Yöntem makalesi

Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi

DOI:

10.3791/63126

⸱

12 Mart 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department, Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinopatiler, gözün nörosensör dokusunu etkileyen heterojen bir hastalık grubudur. Nörodejenerasyon, glioz ve vasküler fonksiyon ve yapıda ilerleyici bir değişiklik ile karakterizedirler. Retinopatilerin başlangıcı görsel algıda ince bozukluklarla karakterize edilse de, vasküler pleksustaki değişiklikler klinisyenler tarafından tespit edilen ilk belirtilerdir. Neovaskülarizasyonun yokluğu veya varlığı, retinopatinin proliferatif olmayan (NPDR) veya proliferatif (PDR) olarak sınıflandırılıp sınıflandırılmadığını belirler. Bu anlamda, birkaç hayvan modeli endotel değişiklikleri, nöronal ölüm ve retinada meydana gelen diğer olaylarda yer alan alttaki mekanizmaları belirlemek için her aşamanın spesifik vasküler özelliklerini taklit etmeye çalıştı. Bu yazıda, doğum sonrası (P)17'de yetişkinlerde ve erken doğum farelerinde retinal vasküler parametrelerin ölçümü için gerekli prosedürlerin tam bir açıklamasını sunacağız. Daha sonra mikroskobik görselleştirme için tüm montajlarda Isolectin GSA-IB4 ile retinal vasküler boyama yapmak için protokolleri detaylandıracağız. Image J Fiji yazılımı ile görüntü işleme için önemli adımlar da sağlanmaktadır, bu nedenle okuyucular damar yoğunluğunu, çapını ve tortusitesini, damar dallanmasını ve ayrıca avasküler ve neovasküler alanları ölçebilecektir. Bu araçlar hem proliferatif olmayan hem de proliferatif retinopatilerdeki vasküler değişiklikleri değerlendirmek ve ölçmek için son derece faydalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gözler iki arterio-venöz sistem tarafından beslenir: koroidal vaskülat, retina pigmentli epitel ve fotoreceptörleri sulayan harici bir damar ağı; ve ganglion hücreleri tabakasını ve retinanın iç nükleer tabakasını sulayan nöro-retinal vaskülat1. Retina vaskülatürü, uygun görsel sinyal transdüksiyonunun sağlanması için retina hücrelerine besin ve oksijen sağlayan ve atık ürünleri toplayan organize bir damar ağıdır. Bu vaskülatın bazı belirgin özellikleri vardır: otonom innervasyon eksikliği, damar tonunun içsel retina mekanizmaları tarafından düzenlenmesi ve karmaşık bir retinal-kan bariyerine sahip olması2. Bu nedenle, retinal vaskültür, gelişim sırasında sadece vaskülogenez değil, aynı zamanda bu damarların hastalıklarda geçirdiği değişiklikler ve patolojik anjiogenez üzerinde kapsamlı bir şekilde çalışmış birçok araştırmacının odak noktası olmuştur3. Retinopatilerde en sık gözlenen damar değişiklikleri damar genişlemesi, neovaskülarizasyon, damar arborizasyonu kaybı ve retina ana damarlarının deformasyonudur, bu da onları daha ziggaggy4,5,6 yapar. Açıklanan değişikliklerden biri veya daha fazlası klinisyenler tarafından tespit edilen en erken belirtilerdir. Vasküler görselleştirme hızlı, invaziv olmayan ve ucuz bir tarama yöntemi sağlar7. Vasküler ağaçta gözlenen değişikliklerin kapsamlı çalışması, retinopatinin proliferatif veya proliferatif olup olmadığını ve daha sonraki tedaviyi belirleyecektir. Proliferatif olmayan retinopatiler, diğerlerinin yanı sıra anormal vasküler morfoloji, azalmış vasküler yoğunluk, hücresel kılcal damarlar, perisit ölümü, makula ödemi ile kendini gösterebilir. Ek olarak, proliferatif retinopatiler ayrıca retina dekolmanını kolayca parçalayan veya indükleyen vitreus boşluğuna doğru artan vasküler geçirgenlik, hücre dışı yeniden şekillendirme ve vasküler tutamların oluşumunu geliştirir8.

