Yöntem makalesi

Drosophila melanogaster Larva Enjeksiyon Protokolü

DOI:

10.3791/63144

⸱

19 Ekim 2021

 ,  , 
1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster yetişkin sinekleri, konakçı antimikrobiyal doğuştan gelen immün yanıtların ve mikrobiyal enfeksiyon stratejilerinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. D. melanogaster larva aşamasını ek veya alternatif bir model sistem olarak tanıtmak için, bir larva enjeksiyon tekniği tanımlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğuştan gelen bağışıklık ve patojen virülansını incelemek için geleneksel olmayan modellerin kullanılması, maliyetli olabilecek ve etik sorunları gündeme getirebilecek memeli modellerine değerli bir alternatif sunmaktadır. Geleneksel olmayan modeller çok ucuz, kullanımı kolay ve kültürlüdür ve fazla yer kaplamaz. Genetik olarak uygundurlar ve tam genom dizilimlerine sahiptirler ve kullanımları etik bir husus sunmaz. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster, çeşitli davranış, gelişim, metabolizma ve bağışıklık araştırmaları hakkında büyük bilgiler sağlamıştır. Daha spesifik olarak, D. melanogaster yetişkin sinekleri ve larvaları, omurgalı hayvanlarla paylaşılan birkaç doğuştan gelen savunma reaksiyonuna sahiptir. İmmün yanıtları düzenleyen mekanizmalar çoğunlukla D. melanogaster modelinde genetik ve moleküler çalışmalarla ortaya konmuştur. Burada, D. melanogaster larvalarında doğuştan gelen bağışıklık süreçlerinin araştırılmasını daha da teşvik edecek ve çok çeşitli mikrobiyal enfeksiyonların patogenezini araştıracak yeni bir larva enjeksiyon tekniği sunulmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster, biyolojik ve biyomedikal araştırmalarda birkaç on yıldır yoğun bir şekilde kullanılmaktadır, çünkü sofistike genetik ve moleküler araçlar dizisi çok çeşitli çalışmaların analizi için istikrarlı bir şekilde gelişmiştir1,2,3,4. D. melanogaster'deki gelişim, homeostaz ve doğuştan gelen bağışıklığın evrimsel olarak korunmuş yönleri, onu çeşitli insan ve böcek hastalıklarını incelemek için değerli bir model organizma haline getirmiştir5,6. Özellikle, D. melanogaster modelinin bağışıklığı incelemek için temel rolü, yetişkin sinek çalışmalarında büyük ölçüde örneklenmiştir. Bununla birlikte, D. melanogaster larva çalışmaları da mevcut bilgiye katkıda bulunmuş ve esas olarak böcek kütikülünden kaynaklanan yaban arısı ve nematod enfeksiyonları için hücresel bağışıklık tepkilerini araştırmıştır7,8,9,10. Drosophila melanogaster larvaları, topluca hemositler olarak adlandırılan üç farklı kan hücresi tipine sahiptir: plazmatositler, kristal hücreler ve lamellositler11,12,13. Bu hücreler, D. melanogaster larvaları bakteri, mantar, virüs ve parazitler gibi patojenlerle enfekte olduğunda bir dizi bağışıklık tepkisi oluşturabilir14,15,16. Hücresel immün yanıtlar, küçük moleküllerin veya bakterilerin doğrudan yutulmasını (fagositoz), melanizasyonu, parazitoid yumurtalar gibi daha büyük patojenlerin kapsüllenmesini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve Nitrik oksit sentezlerinin (NOS) üretimini içerir 17,18,19.

Buna karşılık, humoral immün yanıtları analiz etmek için D. melanogaster larva modelinin kullanımı hakkında daha az çalışma yayınlanmıştır. Bunun temel nedeni, D. melanogaster larvalarının oral enfeksiyonu için beslenme tahlillerinin uygulanması ve larvaların hassas bir şekilde ele alınması ve özellikle penetrasyon sırasında mikroiğnenin uygun kullanımı da dahil olmak üzere mikroenjeksiyon larvaları ile ilişkili çeşitli zorluklardır20,21. Bu nedenle, larva enfeksiyonu ve teknik zorluklar (yani yüksek mortalite) hakkındaki sınırlı bilgi, D. melanogaster larva modelinin kullanımını zorlaştırmıştır. Bir larva modeli, konakçı-patojen etkileşimleri ve patojenik enfeksiyonlara karşı spesifik konakçı doğuştan gelen immün yanıtların indüksiyonu hakkında daha fazla bilgi sağlayacak yeni moleküler mekanizmaları tanımlama potansiyeline sahip olacaktır.

