doğan nöronlarını böler ve üretir. Yetişkin NSC'ler öncelikle hareketsizdir, hücre döngüsünden (G0) çıktıkları, ancak çevreye duyarlı kaldıkları geri dönüşümlü bir hücre durumudur. Erişkin nörojenezinin ilk adımında, hareketsiz NSC'ler (qNSC'ler) bir sinyal alır ve aktive olur, sessizlikten çıkar ve hücre döngüsüne yeniden girer. Bu nedenle, NSC sessizlik ve sessizlik çıkışının düzenleyicilerini anlamak, yetişkin nörojenezini hedefleyen gelecekteki stratejiler için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, MGK'nın sessizliğine ilişkin anlayışımız, hareketsiz NSC'leri (qNSC'ler) ve aktif NSC'leri (aNSC'ler) tanımlamadaki teknik kısıtlamalarla sınırlıdır. Bu protokol, NSC otofloresansını görüntüleyerek in vitro kültürlerde üretilen qNSC'leri ve aNSC'leri tanımlamak ve zenginleştirmek için yeni bir yaklaşımı açıklamaktadır. İlk olarak, bu protokol, otofloresan yoğunluğunu kullanarak NSC aktivasyon durumunu sınıflandırmak için qNSC'lerin ve aNSC'lerin otofloresan belirteçlerini tanımlamak için bir konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağını açıklar. İkinci olarak, bu protokol, NSC aktivasyon durumunu sınıflandırmak ve otofloresan yoğunluğunu kullanarak qNSC'ler veya aNSC'ler için örnekleri zenginleştirmek için bir floresanla aktive edilmiş hücre sıralayıcısının (FACS) nasıl kullanılacağını açıklar. Üçüncüsü, bu protokol, tek hücre çözünürlüğünde floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) gerçekleştirmek, NSC aktivasyon durumunu sınıflandırmak ve hem otofloresan yoğunluklarını hem de floresan ömürlerini kullanarak hareketsiz çıkışın dinamiklerini izlemek için bir çoklu foton mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu nedenle, bu protokol, NSC sessizliğini ve sessizlik çıkışını incelemek için canlı hücreli, etiketsiz, tek hücreli çözünürlüklü bir araç seti sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSC'ler, yetişkin nörogenezi 1,2 olarak adlandırılan bir süreçte birçok organizmada yaşam boyunca yenidoğan nöronları oluşturur. Yenidoğan nöronları üretmek için, bir qNSC'nin önce aktive olması, popülasyonu genişletmek ve nöral progenitörler üretmek için hücre döngüsüne girmesi gerekir 3,4,5,6. NSC sessizliği hakkında çok şey bilinmesine rağmen, NSC sessizliğinin itici güçlerini ve düzenleyicilerini tam olarak tanımlama yeteneğimiz, qNSC'leri ve bunların aktivasyona geçişini izole etmek ve tanımlamak için var olan teknik sınırlamalar tarafından kısıtlanmaktadır. Otofloresan görüntüleme, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NAD(P)H) ve flavin adenin dinükleotid (FAD) gibi otofloresan metabolik kofaktörlerin optik özelliklerini etkileyen metabolik yeniden şekillenmeyi çözerek, mikroglia ve T hücreleri gibi birçok farklı hücre tipinde hücre durumundaki değişiklikleri incelemede daha önce başarılı olmuştur7,8. NSC'ler, 9,10,11,12,13,14 sessizlik çıkışından geçerken metabolik ağlarını büyük ölçüde yeniden şekillendirir. Bu nedenle, bu farklılıklardan yararlanmak için, NSC otofloresansı, NSC'ler sessizlikten çıkarken meydana gelen metabolik yeniden şekillenmeye atfedilen otofloresanstaki kaymaları tespit ederek NSC aktivasyon durumunu tanımlamak ve zenginleştirmek için yakın zamanda kullanıldı15. Otofloresan görüntüleme çeşitli teknik avantajlar sağlar: i) hücre davranışını etkileyebilecek dışsal etiketlerin eklenmesini gerektirmez; ii) NSC aktivasyon durumu hakkında yüksek çözünürlüklü tek hücreli veriler sağlayabilir; ve iii) 7,16 hücresinin yok edilmesini gerektirmez. Bu protokol, NSC hareketsiz ve aktive hücre durumlarını incelemek için NSC otofloresansından yararlanmak için üç stratejiyi ana hatlarıyla belirtir15.

Son zamanlarda, hipokampusun subgranüler bölgesinden 6 haftalık erkek farelerden izole edilen, kültürlenen ve geri dönüşümlü olarak sessizliğe sokulan NSC'lerin in vitro 10,13,17,18,19,20,21, 400-600 nm arasında uyarılan ve 500-700 nm arasında yayılan yüksek punktat otofloresan (PAF) seviyeleri sergilediği bulundu. Bu sinyal, etkinleştirilmiş, döngüsel NSC'lere kıyasla qNSC'lereözgüydü 15. Ek antikor belirteçleri veya raporlayıcılar kullanmadan bu iki popülasyonu görsel olarak ayırma yeteneği, qNSC'lerin doğası ve sessizlik çıkışları hakkında birçok deneysel soru için yararlıdır. Bu nedenle, ilk olarak, bu protokol, NSC aktivasyon durumunu tanımlamak için kullanılabilecek bir konfokal mikroskop kullanarak qNSC'lerde PAF'ı görüntüleme stratejilerini açıklar. İkinci olarak, bu protokol, floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS) kullanarak PAF'ı tespit etme stratejilerini açıklar ve ayrıca qNSC'leri veya aNSC'leri zenginleştirmek için bu sinyale dayalı olarak nasıl sıralama yapılacağını açıklar. Bu stratejiler, NSC'leri hücre durumuna göre kümelemek ve ayırmak için kullanılabilecek bir ölçü sağlar.