Saptandıktan sonra, retinopati vasküler değişiklikleri ile izlenebilir9,10. Patolojinin ilerlemesi, hastalığın aşamalarını açıkça tanımlayan damarların yapısal değişiklikleri ile takip edilebilir11. Bu modellerdeki vasküler değişikliklerin nicelemesi, damar değişiklikleri ve nöronal ölümün korelasyona girmesine ve hastalığın farklı evrelerindeki hastalar için farmakolojik tedavilerin test edilmesine izin verdi.

Yukarıdaki ifadeler ışığında, retinopati çalışmalarında vasküler değişikliklerin tanınması ve nicelleştirilmesinin temel olduğunu düşünüyoruz. Bu çalışmada, farklı vasküler parametrelerin nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bunu yapmak için iki hayvan modeli istihdam edeceğiz. Bunlardan biri, Prematürite Retinopatisini ve proliferatif Diyabetik Retinopatinin bazı yönlerini taklit eden Oksijen kaynaklı retinopati fare modeli12'dir13,14. Bu modelde, avasküler alanları, neovasküler alanları ve ana damarların genişlemesini ve işkencesini ölçeceğiz. Laboratuvarımızda, proliferatif olmayan bir retinopatiye neden olan metabolik sendrom (MetS) fare modeli geliştirilmiştir15. Burada damar yoğunluğunu ve dallanmayı değerlendireceğiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL/6J fareler, OFTALMIK ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'nin yönergelerine göre ele alındı. Deneysel prosedürler, Córdoba Ulusal Üniversitesi Kimya Bilimleri Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (CICUAL) tarafından tasarlanmış ve onaylanmıştır (HCD 1216/18).

1. Tampon çözeltilerinin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. 1x fosfat tampon salin (PBS) hazırlanması: 8 g sodyum klorür (NaCl), 0,2 g potasyum klorür (KCl), 14,4 g disodium-hidrojen ekleyin fosfat dihidrat (Na2HPO4 2H2O) ve 0,24 g potasyum-dihidrojen fosfat (KH2PO4) ila 800 mL damıtılmış su. Tuzların tamamen çözünmesine kadar çözeltiyi karıştırın. Klorür asit (HCl) ile pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ilave damıtılmış su ile hacmi 1 L'ye ayarlayın. Çözeltiyi filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
  2. %4 paraformaldehit (PFA) hazırlanması: 800 mL taze hazırlanmış PBS'ye 40 g katı PFA ekleyin. Çözeltiyi 60 °C sabit bir sıcaklıkta bir ısıtma plakasında karıştırın. PFA tamamen çözünene kadar 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyin ve pH'ın 7.2-7.4 aralığında tutularak korunduğunu kontrol edin. PBS ile sesi 1.000 mL'ye yükseltin ve karıştırın. Isıtma plakasını kapatın ve sıcaklığı 35 °C'nin altında olduğunda çözeltiyi filtreleyin. Çözeltiyi 4 °C'de 3 güne kadar saklayın.
    DİkKAT: PFA yutulduğunda veya solunduğunda zararlıdır ve muhtemelen mutajenik bir bileşiktir. Tüm işlem sırasında eldiven ve yüz maskesi kullanın ve bir güvenlik kabininde çalışın.
  3. 1x Tris tamponlu salin (TBS) hazırlanması: 800 mL damıtılmış suya 6,1 g Tris ve 9 g NaCl ekleyin. Tuzların tamamen çözünmesine kadar çözeltiyi karıştırın. PH'ı HCl ile 7,4'e ayarlayın ve ilave damıtılmış su ile ses seviyesini 1 L'ye ayarlayın. Çözeltiyi filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
  4. TBS Hazırlanması- % 0.1 Triton X-100: 0.1 mL TritonX-100 ila 100 mL TBS ekleyin.
    NOT: Triton çok yoğun bir deterjan olduğundan, daha iyi pipetleme için ucun terminalini hafifçe kesin.
  5. TBS-%5-Sığır Serum Albümini (BSA) -%0,1 Triton-X-100 Hazırlanması: 5 g BSA ağırlığında ve 100 mL'lik son hacme kadar TBS- %0,1 triton X-100 çözeltisi ekleyin. Yavaşça karıştırın. Aliquot ve -20 ° C'de 2 aya kadar saklayın.
  6. Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 konjuge (Isolectin GSA-IB4): Ağırlık 36.75 mg kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2·2H2O) ve taze hazırlanmış PBS 500 mL'ye ekleyin. Çözeltiyi bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. Pipet 500 μL CaCl2 / PBS çözeltisi ve 500 μg liyofilize İzolektin GSA-IB4 tozu içeren şişeye ekleyin. Çözeltiyi 0,5 mL tüplerde hafifçe karıştırın ve aliquot. Işıktan korumalı olarak -20 °C'de saklayın.
  7. Gliserol/Tris'teki poli (vinil alkol) : 2,4 g Poli (vinil alkol) ağırlığında, 6 g gliserol ekleyin ve hafifçe karıştırın. Ardından, 6 mL su ekleyin ve oda sıcaklığında birkaç saat karıştırmaya devam edin. Önceden ısıtılmış 0,2 M Tris çözeltisi (pH: 8,5) 12 mL ekleyin ve 10 dakika boyunca 50 °C sabit sıcaklıkta ısıtın ve ara sıra karıştırın. Son olarak, aydınlatma için çözeltiyi 15 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüj edin.
    NOT: Çözeltiyi oda sıcaklığında soğumaya bırakın, aliquot ve -20 °C'de saklayın.