Burada, D. melanogaster larvalarını bakteri gibi çeşitli patojenlerle enjekte etmek için kullanılabilecek basit ve etkili bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özellikle, D. melanogaster larvaları, insan patojeni Photorhabdus asymbiotica ve patojenik olmayan bakteri Escherichia coli ile enjeksiyonlar için kullanılır. Bu yöntem, D. melanogaster'in çeşitli mikrobiyal enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkilerinin manipülasyonu ve analizi için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sinek yetiştiriciliği

NOT: D. melanogaster yaşam döngüsü dört aşamaya ayrılmıştır: embriyo, larva, pupa ve yetişkin. Laboratuvarda optimum yetiştirme koşullarına (~ 25 ° C, % 60 nem ve yeterli gıda) sahip üretim süresi, döllenmiş yumurtadan kapalı yetişkine kadar yaklaşık 10 gündür. Dişiler günde ~ 100 embriyo bırakır ve embriyogenez yaklaşık 24 saat 22 sürer. Larvalar üç gelişim aşamasından geçer (instars; L1-L3) ~ 4 gün içinde (L1 ve L2: 24 saat ve L3: 48 saat). İlk instar larvaları ortamın yüzeyinde hemen beslenmeye başlar. İkinci instar larvaları ortama girerken, üçüncü instar larvaları ortamı terk eder ve şişe duvarlarında dolaşır, 24-48 saat boyunca puparite edilecek bir yer ararlar.

  1. Mısır unu soya bazlı bir diyet içeren kuru yiyecekleri, 1/5 ila 2/5 hacim aboue kadar dar bir polistiren şişesine (25 mm x 95 mm) ekleyin. Daha sonra 9 mL su ekleyin ve diyet tamamen nemlendirilene kadar şişenin 1 dakika oturmasına izin verin.
  2. Şişeye yaklaşık 10 granül kuru fırıncı mayası ekleyin ve en az 20 yeni ortaya çıkan erkek ve dişi yetişkin sineğin bir karışımını yerleştirin.
  3. Şişeyi 12:12 saatlik bir ışıkta 25 ° C'de inkübe edin: karanlık fotoperiyodik döngü.
  4. Yaşam döngüsünün ilerlemesini sağlamak için, sinek şişelerini günlük olarak kontrol edin ve ilk geliştirme aşamalarını kaydedin.

2. Enfeksiyon için larva seçimi

  1. Larvaları, enfeksiyonun gerçekleştirileceği gün dolaşan üçüncü instar aşamasına ulaştıklarında ince bir boya fırçası ile seçin (deve kılı en iyisidir) (Şekil 1).
  2. Seçilen larvaları, orijinal şişelerinden çıkarıldıktan sonra küçük bir Petri kabında (100 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6.9) Ringer çözeltisi (60 mm x 15 mm) ile yıkayın23.
  3. Larvaları, yaklaşık 5 mL Ringer çözeltisi ile hafifçe nemlendirilmiş filtre kağıdına (150 mm çapında) bir Petri kabına (100 mm x 15 mm) yerleştirin (Şekil 2A).
  4. Kuruluk ve larva kurumamasını önlemek için filtre kağıdına günlük ~ 1 mL Ringer çözeltisi ekleyin.