NSC'leri yalnızca farklı durumlarda değil, aynı zamanda sessizlik çıkışından tam aktivasyona geçerken de ayırmak için daha yüksek çözünürlüklü bir yöntem geliştirmek için, NAD (P) H (Kanal 1 olarak adlandırılır) otofloresan ve yeşil otofloresan (Kanal 2 olarak adlandırılır; qNSC'lerde hem FAD otofloresan hem de PAF'ı tespit eder) ömürlerini yoğunluklarıyla birlikte görüntülemek için bir çoklu foton mikroskobu kullanılarak floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, hücredeki moleküllerin optik özelliklerinin fiziksel özelliklerine bağlı olduğu gerçeğinden yararlanır16,22. Örneğin, NAD(P) (NAD ve NADP optik olarak ayırt edilemez ve bu nedenle NAD(P) her iki türe de atıfta bulunmak için kullanılır) oksitlenmiş halde otofloresan değildir, ancak indirgenmiş durumda otofloresandır (NAD(P)H)23. Ayrıca, otofloresan moleküllerinin enzimlere bağlanma durumları gibi ek fiziksel özellikleri, floresan ömür boyu görüntüleme 7,22,24 gerçekleştirilerek tahmin edilebilir. Örneğin, NAD(P)H, bir enzim22'ye bağlı olmadığında daha kısa bir floresan ömrüne sahiptir. Yüzlerce metabolik reaksiyonda yer alan NAD(P)H gibi otofloresan moleküller, farklı durumlar veya hücre davranışları yoluyla ilerleyen hücreler tarafından farklı şekilde kullanıldığından, bu kaymalar, otofloresan ömrünü tespit eden bir çoklu foton mikroskobu kullanılarak tespit edilebilir ve ölçülebilir23. Otofloresansın bolluğu veya yoğunluğu ile birlikte, bu ölçümler NSC'leri bir hücre durumuna veya diğerine ve durumlar arasındaki dinamik geçişler yoluyla ayırmak için çok boyutlu bilgi sağlar. Üçüncüsü, bu protokol, bir çoklu foton mikroskobu kullanarak Kanal 1 (NAD(P)H) ve Kanal 2 (PAF) sinyallerinin FLIM ve yoğunluk ölçümlerinin gerçekleştirilmesini, analiz edilmesini ve yorumlanmasını açıklar. Özetle, bu protokol, NSC durumu hakkında yüksek çözünürlüklü tek hücreli veriler sağlayan NSC sessizliğini incelemek için canlı hücreli, etiketsiz bir araç setini tanımlar.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki tüm prosedürler Wisconsin-Madison Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. NSC hücre durumunu tanımlamak için qNSC'lerde ve aNSC'lerde PAF'ı görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanma

  1. Birincil NSC kültürlerinden in vitro olarak qNSC'ler ve aNSC'ler oluşturun.
    1. Kültür NSC'leri, genişleme için proliferatif bir ortamda yetişkin fare beyinlerinden saflaştırılmıştır (Tablo 1)18,20,21. Bu nedenle, varsayılan olarak, in vitro NSC kültürleri aNSC'lerdir.
    2. qNSC'ler oluşturmak için, aNSC'leri kaplanmış cam eşyalara plakalamak için aşağıdaki protokolü kullanın ve ardından 3 gün boyunca sessizliği sağlamak için bunları qNSC ortamı ile işlemden geçirin.
    3. Önce tabağın tabanını kaplayacak kadar poli-L-ornitin (PLO; plastik için suda 10 mg/mL, cam için suda 50 mg/mL) solüsyonu ile kaplayarak (1cm2'lik bir görüntüleme küveti kuyusu için ~ 150 μL kullanın) ddH2O'da 37 ° C'de 1 saat boyunca NSC'leri yapıştırmak için yağa daldırma hedeflerine uygun bir kırılma indisine sahip cam eşyalar hazırlayın.
    4. PLO solüsyonunu çıkarın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkayın.
    5. PBS'de tabağın tabanını kaplayacak kadar laminin solüsyonu (5 mg / mL) ile kaplayın (1cm2'lik bir görüntüleme küveti kuyusu için ~ 150 μL kullanın) ve 37 ° C'de en az 3 saat veya gece boyunca inkübe edin.
    6. Laminin çözeltisini çıkarın, ardından tabağın tabanını kaplayacak kadar bir kültür ortamı ekleyin (1cm2'lik bir görüntüleme küveti kuyusu için ~ 150 μL kullanın).
    7. Oda sıcaklığında (RT, ~ 25 ° C) 4 dakika boyunca 120 x g'da aNSC'leri (tek tabakalar veya nöroküreler olarak başlayabilirler) santrifüjleyerek hücreleri tripsinizasyon için hazırlayın.
    8. Önceki adımdan peletlenmiş aNSC'leri 100 μL tripsin karışımında 37 ° C'de 5 dakika boyunca tripnize edin ve ardından tripsintasyonu 200 μL tripsin inhibitörü karışımı ile söndürün (Tablo 1).
    9. NSC'lerin 2 dakika oturmasına izin verin, ardından 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak ezin.
    10. 5 mL aNSC ortamı ekleyin ve hücreleri 4 dakika boyunca 120 x g'da döndürün.
    11. NSC'leri 1 mL aNSC ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri aNSC ortamında% 10 -% 20 birleşme noktasında plakalayın. Örneğin, ~ 5.000 hücreyi, 150 μL ortam ile 1 cm2'lik bir görüntüleme küvetinin bir kuyusuna yerleştirin.
    12. aNSC'lerin çanağın yüzeyine yapışması için 24 saat bekledikten sonra, aNSC ortamını çıkarın ve çanağın tabanını kaplayacak kadar qNSC ortamıyla değiştirin (1cm2'lik bir görüntüleme küveti kuyusu için ~150 μL kullanın; Tablo 1- daha önce tarif edildiği gibi 10,13,17,18) sükûnetin indükleneceği kuyularda.