2. Floresan lektin boyama

  1. Farelerin karbondioksit (CO2) soluma ile kurban edilmesi üzerine, gözleri makasla enükle edin16. Enükle edilmiş gözleri oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca taze hazırlanmış% 4 PFA ile sabitlayın.
    NOT: Fiksasyon, gözlerin 4 °C'de bir gecede %4 PFA (ON) olarak inkübe edilmesiyle de yapılabilir. Fareler, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Beyanı ve Córdoba Ulusal Üniversitesi Kimya Bilimleri Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (CICUAL) yönergelerine göre kurban edilmiştir (Res. HCD 1216/18).
  2. Diseksiyon mikroskobu altında, limbüs boyunca keserek korneaları makasla çıkarın ve tüm retinaları parçalara çıkarın. Gözün ön kısmını atın ve retinayı RPE-Choroid'den ayırın.
    NOT: Kalan kalıntıları ve hyalüoid damarları retinadanps ile çıkardığınızdan emin olun.
  3. Retinaları 200 μL tüplere yerleştirin. Daha sonra, 4 °C'de 6 saat boyunca %5 Sığır Serum Albümini (BSA) ve %0,1 Triton-X-100 içeren 100 μL Tris tamponlu salin (TBS) çözeltisinde retinaları tıkayın ve permeabilize edin.
    NOT: Bu adım RT'de 2 saat boyunca gerçekleştirilebilir.
  4. Daha sonra, retinayı kapağa yerleştirmek için tüpü ters çevirin ve engelleme solüsyonını bir pipetle çıkarın.
  5. 0,01 μg/μL Isolectin GSA-IB4 (GSA-IB4) içeren çözeltinin 100 μL'sini ekleyin. Numuneleri ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile sarın. Retinaları 4 °C'de lektin çözeltisi AÇIK veya RT'de 2 saat boyunca çalkalayıcıda hafif ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
  6. Retinayı% 0.1 Triton-X-100 içeren 100 μL TBS ile çalkalayıcıda hafif ajitasyonla 20 dakika boyunca yıkayın. Uygun yıkama için retinayı ters çevirerek tüpün kapağına yerleştirin. Tüpü duran konumuna getirin ve kapta kalan ortamı çıkarın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
  7. Retinayı bir slayda yerleştirin ve bir damla PBS ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, retinanın kenarlarından optik sinire doğru eşit derecede uzak dört kesik gerçekleştirin.
  8. Retinanın yapraklarını açılmak için, tokmaklar veya küçük filtre kağıdı parçaları kullanın. Fotoreceptör tarafının aşağı bakacak şekilde olduğundan emin olun.
  9. Slaydın kalan PBS'lerini filtre kağıdıyla çıkarın. Daha sonra, gliserol / Tris'te bir montaj ortamı (Poli (vinil alkol) ekleyin ve kapak. RT'de 1 saat kurumasına izin verin.
  10. Slaytları ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.
    NOT: Retinalar, konfokal mikroskopi görselleştirmeye kadar PBS'de 4 °C'de de saklanabilir.