3. Bakteriyel preparat

  1. Kültür P. Luria Bertani (LB) agar ortamındaki asymbiotica bakterileri 48 saat boyunca 28 °C'de.
  2. 10 mL LB ortamında sıvı bir kültürü aşılamak için tek bir P. asymbiotica kolonisini aktarmak için bir biyogüvenlik seviye 2 kabini kullanın.
  3. P. asymbiotica sıvı kültürünü gece boyunca 28 °C'de 220 rpm'ye ayarlanmış döner bir çalkalayıcıda inkübe edin.
  4. Kültür E. coli bakterileri benzer şekilde, ancak agar ortamında ilk büyümeyi ve sıvı kültür inkübasyonunu gece boyunca 37 ° C'de gerçekleştirir.
  5. Her gece bakteri kültürünü 13.000 x g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
  6. Süpernatantı atın ve elde edilen bakteri peletlerini 10 mL steril PBS ile üç kez yıkayın.
  7. Peletleri 13.000 x g ve 4 °C'de 3 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
  8. Bir spektrofotometre kullanarak, bakteri konsantrasyonlarını P. asymbiotica için 0.25 ve E. coli için 0.015 optik yoğunluğa (600 nm) ayarlamak için her peleti steril PBS ile seyreltin; bu, bir spektrofotometre kullanarak, her bakteri preparatının larvası başına 100-300 koloni oluşturma birimine karşılık gelir.

4. Enjektör hazırlığı

  1. 3,5" cam kılcal tüpler ve bir mikropipet çektirme makinesi kullanarak kılcal damarlar hazırlayın. Cihazı aşağıdaki gibi ayarlayın: ısı: 580; çekme: 143; hız: 25; gecikme: 1; basınç: 500.
  2. Cam kılcal damarı larvalara minimum zarar verirken deneysel tedavilerin verilmesine izin verecek derecede açmak için düz tırtıklı orta nokta forseps kullanın (Şekil 2B). Enjeksiyonları uygularken bu prosedürü optimize etmek için, enjekte ederken sızıntıyı ve mavi larvaların hayatta kalmasını kolayca izlemek için Trypan Blue çözeltisini kullanın (stoku% 0.4 ila% 0.2 ile% 0.2 oranında seyreltin).
  3. Kılcal damarı, hipodermik bir iğne (22 G, 25 mm uzunluğunda) ile plastik, tek kullanımlık 20 mL şırınga kullanarak mineral yağ ile doldurun.
  4. Nanolitre enjektörün kurulmasını sağlayın ve yağı kılcal damardan dışarı çıkarın (Şekil 2C).
  5. Kılcal damarı enjeksiyon için istenen bakteriyel preparatla doldurun. Çözeltiyi parafilm üzerine yerleştirilen bir damladan (~ 20 μL) alın. Bu protokolde, iki bakteri stokunun 50.2 nL'si enjekte edildi.

5. Larva enjeksiyonu

  1. İşlemden önce ~ 2 dakika boyunca karbondioksit kullanarak D. melanogaster larvalarını anestezi altına alın.
  2. Anestezi altındaki larvaları, stereomikroskop altında enjeksiyona hazırlanırken Ringer'ın çözeltisinde nemlendirilmiş bir filtre kağıdına yavaşça aktarın. Larvalar bu noktada uyuşuk veya pasif olacaktır.
  3. Larvaları enjekte etmek için, forseps kullanarak arka ucun dorsal tarafına (trakeal spiracles arka uçta belirgindir, ön uçta siyah ağız kısımlarına karşı belirgindir) sert baskı uygulayın (Şekil 2D).
  4. İğneyi larvaların arka ucuna, kütikülün yanına yatay olarak yerleştirin. Başarılı bir enjeksiyon, enjekte edilen çözeltinin larvalardan sızmasına neden olmaz (Şekil 3).
  5. İğneyi geri çekmeden önce larvaların kuyruğuna baskı uygulamak için kullanılan forsepsleri çıkarın. İlk önce çıkarılmazsa, forsepsler hemolenf ve / veya bağırsağı larvalardan yara bölgesinden dışarı zorlayabilir.
  6. Gerçekleştirilen çalışma için uygun sayıda larvayı enfekte edin. Bu özel protokolde, her deneysel durum için 20 larva enjekte edildi.
  7. Forseps kullanarak, enjekte edilen larvaları, iyileşmeye izin vermek için bir Petri kabında (çanak başına 10 larva) veya bir gıda şişesinde (deneyin amacına bağlı olarak) ayrı bir nemli filtre kağıdına yavaşça aktarın.
  8. Petri tabaklarını veya yiyecek şişelerini 25 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Larvalar bir Petri kabında tutulursa, kurumayı önlemek için gerektiğinde Ringer çözeltisini ekleyin.

