Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek Hücreli Multi-Omik Deneyler için Fare Karotis Arterlerinin Lümeninden Endotel Hücrelerinin İzolasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Ateroskleroz, bozulmuş kan akışına (d-flow) maruz kalan arteriyel bölgelerin enflamatuar bir hastalığıdır. D-akımı , endoteldeki genlerin ekspresyonunu transkriptomik ve epigenomik seviyelerde düzenler ve proaterojenik yanıtlarla sonuçlanır. Son zamanlarda, fare kısmi karotis ligasyonu (PCL) modeli kullanılarak transkriptomik ve kromatin erişilebilirliği değişikliklerini tek hücreli çözünürlükte belirlemek için Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi (scATACseq) için tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve tek hücreli Tahlil çalışmaları yapılmıştır. Endotel hücreleri (ECs), arter duvarındaki toplam hücre popülasyonlarının küçük bir kısmını temsil ettiğinden, EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli preparatlar elde etmek için luminal bir sindirim yöntemi kullanılmıştır. Bu çalışma için fareler, sağ karotis arteri (RCA) kontrol olarak kullanırken, sol karotis arterde (LCA) d-akışını indüklemek için PCL cerrahisine tabi tutuldu. Karotis arterler PCL cerrahisinden iki gün veya iki hafta sonra diseke edildi. Her karotidin lümeni kollajenaz sindirimine tabi tutuldu ve endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreler veya tek çekirdekler elde edildi. Bu tek hücreli ve tek çekirdekli preparatlar daha sonra 10x Genomik mikroakışkan kurulum kullanılarak barkodlandı. Barkodlanmış tek hücreler ve tek çekirdekler daha sonra RNA hazırlama, kütüphane oluşturma ve yüksek verimli bir DNA sıralayıcısında dizileme için kullanıldı. Biyoinformatik işleme sonrası, scRNAseq ve scATACseq veri kümeleri, öncelikle EC'lerden oluşan luminal sindirimden çeşitli hücre tiplerini tanımladı. Düz kas hücreleri, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri de mevcuttu. Bu EC-zenginleştirme yöntemi, toplam arter sindirim yöntemiyle zor olabilecek kan akışının endotel üzerindeki etkisini anlamaya yardımcı oldu. EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli hazırlama yöntemi, kan akışının bu genler üzerindeki etkisinin çalışılmadığı EC-nakavtlarda ve transgenik farelerde tek hücreli omik çalışmalar yapmak için kullanılabilir. Önemli olarak, bu teknik, benzer mekanik çalışmalar yapmak için EC ile zenginleştirilmiş tek hücreleri insan arter eksplantlarından izole etmek için uyarlanabilir.
Giriş
Bu laboratuvar daha önce d-flow indüksiyonunun hiperlipidemik farelerde hızlı ve sağlam ateroskleroz gelişimine yol açtığını göstermiştir 1,2. D-flow kaynaklı aterosklerozun yeni fare modeli, kısmi karotis ligasyonu (PCL) cerrahisi kullanılarak mümkün olmuştur 3. PCL cerrahisi, bağlı sol karotis arterde (LCA) düşük ve salınımlı kan akımı durumunu veya d-akışını indükler. Buna karşılık, kontralateral sağ karotis arter (RCA) stabil laminer akışla (s-flow) yüzleşmeye devam eder. Önceden, d-akışının endotel hücreleri üzerindeki etkisini anlamak i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hiperkolesterolemik olmayan, yaş ve cinsiyete uygun C57BL / 6 fareleri, cinsiyete bağlı varyasyonu hafifletmek ve hiperkolesterolemik durumların herhangi bir komplikasyonunu dengelemek için kullanıldı.
1. Parsiyel karotis ligasyonu (PCL) cerrahisi
NOT: LCA'nın parsiyel karotis arter ligasyonu daha önce tarif edildiği ve gösterildiği gibigerçekleştirilmiştir 3.