3. Konfokal mikroskopi görselleştirme ve mikrofotoğrafçı kazanımı

  1. Görselleştirmeden önce, ışıkla kaplı RT'de slaytları 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Konfokal mikroskopta, slaydı plakaya yüzüstü yerleştirin.
  3. Retinal vaskülatın üstün pleksusunun odaklanması ve görüntü alımını başlatmak için bir alan seçin.
  4. Yazılımda genel lazer parametrelerini ayarlayın: Dalga boyu: 488 nm; Lazer yoğunluğu; HV; Uzaklık; Kazanç.
    NOT: Lazer yoğunluğu, PMT, Ofset ve kazanç, lambanın koşullarına ve kullanımına bağlı olarak değişebilir. En uygun ayarlar, floresan sinyali ile doğrusal bir ilişkiye sahip olmak için fotomultiplier tüpün hassasiyetindeki doygunluğu önleyen damarların net bir görüntüsünü sağlar.
  5. Diğer alma parametrelerini ayarlayın: Mod; Boyut; Amaç, yakınlaştırma olmadan; Kalman yok; Adım Boyutu.
    NOT: Kontrolü ve deneysel örnekleri görüntülemek için aynı edinme koşulları kullanılmalıdır.
  6. Koordinatları x ve y ekseninde ayarlayın: Retinayı odakta 2x tarayın. Alan damarları gösteriyorsa, daha sonra görüntü alımı için işaretlemek üzere alanın iki katına tıklayarak seçin.
    NOT: Daha büyük damarların floresanları daha yüksek olduğu için üstün vasküler pleksus takip edilerek retina bölgesinin seçilmesi şiddetle tavsiye edilir.
  7. Izgarada bir komşu kareye hareket edin, retinayı odaklayın ve karşılık geliyorsa alanı seçin. Seçilen alan tüm retinayı oluşturana kadar bu adımı tekrarlayın.
  8. Bir alan seçin ve taramanın kalınlığı kapsamını tanımlamak için koordinatları z ekseninde ayarlayın. Bunu yapmak için, retinayı odakta 2x görselleştirin; mikrometre ile retinanın tepesine gidin ve Başlangıç konumunda ayarla'ya tıklayın. Ardından retinanın altına geçin ve Bitiş konumunda ayarla'ya tıklayın.
  9. Izgarada seçilen her alanda 3.8.
    NOT: Taranan alanı derinlemesine doğrulamak için Başlangıç konumunda git tuşuna basın. Gemiler hala görselleştirilmişse, mikrometreyi hareket ettirerek konumu yeniden ayarlayın ve ardından Ayarla'ya tıklayın. İşlemi Bitiş konumunda tekrarlayın.
  10. Otomatik taramayı başlatın.
  11. Tarama işlemi tamamlandığında görüntüyü açın.
  12. Görüntüyü Mozaik olarak kaydetmek ve tercih edilen uzantıyla kaydetmek için Seri biçimini seçin. Son olarak, dikişli görüntü ekranda gösterilecektir.