    13. aNSC ve qNSC ortamını en az 2 günde bir değiştirin. QNSC ortamında 3 gün sonra, NSC'ler hareketsizdir ve görüntüleme deneyleri için kullanılabilir.
  2. Canlı qNSC'leri ve aNSC'leri in vitro olarak görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanın.
    NOT: Her mikroskobun kendi özel yazılımı vardır; Bu nedenle, belirli bir mikroskobu yapılandırmak için benzer eylemler gerçekleştirerek bu adımları izleyin. Bu protokol, NIS-Elements'te çalışmak için talimatlar sağlayacaktır.
    1. Otofloresan görüntüleme için konfokal mikroskobu yapılandırın.
      1. 405 Laser'e tıklayın ve 405 Laser menüsündeki emisyon penceresine yazın. İletilen bir ışık görüntüsünü toplamak için TD'ye tıklayın ve örneği görselleştirmek için HV değerini ayarlayın.
      2. Lazer gücünü %3.5'e ve kazancı 75'e ayarlayın. Yakınlaştırma'yı 2 olarak ayarlayın. Konfokal tarama parametrelerini ayarlayın, Piksel Duraklama'yı 0,5'e ayarlayın ve Çözünürlüğü 2048 x 2048 piksel olarak ayarlayın.
    2. Odaklamak için parlak alan kullanarak hücreleri ~ 60x yağa daldırma objektif lensi altına odaklayın.
    3. Göz Bağlantı Noktası'na tıklayarak konfokal tarama moduna geçin, böylece ışık yolunun artık tarama kafasına gittiğinden ve ışık yolunda filtre küpü olmadığından emin olun.
    4. PAF, qNSC'lerde zenginleştirilmiştir ve geniş ölçüde uyarılabilir ve yayılabilirdir (bkz. Şekil 1). Şekil 1'i kılavuz olarak kullanarak sistemin özelliklerine göre en iyi optik yapılandırmayı seçin. En güçlü ve en temiz sinyal için ~400-500 nm arasında bir lazerle uyarın, ~580-620 nm toplayın ve ~60x yağa daldırma objektif lensi kullanın.
      NOT: Otofloresan görüntüleme, uyarmak için tipik görüntüleme deneylerinin gerektirdiğinden daha yüksek lazer güçleri gerektirir. Diğer otofloresan molekülleri veya diğer etiketleri PAF ile birlikte görüntülüyorsanız, otofloresan kanallarına sızmayı önlemek için optik konfigürasyonu dikkatli bir şekilde tasarlayın.
    5. qNSC'lerde ve aNSC'lerde otofloresan görüntüleri elde edin. Tara'yı tıklatın, sonra görüntüye odaklanın ve ardından Yakala'yı tıklatın. En iyi görüntüler için, her hücrenin temsili bir kesitini elde etmek için odakta hücrelerin sitoplazması (hücre boyunca yaygın olarak yayılmış dimmer otofloresansına dayalı) ile tek düzlemli görüntüler toplayın.
    6. Farklı görüntüleri doğrudan karşılaştırmayı hedefliyorsanız, aynı gün aynı optik konfigürasyonu (örn. aynı lazer gücü) ve görüntü örneklerini kullanın.
    7. Lazer ve dedektörün tam güçleri, her bir sisteme bağlı olacaktır. Düşük lazer güçleri kullanarak başlayın ve ardından sinyal doygunluğa ulaşmadan algılanabilir hale gelene kadar güçleri yavaşça artırın.
  3. PAF'ı canlı qNSC'lerde ve aNSC'lerde in vitro olarak analiz edin.
    1. qNSC'lerde veya aNSC'lerde otofloresan görüntüleri aldıktan sonra, ImageJ25'te bir dosya açarak görüntüleri ölçün.
    2. Düzensiz pikselleri yumuşatmak için qNSC/aNSC otofloresan görüntüsünde Gauss Bulanıklığı > Filtreleri İşlem > (Sigma: 2) seçeneğini kullanın.
    3. PAF'ı temsil >eden pikselleri seçmek için Görüntü > Eşiği Ayarla'yı kullanın (arka plan piksellerini ortadan kaldırın) ve Uygula'ya tıklayın. Doğrudan karşılaştırılacak tüm görüntüler için aynı eşikleme parametrelerini kullanın.
    4. PAF'ları yakın uzamsal yakınlıkta ayırmak için Process > Binary > Watershed'i kullanın.
    5. Bilgisayar faresini kullanarak, bir parlak alan görüntüsüne bakarak veya hücrenin sitoplazması boyunca eşit olarak bulunan yaygın otofloresansa bakarak belirlendiği gibi, bir hücrenin etrafına bir ilgi bölgesi (ROI) çizin.
      NOT: Otofloresan tipik olarak bu konumlarda bulunmadığından ve bu nedenle analizi bozmadığından, ince periferik süreçleri dışlamak ve çekirdeği dahil etmek genellikle iyidir.
    6. Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et (Boyut: 0.1-sonsuz μm; Dairesellik: 0-1) özet işaretli olarak.
      NOT: ImageJ daha sonra ilgili bölgedeki parçacıklar hakkında veri içeren bir çıktı penceresi üretecek ve bu da her hücredeki PAF sayısının tablolanmasına izin verecektir. Diğer floresan moleküller görüntüleme PAF'ı ile eşleştirilebilir. Bununla birlikte, PAF nispeten loş bir sinyal olduğundan, diğer floroforların PAF kanalına sızmadığını doğrulamak önemlidir. Tipik olarak, 600+ nm emen ve 650+ nm yayan floroforlar, LipidSpot 610 gibi görüntüleme PAF'ı ile eşleştirilebilir.

2. Otofloresan dayalı kültürlenmiş NSC'lerde NSC aktivasyon durumunu zenginleştirmek için FACS'ın kullanılması

  1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi qNSC'leri ve aNSC'leri oluşturun.
