Tam embriyo kültürü için geliştirilmiş bir platform, pregastrülasyon aşamalarından ileri organogenezine kadar altı güne kadar postimplantasyon fare embriyolarının sürekli ve sağlam ekstre gelişimini sağlar. Bu protokolde statik plakalar ve dönen şişe sistemleri kullanılarak başarılı embriyo kültürü için standart prosedürü detaylandırıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ex Utero Pregastrülasyondan İleri Organogenez'e Fare Embriyolarının Kültürü
Bu makalede
Özet
Özet
Postimplantasyon memeli embriyo kültürü yöntemleri genellikle verimsiz ve rahim dışı diseksiyon sonrası kısa sürelerle sınırlı olmuştur. Platformlar son zamanlarda yumurta silindir aşamalarından ileri organogenez kadar fare embriyolarının son derece sağlam ve uzun süreli ex utero kültürü için geliştirilmiştir. Bu platformlar, öngaztasyon embriyolarının (E5.5) arka ekstremite oluşum aşamasına (E11) kadar uygun ve sadık gelişimini sağlar. Geç gastrulating embriyoları (E7.5) bu ortamlarda dönen şişelerde yetiştirilirken, pregastrülasyon aşamalarından (E5.5 veya E6.5) genişletilmiş kültür statik ve dönen şişe kültürlerinin bir kombinasyonunu gerektirir. Ek olarak, O2 ve CO2 konsantrasyonunun hassas düzenlenmesi, gaz basıncı, glikoz seviyeleri ve belirli bir ex utero kültür ortamının kullanımı uygun embriyo gelişimi için kritik öneme sahiptir. Burada, genişletilmiş ex utero fare embriyo kültürü için ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Normal fare embriyolarının gastrülasyondan organogeneze kadar ekstresini yetiştirme yeteneği, embriyonik gelişim sırasında farklı deneysel pertürbasyonların etkisini karakterize etmek için değerli bir aracı temsil eder.
Giriş
Memeli embriyosunun intrauterin gelişimi postimplantasyon gelişiminin erken evrelerinin incelenmesini sınırlamıştır1,2. Gelişmekte olan embriyonun erişilemezliği, embriyo uterusa implante ettikten sonra meydana gelen hayvan vücut planının oluşturulması, mikrop katmanlarının belirtimi veya doku ve organların oluşumu gibi temel gelişimsel süreçlerin anlaşılmasını engeller. Ayrıca erken postimplane embriyonun çok küçük olması E103 öncesi rahim içi görüntüleme ile gözlem yapmayı zorlaştırır. Bu aşamalarda canlı embriyoların gözlemlenememesi ve manipüle edilmesi, erken postimplantas....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Weizmann Bilim Enstitüsü Hayvan Koruma Yönergelerine göre gerçeklendi ve ilgili Weizmann Enstitüsü IACUC tarafından onaylandı (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Sağlıklı hamile kadınlardan, Rambam Tıp Merkezi Helsinki Komitesi (#RMB-0452-15) tarafından onaylandığı gibi göbek kordonlarından kan toplamak için bilgilendirilmiş onay vermeleri istendi. Sağlıklı yetişkinlerden, Weizmann Bilim Enstitüsü Helsinki Komitesi'nin (#1566-3) yönergelerine göre kan toplanması için bilgilendirilmiş onayları istendi.