4. Görüntü işleme

  1. ImageJ FIJI yazılımında, Menü Çubuğu'na gidin ve Dosya > Aç'a tıklayın. İşlenmek üzere görüntüyü seçin. Biyo-Biçimler İçe Aktarma Seçenekleri penceresinde, OME-XML meta verilerini görüntüle'yi seçin ve Tamam'ı tıklatın.
    NOT: Benzer ada sahip görüntüler ayrı klasörlere kaydedilmelidir.
  2. OME Meta Verileri penceresinde, PhysicalSizeX, PhysicalSizeY ve PhysicalSizeZ olarak adlandırılan piksel boyutu bilgilerini arayın. Bu verileri kopyalayın.
  3. Görüntü kalibrasyonu için Menü Çubuğu'na gidin ve Görüntü > Özellikleri'ni seçin. 4.2. adımdaki görüntünün bilgilerini kopyalayın ve Tamam'ı tıklatın. Görüntü, her birinin z ekseninde edinilen mikrofotoğrafçıları temsil ettiği birkaç fotoğraf içeren bir pencere olarak açılır.
  4. Floresan etiketine bir renk vermek için görüntüye tercih edilen bir lut atayın. Bunu yapmak için Menü Çubuğu'na gidin ve LUT simgesine tıklayın.
  5. Tüm yığınları tek bir görüntüde görselleştirmek için Menü Çubuğu'na gidin ve Görüntü > Yığınları > Z Projesi'ni seçin.
  6. Görüntülenen Z Projeksiyon penceresinde, gemilerin görselleştirildiği tüm yığınları seçin. Projeksiyon Türü'nde Ortalama Yoğunluk'u seçin ve Tamam'ı tıklatın.
    NOT: Yığınların toplamının sonucu AVG (resim adı) adlı yeni bir görüntüde gösterilir.
  7. Arka planı azaltmak ve damarları vurgulamak için elde eden görüntüdeki parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Menü Çubuğu'na gidin ve Görüntü> Ayarla> Parlaklık/Kontrast'a tıklayın. B ve C pencerelerinde daha iyi bir yoğunluk gözlenene kadar çubukları hareket ettirin. Uygula'ya tıklayın ve değişiklikleri kaydedin.
  8. Parlaklık/Karşıtlık için seçilen parametreleri kopyalayın; bunlar tüm görüntüler için aynı olmalıdır.
  9. Görüntü ölçümüne gerek yok, ölçülecek parametreleri tanımlayın. Menü Çubuğu'nda Ölçümleri Analiz > Kümesi'ne gidin. Burada açıklanan prosedürlerde, Alan ve Çevre elde etmek gerekecektir (sonuçta mesafeleri ölçmek için de gereklidir). Tamam'a tıklayın.
  10. Gemi yoğunluğu nicelemesi için gerekli eklentiyi indirin17 ve eklenti tarafından sağlanan kurulum talimatlarını izleyin.
  11. Belirli bir vasküler parametrenin nicelleştirilmesine devam edin.

5. Avasküler alanların nicelleştirilmesi

  1. Menü Çubuğu'nda Değnek Aracı'nı seçin. Damarlardan yoksun retina bölgesini seçin.
    NOT: Toleransa bağlı olarak daha büyük veya daha küçük alanlar seçilebilir. Toleransı ayarlamak için asa aracı simgesine iki kez tıklayın. Kullanılan mod: Eski.
  2. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Retinanın tüm avasküler bölgeleriyle 5.1 ve 5.2 adımlarını tekrarlayın.
  3. Avasküler alan bilgilerini elde etmek için yatırım getirisi yöneticisinde Ölç'e tıklayın. Program, gerekli bilgileri içeren yeni bir pencere görüntüler. Verileri başka bir programda kopyalayın veya dosyayı kaydedin.
    NOT: Bazı görüntülerde, avasküler alanları manuel olarak seçmeyi tercih edebilirsiniz. Bu durumda, Çokgen Seçim aracını seçin, avasküler alanın etrafına kısa mesafeler çizin ve yeni bir mesafe başlamak üzereyken görüntüye tıklayın. İlk noktayı tıklatarak seçili alanı kapatın.
  4. Retinanın toplam alanını ölçmek için 5.1, 5.2 ve 5.3 adımlarını yineleyin.
  5. Retinanın avasküler alanını, retinanın toplam alanına bölünerek ölçülen tüm avasküler alanların toplamı olarak hesaplayın.