  2. Otofloresansa dayalı olarak canlı qNSC'lerin ve aNSC'lerin bir karışımını sıralayın.
    NOT: Örnek olarak, bu protokol, qNSC'lerin ve aNSC'lerin 1:1 oranında karıştırılmasıyla oluşturulan bir örnekte aNSC'lerin veya qNSC'lerin nasıl zenginleştirileceğini tartışacaktır.
    1. Tripsinizasyon ve hücre sınıflandırmasından önce, 10 μM 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU; hücre döngüsünün S-fazında olduğu gibi DNA sentezleyen hücrelere dahil olan bir timidin analoğu) ekleyerek S fazı boyunca ilerleyen hücreleri etiketleyin 1 saat boyunca hücre kültürü ortamına.
    2. Adım 1.1.8'de tartışıldığı gibi qNSC'leri ve aNSC'leri tripsinize edin, 0.5 mL FACS tamponunda (Tablo 1) yeniden süspanse edin ve ardından buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: qNSC'ler tabağa güçlü bir şekilde yapışır. Nispeten daha yüksek birleşmede, qNSC'ler çanaktan mekanik olarak ayrılabilir. Bununla birlikte, qNSC'ler nispeten daha düşük bir birleşim noktasındaysa veya pipetleme yoluyla tabaktan mekanik olarak çıkarılması zorsa, bunları tabaktan çıkarmak için tripsin kullanın.
      1. Kültür ortamını qNSC'lerden çıkarın ve tabağın tabanını kaplayacak kadar% 0.25 tripsin ekleyin (1 cm2 görüntüleme küveti kuyusu için ~ 150 μL kullanın), 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
      2. İnkübasyonun ardından, eklenen tripsin hacmine eşit her hücre tipine karşılık gelen ortamı ekleyerek tripsin reaksiyonunu söndürün. Toplama ve santrifüjlemeden önce hücreleri çanaktan mekanik olarak ayırın.
    3. ~130 μm'lik bir nozul kullanarak, cihazın yeteneklerine dayalı olarak optik koşullara sahip bir akış sitometresi veya FACS kullanarak qNSC'leri ve aNSC'leri analiz edin ve Şekil 1'de gösterildiği gibi PAF'yi tespit edin. Örneğin, numuneyi uyarmak için 405 nm'lik bir lazer kullanın ve algılama için 580-620 nm'lik bir filtre kullanın.
    4. Bir veri dosyasında en az 10.000 tekil qNSC ve aNSC toplayın ve ardından bunları qNSC'lerin veya aNSC'lerin zenginleştirmesini toplamak için geçitler tasarlamak için kullanın. Örneğin, aNSC:qNSC (1:1) karışık numunedeki otofloresan yoğunluğuna dayalı olarak NSC'lerin en üstteki %25'ini veya en alttaki %25'ini toplamak için kapıları ayarlayın.
    5. Yukarıda açıklandığı gibi daha parlak veya daha kısık otofloresan ile singlelet'leri sıralamak için kapıları ayarladıktan sonra, hücreleri aNSC ortamıyla doldurulmuş PLO-, laminin kaplı oyuklara ayırın (10.000 hücre /cm2, bkz. adım 1.1.3).
    6. FACS'ı takiben, NSC'lerin inkübatörde 3 saat oturmasına izin verin. Hücreleri, RT'de 15 dakika boyunca tabağın altını kaplamaya yetecek kadar %4 paraformaldehit ile (1cm2'lik bir görüntüleme küveti kuyusu için ~ 150 μL kullanın) işleyerek sabitleyin.
      NOT: EdU'yu hücrelerde görselleştirmek için, EdU'yu tespit etmek için ticari bir kit edinmek ve üreticinin önerdiği protokolü takip etmek en kolay yoldur.
    7. İlk olarak, RT'de 15 dakika boyunca PBS'de% 0.25 triton ile muamele ederek hücrelere geçirgen hale getirin.
    8. Daha sonra, hücreleri 30 dakika boyunca RT'de bir EdU boyama solüsyonu ile tedavi edin.
      NOT: EdU boyama çözeltisinin kesin bileşimi, reaktiflerin kaynağına bağlı olarak değişecektir, ancak kabaca bir reaksiyon tamponu, bir reaksiyon tamponu katkı maddesi, bakır sülfat ve bir alkin veya azid ile modifiye edilmiş molekülden oluşur. Önerilen bir kit için Malzeme Tablosuna bakın.
    9. EdU'yu görselleştirmek için boyamanın ardından, numuneleri PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.

3. Kanal 1 ve Kanal 2 otofloresansını tespit etmek için bir çoklu foton mikroskobu kullanma ve NSC hücre durumu popülasyonlarını ve geçişlerini tanımlamak için in vitro olarak NSC'ler üzerinde FLIM gerçekleştirme

NOT: Her mikroskobun kendi özel yazılımı vardır; Bu nedenle, belirli bir mikroskobu yapılandırmak için benzer eylemler gerçekleştirerek bu adımları izleyin. Bu protokol, Prairie View'da çalışmak için talimatlar sağlayacaktır.

  1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi qNSC'leri ve aNSC'leri oluşturun.
  2. Floresan ömür boyu görüntüleme için çoklu foton mikroskobunu ayarlayın.
    1. 40x veya daha yüksek büyütme oranına (~1.15 NA) sahip bir objektif lens kullanın.
    2. Aşağıdaki veya eşdeğer bileşenlere sahip bir çoklu foton mikroskobu kullanın: ayarlanabilir bir ultra hızlı lazer, 720 nm uzun geçişli bir dikroik, bir galyum arsenit fosfit (GaAsP) fotoçoğaltıcı tüp (PMT), zamanla ilişkili tek foton sayma elektroniği ve bir analog güç ölçer.