- Anestezik buharlaştırıcı kullanarak işlem boyunca fareyi izofluran inhalasyonu (indüksiyon....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Parsiyel karotis ligasyon ameliyatları 44 fareye uygulandı ve parsiyel ligasyon cerrahisinden bir gün sonra ultrasonografi yapılarak LCA'da d-akımının başlangıcı doğrulandı. Başarılı kısmi ligasyon cerrahisi, kan akış hızının azalmasına neden olur ve LCA3'teki kan akışını (bozulmuş akış) tersine çevirir. Karotis arterler ligasyondan iki gün sonra veya iki hafta sonra diseke edildi. Her karotidin lümeni kollajenaz sindirimine tabi tutuldu ve endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreli veya te.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, tek hücreli preparatları fare karotis arterlerinden izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. D-flow'un endotel hücreleri üzerindeki etkisi, PCL cerrahisi doğru bir şekilde gerçekleştirilirse doğru bir şekilde incelenebilir. Dış karotid, internal karotid, oksipital arter ve superior tiroid arter gibi ortak karotidin dallarını doğru bir şekilde tanımlamak çok önemlidir. Ultrasonografi ile akış paternlerinin doğrulanması, d-flow koşullarının başarılı başlangıcını daha da doğrular. .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
HJ, FloKines Pharma'nın kurucusudur. Diğer yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL119798, HL095070 ve HL139757'den HJ'ye hibe edilen fonlarla desteklenmiştir. HJ ayrıca Wallace H. Coulter Seçkin Fakülte Başkanı Profesörlüğü tarafından da desteklenmektedir. Emory Entegre Genomik Çekirdeği (EIGC) tarafından sağlanan hizmetler, Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından sübvanse edildi ve ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Georgia Klinik ve Translasyonel Bilim İttifakı tarafından ödül numarası altında kısmen desteklendi. UL1TR002378. Yukarıda verilen içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini yansıtmamaktadır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| <> Kimyasallar, Peptitler ve Rekombinant Proteinler | |||
| 1x PBS (Hücre Kültürü Sınıfı) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Mikrosantrifüj Tüpleri | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Santrifüj Tüpü - Köpük Raf, Steril | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Santrifüj Tüpleri | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 İpek Sütür Steril | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 & m Hücre Süzgeci, Beyaz, Steril, Ayrı Ayrı Paketlenmiş | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solüsyonu, steril filtreli | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | veya eşdeğeri |
| ATAC Tamponu (Transpozisyon Karışımının Bileşen I) | 10x Genomik | 2000122 | |
| ATAC Enzimi (Transpozisyon Karışımının Bileşen II) | 10x Genomik | 2000123/ 2000138 | |
| Sığır Serumu | albümini Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorfin | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Krom Kontrol Cihazı ve Sonraki GEM Aksesuar Kiti | 10X Genomik | 1000204 | |
| Krom Sonraki GEM Tek Hücreli 3' Reaktif Kitleri v3.1 | 10X Genomik | 1000121 | |
| Krom Sonraki GEM Tek Hücreli ATAC Reaktif Kitleri v1.1 | 10X Genomik | 1000175 | |
| Kollajenaz II | MP Biyomedikal | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Diseksiyon Forseps | Roboz Cerrahi Aletler Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Santrifüj (Tezgah Üstü Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Sığır Serumu - Premium Select | R& D sistemleri | S11550 | |
| Sabit Açılı Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES tamponlu salin | Millipore Sigma | 51558 | |
| İnsülin şırınga (3/10 mL 29 G şırınga) | BD | 305932 | |
| İzofluran | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Akıllı Süzgeçler (30 ve mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS Akıllı Süzgeçler (100 & mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Tuzlu Su (% 0.9 sodyum klorür) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Çekirdek Tamponu (20x) | 10x Genomik | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Küçük makas | Roboz Cerrahi Aletler Co | RS-5675 | |
| Kilitli Forseps Uygulayan Paslanmaz Çelik Mikro Klips | Roboz Cerrahi Aletler A.Ş. | RS-5480 | veya benzeri |
| Doku Tamiri II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Tip II Kollajenaz | MP biyomedikaller | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ dosyaları | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Katılım # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ dosyaları | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Katılım # PRJNA646233 | |
| Yazılım ve Algoritmalar | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomik | https://support.10xgenomics.com/ tek hücreli gen-exp | |
| Cicero | Pliner ve diğerleri, 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky ve diğerleri, 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider ve diğerleri, 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu ve diğerleri, 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monokl salımlı | |
| R sürüm 3.6.2 | R Vakfı | ||
| Seurat 3.1.3 | Stuart ve diğerleri, 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart ve diğerleri, 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Kaynaklar
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 6/22/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