6. Neovasküler alanların nicelleştirilmesi

  1. Menü Çubuğu'nda Asa aracını seçin.
  2. Neovesselleri daha iyi görselleştirmek için görüntüyü yakınlaştırın. Asa aracı ile neovesselleri tek tek seçin.
    NOT: Tek bir neovessel seçimini sağlamak için toleransı 20'den yüksek olmayan şekilde ayarlayın. Bu tolerans düzeyi, tüm görüntü nicelemeleri sırasında sabit kalmalıdır.
  3. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Retinanın tüm neovasküler bölgeleriyle 6.1 ve 6.2 adımlarını tekrarlayın.
  4. Alan verilerini elde etmek için yatırım getirisi yöneticisinde Ölçü'ye tıklayın. Program, gerekli bilgileri içeren yeni bir pencere görüntüler. Verileri başka bir programda kopyalayın veya dosyayı kaydedin.
  5. Retinanın toplam alanını ölçmek için 6.1, 6.2 ve 6.3 adımlarını yineleyin.
  6. Retinanın neovasküler bölgesini, retinanın toplam alanına bölünerek ölçülen tüm neovessel alanlarının toplamı olarak hesaplayın.

7. Gemi çapının nicelleştirilmesi

  1. Menü Çubuğu'nda Düz Çizgi Aracı'nı seçin.
  2. Damar duvarını daha iyi görselleştirmek için görüntüyü yakınlaştırın. İlk daldan önce ana damara üç transversal hat gerçekleştirin. Bu, geminin bir duvarının sınırından tersine bir çizgi çekilerek yapılmalıdır.
    NOT: Nicelik hatalarını önlemek için hat duvar kabına mükemmel bir şekilde dik olmalıdır.
  3. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın. Ölçülmesi gereken tüm gemilerde 7.1 ve 7.2 adımlarını tekrarlayın.
  4. Mesafe verilerini elde etmek için yatırım getirisi yöneticisinde Ölç'e tıklayın. Program, gerekli bilgileri içeren yeni bir pencere görüntüler. Verileri başka bir programda kopyalayın veya dosyayı kaydedin.

8. Gemi işkencesinin nicelleştirilmesi

  1. Menü Çubuğu'nda, farenin sağ düğmesiyle Düz Çizgi Aracı simgesine tıklayın ve Parçalı Çizgi veya Serbest Çizgi'yi seçin. Damar şeklini takip eden ilk damar çarpmasına kadar optik sinirden damarın içine bir çizgi çizin.
    NOT: Nicelik hatalarını önlemek için çizginin vasküler şekli izlemesi gerekir.
  2. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın.
  3. Menü Çubuğu'nda Düz Çizgi Aracı'nı seçin. optik sinirden ilk damar çarpmasına kadar bir çizgi çekin.
  4. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın.
  5. Mesafe verilerini elde etmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi'ndeki Ölçü'ye tıklayın. Program, gerekli bilgileri içeren yeni bir pencere görüntüler. Verileri başka bir programda kopyalayın veya dosyayı kaydedin.
  6. İşkence endeksini aşağıdaki gibi hesaplayın: Parçalı çizgi ile elde edilen mesafe Düz çizgi ile elde edilen mesafeye bölünür.

9. Vasküler dallanmanın nicelleştirilmesi

  1. Menü Çubuğunun Oval Aracı ile tüm deneysel koşullara eşit olarak uygulanan bir alan tanımlayın. Seçilen alan optik sinirin etrafına çizilmiş eşmerkezli bir daire olmalıdır.
  2. Seçili alanı yatırım getirisi yöneticisine kaydetmek için klavyedeki T harfine basın.
    NOT: Bu durumda, nicelik yavaş olduğundan ve aynı yatırım getirisinin tüm görüntülerde kullanılması gerektiğinden yatırım getirisinin kaydedilmesi tavsiye edilir. Bunu yapmak için, yatırım getirisi yöneticisinde DAHA fazla > Kaydet'e tıklayın.
  3. Manuel olarak, seçim alanının içindeki ana damarlardan kaynaklanan birincil dalların sayısını sayın.
  4. Optik sinir-periferik kriterleri koruyarak komşu bölgelerdeki 9.2 ve 9.3 adımlarını tekrarlayın.