    3. Kanal 1'i görüntülemek için ayarlanabilir lazeri 750 nm'ye ayarlayın ve 440/80 nm emisyon filtresi küpü kullanın. Kanal 2'yi görüntülemek için lazeri 890 nm'ye ayarlayın ve 550/100 nm emisyon filtre küpü kullanın.
      NOT: PMT'ler açılmadan önce oda ışıklarını kapatın.
  3. Enstrüman tepki fonksiyonu
    1. Ölçülen bozunmada cihazın zamansal tepkisini hesaba katmak için ezilmiş bir Üre kristalini görüntüleyerek bir cihaz yanıt fonksiyonu (IRF) yakalayın.
      NOT: IRF, bozunma uyum eğrisini doğru bir şekilde hesaplamak için bozunma ile birleştirilir. Alım için lazer 890 nm'ye ayarlanır ve 440/80 nm emisyon filtre küpü kullanılır. GaAsP PMT 800'lük bir kazanca ayarlanmıştır ve pockels (lazer gücü) başlangıçta çok düşük, genellikle 1 olarak ayarlanmıştır.
    2. Kristal Üre ile bir görüş alanı seçin ve pockelleri hafifçe artırın (maksimum 15'e kadar).
    3. Ardından, hücre görüntüleme için kullanılan parametrelerin aynısını kullanarak bir görüntü elde edin: sabit kesir ayrımcısı (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, 256 x 256 çözünürlük, 4,8 μs'ye ayarlanmış bekleme süresi, 1,5x'e ayarlanmış optik yakınlaştırma ve 60 sn entegrasyon süresi.
  4. Canlı qNSC'lerde ve aNSC'lerde in vitro olarak Kanal 1 ve Kanal 2 otofloresan için floresan ömrü görüntüleme ve yoğunluk görüntüleme gerçekleştirin
    1. Görüntülemek için bir görüş alanı bulun: Uygun bir görüş alanı bulmak için oküler kullanın ve görüntülemeyi etkinleştirmek için mikroskoptaki örneğe giden ışık yolunu değiştirin.
      NOT: Önce bir Kanal 1 görüntüsü alınır, ardından aynı görüş alanına sahip bir Kanal 2 görüntüsü alınır.
    2. Kanal 1 görüntüsünün toplanması için kurulum: Güç/Kazanç sekmesine tıklayın ve PMT'deki kazancı 800 olarak ayarlayın, 2-P Lazer sekmesine tıklayın ve lazer için 750 nm'yi seçin ve uygun filtre küpünün kullanıldığından emin olun (440/80 nm).
    3. Kanal 1 görüntüsünü toplayın.
      1. Güç/Kazanç sekmesine gidip Pockels'i 30'a ayarlayarak, ardından bu ekranın Tarama bölümüne gidip Canlı Tarama'ya tıklayarak Önizleme modunu başlatın.
      2. Düşük lazer gücünde (3,6 mW'ın altında) iyi bir görüş alanı bulmak için Pockel'leri artırın. Görüş alanı bulunduğunda, Pockels'i , güç ölçer pockel hücresinden sonraki güçte ~3,6 mW okuyacak ve Sayım Oranları sekmesindeki sabit kesir ayrımcısı (CFD) 1 x 104 - 1 x 105 ölçecek şekilde ayarlayın.
    4. Tarama bölümüne gidin ve tıklayın Tek Tarama bu parametreler karşılandığında. Bu, 60 saniyenin üzerinde bir Kanal 1 görüntüsü elde edecektir.
    5. Bir Kanal 2 görüntüsü toplamak için 2-P Lazer sekmesine tıklayın ve lazer için 890 nm'yi seçin, filtre küpünü Kanal 2 emisyon küpüyle (550/100 nm) değiştirin.
    6. Önizleme modunu 3.4.3'te açıklandığı gibi başlatın, güç ölçer ~7 mW okuyana kadar Pockels'i artırın ve CFD sayıları bir kez daha 1 x 104 -1 x 105 olur.
    7. Tarama bölümüne gidin ve bu parametreler karşılandığında Tek Tarama'ya tıklayın. Bu, 2 saniyenin üzerinde bir Kanal 60 görüntüsü elde edecektir.
    8. Daha fazla görüntü elde edin - Bir Kanal 1 ve Kanal 2 görüntüsü aldıktan sonra yeni bir görüş alanı bulun ve 3.4.2 - 3.4.4 adımlarını tekrarlayın. Tipik olarak, ~50-100 hücreyi görüntülemek için 4-6 görüş alanı toplamak, bir deneydeki bir koşul için yeterlidir.
      NOT: mCherry, Kanal 1 ve Kanal 2 kanallarına taşma payı olmadan ek bir floresan etiket olarak kullanılabilir.
  5. Floresan kullanım ömrü görüntülerini analiz edin.
    1. 3.5.2-3.1.14 adımlarını izleyerek SPCImage'de floresan ömrü görüntüleri için bozunma matrisleri oluşturun.
      NOT: Daha fazla bilgi için, çevrimiçi olarak ücretsiz olarak sunulan güncellenmiş el kitaplarına bakın26.
    2. SPCImage'i açın ve bölüm 3.3'te toplanan IRF FLIM görüntüsünü açın.
    3. Histogramdaki dikey siyah çubukları IRF bozulma eğrisiyle sınırlı olacak şekilde ayarlayın. Üst menü çubuğundan IRF'ye tıklayın > Panoya Kopyala'ya tıklayın.
    4. Analiz edilecek veri seti içinde, bölüm 3.4'te elde edilen bir FLIM görüntü dosyası açın.
    5. Üst menü çubuğundan IRF'ye tıklayın > Panodan Yapıştır'a tıklayın.