1. Medya hazırlığı
- Diseksiyon ortamını, %10 fetal sığır serumu, 5 mL penisilin/streptomisi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
E7.5 embriyoları için tanımlanan silindir kültürü koşulları (geç gastrülasyon evresi) 4 kültür gününden sonra ortalama u'e yakın verimle sabit ve normal embriyo büyümesini destekler (Şekil 2 ve Tablo 1). Embriyo gelişiminin verimliliği çeşitli fare genetik geçmişlerine göre değişebilir, ancak sürekli olarak sağlamdır (Şekil 2C). HCS yerine HBS ile takviye, farelerin genetik arka planına bağlı olarak 4 günlük ex utero kültüründen sonra ~.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan kültür protokolü, E5.5'ten E11'e kadar altı güne kadar uygun ve sürekli fare embriyosu geliştirme ex uterosunu sürdürebilir. Daha önce, bu gelişim aşamalarında embriyolar kültürde sadece kısa süreler için (48 saate kadar) normal olarak gelişebilirdi 15. Gaz regülasyon modülünün oksijen konsantrasyonunun ve hiperbarik gaz basıncının hassas kontrolü için silindir kültürü inkübatörüne kaplanması, burada açıklanan uygun fare embriyo kültürü için kritik öneme sahiptir. Gaz basın.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
J.H.H, Biological Industries Ltd'nin danışmanıdır ve burada açıklanan silindir ve statik kültür koşullarını kapsayan bir patent başvurusunda bulunmuştur (J.H.H. ve Weizmann Bilim Enstitüsü tarafından yapılmıştır). Diğer yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma Pascal ve Ilana Mantoux tarafından finanse edildi; Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Konseyi (FAMRI); İsrail Kanser Araştırma Fonu (ICRF) profesörlüğü, BSF, Helen ve Martin Kimmel Kök Hücre Araştırmaları Enstitüsü, Helen ve Martin Kimmel Yenilikçi Araştırma Ödülü; İsrail Bilim Vakfı (ISF), Minerva, Sherman Tıbbi Kimya Enstitüsü, Nella ve Leon Benoziyo Nörolojik Hastalıklar Merkezi, David ve Fela Shapell Genetik Bozukluklar Araştırma Merkezi, Kekst Aile Tıbbi Genetik Enstitüsü, Dr. Beth Rom-Rymer Kök Hücre Araştırma Fonu, Edmond de Rothschild Vakıfları, Zantker Hayır Kurumu, Zvia Zeroni Mülkü.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 ve mikro; m gözenek boyutu filtresi (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 & mikro; m gözenek boyutu şırınga PVDF filtresi | Millipore | SLGV033RS | |
| 8 kuyulu ve mikro;-plakalar cam alt/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Gaz girişi için adaptör kapaklı şişe | Arad Technologies | ||
| Bungs (Delik) | B.T.C. Mühendislik, Cullum Starr Hassas Mühendislik | BTC 06 | Şişeleri tambura kapatmak için kullanılır |
| Bungs (Katı) | B.T.C. Mühendislik, Cullum Starr Hassas Mühendislik | BTC 07 | Dönen tamburu kapatmak için kullanılır |
| Kültür şişeleri | B.T.C. Mühendislik, Cullum Starr Hassas Mühendislik | BTC 03/BTC 04 | Cam Şişeler (Küçük) BTC 03 veya Cam Şişeler (Büyük) BTC 04 |
| D (+) - glikoz Monohidrat | J.T. Baker | ||
| Elmas bıçak | Güzel Bilim Araçları | 10100-30/45 | |
| Dijital Basınç Göstergesi | Şangay Benxu Elektronik Teknolojisi co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu | Suyu Biyolojik endüstriler | 02-020-1A | |
| Fetal Sığır Serumu | Biyolojik endüstriler | 04-013-1A | |
| Gaz düzenleme modülü | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamin |
| Graefe forseps | Güzel Bilim Araçları | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Mikrocerrahi forseps (Dumont #5, #55) | Güzel Bilim Araçları | 11255-20 | |
| Pasteur pipetleri (cam) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipetleri (plastik) | Alexred | SO P12201 | |
| Penisilin / Streptomisin | Biyolojik endüstriler | 03-031-1B | |
| Petri Kapları (60 mm ve 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Hassas inkübatör sistemi | B.T.C. Mühendislik, Cullum Starr Hassas Mühendislik | BTC01 | gaz fıskiye kitli BTC01 modeli |
| Pro-koagülan steril test tüpleri (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Sıçan tüm embriyo kültürü serumu | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Isıtma plakası ile donatılmış stereoskopik mikroskop | Nikon | SMZ18 | |
| Sera filtrasyonu için steril şırıngalar (5, 10 ml) | Pic Solution | ||
| Cerrahi makas | Güzel Bilim Araçları | 14094-11 |
Kaynaklar
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