6. Hayatta kalma/mortalitenin kaydedilmesi

  1. Ölü ve canlı D. melanogaster larvalarının sayısını, belirlenen deneysel zaman noktalarına göre kaydedin. Canlı larvalar pupa ve yetişkinlere dönüşmeye devam edecektir.
  2. Ham sağkalım / mortalite verilerini girmek, bunları log-rank (Mantel-Cox) testi ile analiz etmek ve sonuçları rakamlarla temsil etmek için Prizma gibi istatistiksel programları kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğru yapıldığında, D. melanogaster larvalarının enjeksiyonları bakteriye özgü bir etki gösterir. Sağkalım verileri, P. asymbiotica (ATCC43943 suşu), E. coli (K12 suşu) ve PBS (Şekil 4) enfeksiyonlarını takiben birkaç zaman noktasında toplandı. D. melanogaster larvaları, sağkalımı hızla tehlikeye atan P. asymbiotica'ya duyarlı iken, E. coli veya PBS kontrolleri ile enjekte edilen larvalar uzun süreli sağkalımlar sergiler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster, çeşitli mikrobiyal enfeksiyonların doğuştan gelen bağışıklığı ve patogenezinin araştırılmasında kullanılan en değerli, deneysel olarak manipüle edilmiş modeller arasındadır. Bunun nedeni, basit ve hızlı yaşam döngüsü, laboratuvarda basit bakım, köklü evrimsel genetik ve çeşitli genetik araç kutusudur. Hibrit bir mikroakışkan cihaz veya bir Narishige mikromanipülatörü kullanmak gibi önceki D. melanogaster larva enjeksiyonları yöntemleri, son derece özel ekipman gerektirir ve mali...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

George Washington Üniversitesi (GWU) Biyolojik Bilimler Bölümü üyelerine makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. GT, GWU'dan bir Harlan yaz bursu ile desteklendi. Tüm grafik figürler BioRender kullanılarak yapılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fly Food B (Bloomington Tarifi)LabExpress7001-NVFood B, dar şişelerde, 100 şişe/tepsi
100 x 15, Mono Petri Kapları Tamamen İstiflenebilirVWR25384-342Çap 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri kapları Tamamen İstiflenebilirVWR25384-092Çap 60 x 15 mm
Cam kılcal damarlarVWR53440-186
Grade 1 kalitatif filtre kağıdı standart sınıf, daireVWR28450-150Çap 150 mm
Laboratuvar kültürü Sınıf II Tip A2 Biyogüvenlik Güvenlik KabiniESCOLA2-4A2-E
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB agar değirmen tozu 500 g
LB Etsuyu Fisher ScientificBP1426-500LB et suyu değirmen tozu 500 g
Mineral yağAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific31911-A1
NanoDrop 2000/2000C SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-2000C
Nanoject III Programlanabilir Nanolitre EnjektörDrummond3-000-207
Dar Drosophila Şişeleri, PolistirenGenesee Scientific32-109
İğneler, hipodermikVWR89219-31622 G, 25 mm
Yeni Nesil Mikropipet ÇektirmeDünyası Hassas AletlerSU-P1000
PBSVWR97062-732Tampon PBS tabletleri biyoteknoloji sınıfı 200tab
PrizmaGraphPadSürüm 8
Şırıngalar - plastik, tek kullanımlıkVWR76124-65220 mL
Tripan MaviSigma-AldrichT8154

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
  2. Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
  3. Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
  4. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372(2019).
  5. Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
  6. Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214(2020).
  7. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  8. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  9. Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084(2019).
  10. Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615(2021).
  11. Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
  12. Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724(2017).
  13. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
  14. Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210(2020).
  15. Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
  16. Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
  17. Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
  18. Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81(2015).
  19. Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
  20. Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676(2021).
  21. Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
  22. Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
  23. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101(2007).
  24. Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
  25. Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644(2013).
  26. Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16(2016).
  27. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila Larva EnjeksiyonuDo al Ba kl kPatojen Vir lansMikroenjeksiyon Tekni iMeyve Sine i ModeliBakteriyel Enfeksiyonnc D nem LarvalarRinger Sol syonuHemolenf S z nt sPetri Kab

İlgili makaleler