    6. Yazılımın sağ alt kısmında, Bileşenler'i 2 olarak ayarlayın.
    7. Yazılımın üst menü çubuğunda, Seçenekler > Model'e tıklayın. Ardından Sığdırma Yöntemi, Kareye Uzamsal Gruplama, Eşikten Tepeye için MLE'yi seçin ve Ayarlar'ın altında Çok Üstel Bozunma'yı seçin.
    8. Yazılımın sol alt kısmında, uyarmadan hemen sonra foton sayısının zirvesindeki temsili sitoplazmik piksellerde foton sayısı en az 100 olana kadar Bin değerini artırın.
    9. Yazılımın sol alt kısmında, Eşik'i ayarlayın. Kanal 1 için "50" eşiğini kullanın. Kanal 2 için "0" eşiğini kullanın.
    10. Yazılımın üst menü çubuğunda (bu protokol sürüm 8.3'ün nasıl çalıştırılacağını açıklar), Bozunma Matrisi > Hesapla'ya tıklayın.
      NOT: Chi2 değerlerinin görüntü boyunca ~0.8-1.2 olduğundan emin olun. Bu, iki üstel bozunma modellemesini doğrulayarak verilerin sağlam olacağını doğrular.
    11. Üst menü çubuğunda, Dosya > Kaydet'e tıklayın.
    12. Yazılımın üst menü çubuğunda, Dosya > Dışa Aktar'a tıklayın ve aşağıdakileri dışa aktarın:
      Renk Kodlu Değer, T1, T2, Chi2, Piksel Yoğunlukları, A1[%], A2[%] ve Renk Kodlu Görüntü (Gösterge ile)
      NOT: Artık SPCImage, belirli bir kanalın tüm görüntülerini analiz ederek bir toplu işlem yapmak üzere ayarlanmıştır (Kanal 1 FLIM görüntülerini birlikte analiz edin ve ardından Kanal 2 FLIM görüntüleri için 3.5.2 adımından başlayarak tekrarlayın).
    13. Toplu işlem gerçekleştirmek için Hesapla > Toplu İşleme'ye tıklayın ve işlenecek FLIM görüntülerini seçin.
    14. Üst menü çubuğunda, Dosya > Dışa Aktar > Toplu Dışa Aktarma'ya tıklayın ve dışa aktarılacak bozunma matrislerini seçin (önceki adımda oluşturulan).
    15. 3.5.16-3.5.24 adımlarını izleyerek sitoplazmik maskeler oluşturmak için CellProfiler'ı kullanın.
      NOT: Bunu yapmak için, çekirdekler, çekirdeğin siyah olduğu ve açıkça görülebildiği Kanal 1 yoğunluk görüntülerinin etrafında manuel olarak olacaktır. Daha sonra bir CellProfiler boru hattı manual_segmentation.cpproj27 (Ek Dosya 1), nükleer maske tarafından yönlendirildiği gibi otomatik olarak bir tam hücre ve sitoplazmik maske üretecektir. Çekirdekler alternatif olarak mCherry ile etiketlenebilir ve çekirdeklerin tanımlanmasını otomatikleştirme kapasitesi sağlamak için Kanal 1 ve Kanal 2 otofloresan ile birlikte görüntülenebilir. Bununla birlikte, birçok geleneksel nükleer boya, otofloresan kanallarına spektral olarak sızar ve bu nedenle bu teknikle uyumsuzdur.
    16. R Studio'da, X_photons.asc dosyalarını dönüştürmek için R_ASCtoTIFF.rmd27'yi (Ek Dosya 2) kullanın, burada X, Kanal 1 görüntüsünden TIF dosyalarına ayarlanan görüntünün adıdır.
    17. Hücre Profili Oluşturucu'yu açın ve manual_segmentation.cpproj dosyasını açın.
    18. İşlem hattının üst kısmındaki Görüntüler adımında adım 3.5.16'da oluşturulan Kanal 1 foton TIF'lerini yükleyin.
    19. SaveImages adlı işlem hattının alttaki 3 adımında, CellProfiler'ın oluşturacağı maskeler için bir kaydetme yolu ayarlayın.
    20. CellProfiler'ın sol alt kısmındaki Test Modunu Başlat'a tıklayın.
    21. CellProfiler'ın sol alt kısmındaki Çalıştır'a tıklayın. CellProfiler IdentifyObjectsManually adımına ulaştığında, işlenmekte olan geçerli Kanal 1 görüntüsünü görüntüleyen bir pencere görüntülenir.
    22. Klavyedeki F tuşuna tıklayın ve ardından farenin sol tıklama düğmesini basılı tutarken bir hücrenin çekirdeğinin izini manuel olarak çizin. Çekirdekleri izledikten sonra, farenin sol tıklama düğmesini bırakın. Görüntüdeki tüm hücreler için bu adımı yineleyin.
    23. Yoğunluk görüntüsünün bulunduğu açılır pencerenin sağ alt köşesindeki Bitti'ye tıklayın. Yazılım şimdi boru hattını tamamlayacak ve sitoplazmik, nükleer ve toplam hücre maskelerini ihraç edecek.
    24. Sol altta, Sonraki Görüntü Ayarı'na tıklayın ve tüm Kanal 1 TIF görüntüleri için 3.5.21-3.5.23 adımlarını tekrarlayın.
    25. 3.5.26-3.5.30 adımlarını izleyerek her hücrenin sitoplazması için ortalama floresan ömrü görüntüleme değişkenlerini elde etmek için 3.5.2-3.5.14 adımlarında oluşturulan bozunma matrislerini ve 3.5.15-3.5.24 adımlarında oluşturulan sitoplazmik maskeleri entegre etmek için R komut dosyasını (Bozunma matrislerini ve sitoplazmik maskeleri entegre edin.rmd) kullanın
    26. Bir elektronik tablo (örneğin, Microsoft Excel) kullanarak, 3 sütunlu test_key27 [Örnek için Ek Dosya 3] başlıklı bir .csv belgesi oluşturun.