10. Damar yoğunluğunun nicelleştirilmesi

  1. Görüntüyü 8 bit moda dönüştürün.
  2. Menü Çubuğundaki Eklentiler'e gidin, Damar Yoğunluğu > Gemi Analizi'ni seçin.
  3. Menü Çubuğu'nun Kare aracıyla, damar yoğunluğunun ölçülmesi gereken bir alan tanımlayın. Tamam'a tıklayın.
  4. Program, gerekli bilgileri içeren yeni bir pencere görüntüler. Verileri başka bir programda kopyalayın veya dosyayı kaydedin.
  5. Komşu bölgelerdeki 10.2, 10.3 ve 10.4 adımlarını tekrarlayın, yatırım getirisini koruyun, ancak çevreyi ve tüm retinanın merkezini kapsayan dokuz kez yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol bölümünde açıklandığı gibi, tek bir floresan boyama testinden vasküler morfolojiyi elde edebilir ve çeşitli ilgi parametrelerini nicel olarak değerlendirebilirsiniz. Belirli bir değişikliğin araştırılması, çalışılan retinopatinin türüne bağlı olacaktır. Bu makalede, avasküler ve neovasküler alanlar, tortuozite ve dilatasyon proliferatif retinopatinin bir fare modelinde değerlendirilmiş, vasküler dallanma ve yoğunluk ise proliferatif olmayan bir retinopatiye neden olan mets fare modelinde analiz edilmiştir.

<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinopatilerin hayvan modelleri vasküler gelişim, tadilat veya patolojik anjiogenez çalışmak için güçlü araçlardır. Bu çalışmaların sahadaki başarısı, in vivo ve ölüm sonrası farelerden veri sağlayan çok çeşitli tekniklerin gerçekleştirildiğini sağlayan dokuya kolay erişime dayanır26,27. Ayrıca, in vivo çalışmalar ve klinik analiz arasında, bu modellere katı izlenebilirlik ve güvenilirlik sağlayan büyük korelasyon bulunmuştur28.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ceminco'dan Carlos Mas, María Pilar Crespo ve Cecilia Sampedro'ya (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Arjantin) konfokal mikroskopi yardımı için, Soledad Miró ve Victoria Blanco'ya özel hayvan bakımı için ve Laura Gatica'ya histolojik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca video prodüksiyonu ve baskısı için Victor Diaz'a (FCQ Kurumsal İletişim Sekreteri) ve paul Hobson'a makalenin eleştirel okuma ve dil revizyonu için teşekkür ederiz.

Bu makale Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (hepsi M.C.S.'ye).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alüminyum folyo
Sığır Serumu AlbüminMerckA4503kalite
Kalsiyum klorür dihidratMerckC3306
Hidroklorik asitBiopack9632.08
Konfokal Mikroskop FV1200OlympusFV1200motorlu plakalı
KapaklarPaul Marienfeld GmnH & Ve Tic. Ltd. Ş111520
Diseksiyon MikroskobuNIKONSMZ645
Disodyum-hidrojen-fosfat dihidratMerck119753
200 & mikro; L  tüpMerckZ316121
Filtre kağıdıMerckWHA5201090
İnkübatör çalkalayıcı GyroMiniLabNet InternationalS0500
İzolektin GS-IB4 Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 KonjugeInvitrogenI21411
Poli (vinil alkol) (Mowiol 4-88)Merck475904
ParaformaldehitMerck158127
pHmetreSANXINPHS-3D-03
Potasyum klorürMerckP9541
Potasyum-dihidrojen fosfatMerck1,04,873
SlaytlarFisher Scientific12-550-15
Sodyum klorürMerckS3014
Sodyum hidroksitMerckS5881
TrisMerckGE17-1321-01
Triton X-100MerckX100-1GA
Gemi Analizi Fiji yazılımıMai Elfarnawanyhttps://imagej.net/Vessel_Analysis

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  2. McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
  3. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  4. Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
  5. Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164(2019).
  6. Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369(2021).
  7. Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
  8. Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
  9. Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
  10. Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
  11. Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
  12. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  13. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  14. Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
  15. Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987(2020).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
  18. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  19. Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279(2019).
  20. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  21. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  22. Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
  23. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  24. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  25. Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362(2016).
  26. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  27. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  28. Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
  29. Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
  30. Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
  31. Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916(2018).
  32. Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
  33. Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835(2021).
  34. Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
  35. Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retinal Vask ler KantifikasyonT m Retina Haz rlOksijenle nd klenmi RetinopatiNon Proliferatif RetinopatiProliferatif RetinopatiVask ler Yo unlukDamar apVask ler Dallanmazolektin BoyamaImageJ Fiji Analizi

İlgili makaleler