    27. Sütunları Klasör, NADH ve FAD olarak adlandırın. Klasördeki Klasör Konumunu listelemek için tabloyu doldurun ve ardından her Kanal 1 görüntüsünü her Kanal 2 görüntüsüne bağlamak için sırasıyla NADH ve FAD'de görüntü başlığı önekini doldurun (örnek verilere bakın - Tablo 2).
  6. R Studio'da Bozunma matrislerini ve sitoplazmik maskeleri entegre et'i açın.rmd27 (Ek Dosya 4).
    1. Aşağıdaki dosya yollarını komut dosyasında açıklandığı gibi ayarlayın: Çalışma Dizinini, Kanal 1 dosya konumunu, FAD dosya konumunu, Maske dosyası konumunu ve çıktı dosyası konumunu ve adını ayarlayın.
    2. Komut dosyasının tamamını çalıştırın. Komut dosyasının başarıyla tamamlanmasının ardından, meta veriler ve ortalama FLIM değişkenleri dahil olmak üzere bir çıktı dosyası oluşturulacaktır.
    3. Otofloresan FLIM data.rmd27 (Ek Dosya 5) veya başka bir analiz yazılımı kullanarak analizi gerçekleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSC hücre durumunu ayırmak için konfokal otofloresan görüntüleme (Şekil 1)
NSC aktivasyon durumunu çözmek için konfokal mikroskopi kullanmak için, qNSC'ler ve aNSC'ler, daha önce tarif edildiği gibi bir aktivasyon ortamı veya sessizlik ortamı kullanılarak in vitro olarak üretildi 10,13,17,18. NSC'lerde PAF'ı tespit etmek için, canlı qNSC'ler ve aNSC'ler konfokal mikroskopta aynı pozlama kullanılarak görüntülendi (Örn: 405 nm, Em: 580-620 nm). qNSC'ler, aNSC'lere kıyasla daha yüksek sayıda PAF sergilemiştir (Şekil 1A,B). Bu bulgu, otofloresan özelliklerinin qNSC'lerin ve aNSC'lerin hücre durumunu tanımlamak için belirteçler olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Otofloresan kullanılarak NSC hücre durumunun FACS zenginleştirilmesi (Şekil 2)
FACS kullanarak hücre döngüsü durumunu zenginleştirmek için, qNSC'ler ve aNSC'ler, bu protokolde tarif edildiği gibi in vitro 10,13,17,18,19 olarak üretildi ve S-fazı boyunca ilerleyen hücreleri etiketlemek için akış sitometresinde tripsinizasyon ve analizden önce 1 saat boyunca EdU ile önceden etiketlendi. qNSC'ler ve aNSC'ler daha sonra akış sitometrisi ile ayrı ayrı veya 1 qNSC:1 aNSC oranında karışık olarak analiz edildi (Şekil 2


figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, NSC'lerde otofloresan sinyallerin görüntülenmesi yoluyla NSC hücre durumunun in vitro olarak sınıflandırılmasına izin veren canlı hücreli, etiketsiz, tahribatsız, tek hücreli bir çözünürlük tekniğini tanımlar. Bu yaklaşım, NSC sessizleşmesi sırasında meydana gelen ve NAD(P)H gibi metabolik kofaktörlerin optik özelliklerini etkileyen metabolik değişimleri tespit eder ve NSC sessizliğini incelemek için mevcut teknolojilere göre birçok avantaj sunar. Örneğin, EdU gibi hücre döngüsü belirteçleri ile etiketleme gibi qNSC'leri ve aNSC'leri incelemek için birçok geleneksel teknik, numunelerin sabitlenmesini gerektirir. Şu anda mevcut olan ve canlı NSC'leri inceleyebilen yöntemler, tipik olarak floresan protein kodlayan transgenler üreterek, dışsal etiketlerin eklenmesini gerektirerek daha da sınırlıdır. Bu araçlar, hem onları oluşturmak için gereken kaynaklar hem de birçok teknik uyarı açısından sınırlıdır. Örneğin, ara filament proteinleri nestin ve Glial Fibriler Asidik Protein (GFAP), qNSC'lerin ve aNSC'lerin 12,13,18,28,29 belirteçleri olarak yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, nestin ve GFAP'ın qNSC'ler ve aNSC'ler arasında farklı şekilde ifade edildiği bilinmektedir 12,13,18,28,29. Ayrıca, otofloresan görüntüleme, bir hücre popülasyonunun toplu analiziyle sonuçlanan deneylerde yorumlanması kaybolan veya karmaşık olan tek hücre heterojenliğini çözebilen yüksek çözünürlüklü tek hücreli veriler sağlar.

Bununla birlikte, otofloresan görüntülemenin de çeşitli sınırlamaları vardır. Otofloresan sinyallerin çoğu hücre fiksasyonu üzerine kaybolur. Bu nedenle, otofloresan görüntüleme büyük ölçüde canlı hücrelerin incelenmesi ile sınırlıdır. Otofloresan görüntüleme ayrıca, otofloresan kanallara sızabilen dışsal olarak sokulan floroforların eksikliğine de dayanır. Birçok florofor belirli durumlarda otofloresan görüntüleme ile uyumlu olabilse de, otofloresan görüntülemeyi mevcut birçok araçla eşleştirmek her zaman mümkün değildir. Canlı hücre görüntüleme de fototoksisiteye neden olabilir. Bu protokolü kullanan bir görüntüleme yinelemesi, NSC canlılığını azaltmak için yeterli fototoksisiteyi indüklemez. Bununla birlikte, hücrelerin bir zaman seyrinde günde birçok kez daha sık aralıklarla tekrarlanan görüntülemesi, önemli fototoksisite oluşturabilir ve bu nedenle, NSC sessizliğini incelemek için uygun bir strateji değildir. Son olarak, otofloresan görüntüleme, hipokampus veya lateral ventriküllerden 6 haftalık erkek farelerden alınan NSC'leri incelemek için kullanılabilse de, bu tekniğin diğer kaynaklardan, yaşlardan veya diğer kök hücre tiplerinden NSC'leri incelemek için ne kadar geniş bir şekilde kullanılabileceği açık değildir.

Burada açıklanan protokol ayrıca, önceden belirlenmişprotokoller 10,13,17,18,19 kullanılarak in vitro olarak qNSC'lerin ve aNSC'lerin doğru bir şekilde üretildiğini varsayar. Bu protokolün sonuçlarının çoğaltılması zorsa, daha önce açıklandığı gibi 10,13,17,18,19 gibi qNSC'lerin ve aNSC'lerin çeşitli belirteçlerinin varlığı veya yokluğu araştırılarak qNSC'lerin ve aNSC'lerin uygun şekilde oluşturulduğundan emin olun. Birlikte ele alındığında, otofloresan görüntüleme, qNSC'leri ve aNSC'leri tanımlamak ve NSC sessizlik çıkışlarını incelemek için yeni bir teknik yaklaşım sağlar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UW-Madison akış sitometrisi çekirdeğine (P30 CA014520 ve 1S10RR025483-01) ve Moore laboratuvarı ve UW-Madison topluluğunun üyelerine katkıları için teşekkür ederiz. Finansman kaynaklarımıza teşekkür ederiz: NIH T32 T32GM008688 (CSM'ye), AFAR'dan Diana Jacobs Kalman Bursu (CSM'ye), Wisconsin Yüksek Lisans Bursu (CSM'ye), DP2 NIH Yeni Yenilikçi Ödülü (1DP2OD025783, DLM'ye), Vallee Scholar Ödülü (DLM'ye), NIH 1R56NS130450 (DLM ve MCS'ye), R01 CA185747 (MCS'ye), R01 CA205101 (MCS'ye), R01 CA211082 (MCS'ye) ve Ulusal Bilim Vakfı Hibe No. CBET-1642287 (M.C.S.'ye).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40x Su objektif lensiNikonMRD77410Bölüm 3'te çoklu foton mikroskobunda kullanılan objektif lens
8 kuyulu küvetIbidi80826-90aNSC'leri/qNSC'leri görüntülemek için
Analog güç ölçerThorlabsPM100ABölüm 3'te çoklu foton mikroskobunda kullanılır
Antibiyotik-Antimikotik (100X) (PSF)Thermo Fisher15240062NSC ortamı için antibiyotik
B-27Invitrogen17504044NSC ortamı için besin takviyesi
BMP4Fisher Scientific5020BP010Sessizliği indüklemek için faktör
Sığır serum albüminiSigmaA4919-25GBMP4
Bukalemun ultra hızlı lazer3'te çoklu foton mikroskobunda kullanılanTutarlıN / A
Konfokal mikroskopC2Mikroskobu
DMEM/F-12 (GlutaMAX olmadan)NSC'ler için11320033
DNAseSigmaD5025-15KUTripsin inhibitörü
EdU test kitineInvitrogenC10337Hücre kültürü için proliferasyon testi
EGFPeproTechAF-100-15-500UGNSC ortamı için büyüme faktörü
NSC ortamı içinFGFPeproTech100-18B
Floresan aktif hücre sıralayıcıBDFACSAriaBölüm 2 için kullanılan Floresan Aktif Hücre Sıralayıcı
NSC ortamı içinHeparinSigmaH3149-50KU
Tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlamak içinL-15Invitrogen21083027
SigmaL2020-1MGCam eşyaların kaplanması için
Nikon TiE ters mikroskopNikonN/Aiçin kullanılan mikroskop çerçevesi
Cam eşyaların kaplanması için
SPC-150 Tek foton sayma elektroniğiBecker ve HicklN/ABölüm 3'te çoklu foton mikroskobunda kullanılır
Tripsin (küreler veya tek tabakalar olarak büyüyen aNSC'lerin peletlerini tripsinlemek için)Gibco15090046Nörosferleri veya yapışık aNSC'leri tripsinlemek için
Tripsin (qNSC'leri tripsinlemek için)Gibco25200072Yapışan qNSC'leri tripsinlemek için
Tripsin inhibitörüSigmaT6522-100MGaNSC'lerin tripsinizasyonunu inhibe etmek için
Üre kristalleriSigmaU5128-5GBir IRF
VerseneThermo Fishertoplamak için kullanılır15040066Tripsin hazırlamak için
yapmak için Bölüm Lazer Bölüm 1 için kullanılan Nikon canlandırıcı Temel ortam eklendi Büyüme faktörü Katkı maddesi Laminin Bölüm 3 PLO Sigma P3655-100MG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).">Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  2. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).">Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  3. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).">Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  4. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).">Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  5. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).">Urban, N., et al. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).
  6. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).">Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  7. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).">Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  8. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).">Sagar, M. A. K., et al. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).
  9. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).">Knobloch, M., et al. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).
  10. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).">Knobloch, M., et al. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).
  11. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).">Knobloch, M., et al. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).
  12. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).">Shin, J., et al. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  13. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).">Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  14. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).">Beckervordersandforth, R. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).
  15. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).">Morrow, C. S., et al. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).
  16. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).">Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  17. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).">Mira, H., et al. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).
  18. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).">Morrow, C. S., et al. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).
  19. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).">Martynoga, B., et al. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).
  20. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).">Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).
  21. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).">Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).
  22. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).">Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  23. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).">Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  24. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).">Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  25. https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).">ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  26. https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).">Becker & Hichl Handbooks. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).
  27. https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).">GitHub Materials. , Available from: https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).
  28. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).">Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).
  29. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).">Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neural Stem CellsNSC ActivationAdult NeurogenesisNSC QuiescenceAutofluorescence ImagingConfocal MicroscopyFlow CytometryFluorescence Lifetime ImagingCell State ClassificationLive Cell Analysis

Related Articles