Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) türevi modeller, hayvan çalışmaları için belirlenen 3Rs hedeflerine (Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme) umut verici bir çözüm olarak kabul edilir ^1,2. iPSC türevi kardiyomiyositler, insan biyolojisinin temel yönlerini özetledikleri için hastalık modellemesi ve ilaç keşfi için kullanılmıştır³. Kalsiyum görüntüleme, tipik olarak kimyasal boyalarla, ilaç tedavisinden önce ve sonra hücresel aktiviteyi gözlemlemek için kullanılmıştır ^4,5. Bununla birlikte, kimyasal boya bazlı kalsiyum algılayıcı problar Na, K-ATPaz'ı doğrudan inhibe eder ve hücresel fonksiyonu bozar⁶. Bu nedenle, aynı hücrelerin saatler veya günler boyunca izlenmesi, kimyasal boyalar kullanıldığında sorunlu olmuştur. Burada, genetik olarak kodlanmış bir dizi kalsiyum göstergesi (GECI) ^7,8,9,10, uzun süreler boyunca gerçek zamanlı çoklu organel ölçümleri sunan bir kardiyak toksisite test platformu oluşturmak için geniş bir uyarma / emisyon ve kalsiyum afinite spektrumunda kullanılmaktadır ¹¹.

iPSC-CM modelindeki yüksek verimli kalsiyum bazlı tarama konseptini, kırmızıya kaymış bir kalsiyum göstergesinin birlikte ekspresyonu ile optik kontrol ve kalsiyum görüntüleme için genetik olarak kodlanmış araçlar kullanarak daha önce gösterilen akademik bağlamın ötesinde daha da geliştirmek için, R-GECO veya K-GECO, optogenetik bir araç olan ChR2^12,13, kullanıma hazır viral kitler üretilmiştir. Görüntülemeyi oto-mikroakışkan bir sistemle donatılmış yüksek içerikli bir cihaza dönüştürerek, bileşik ilavesinin tek kanallı pipetlenmesi, canlı hücre görüntülemenin üzerine katmanlanır. Son olarak, deneysel yolun her iki önemli yönü, görüntü işleme ve analiz de geliştirildi ve otomatikleştirildi.

Sol ventrikül non-kompaksiyonlu kardiyomiyopati (LVNC) hastası iPSC kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CM) Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi tarafından sağlandı. iPSC'ye yeniden programlamak için hasta örneklerinin toplanması ve araştırma amaçlı bakım protokolleri¹⁴ , WMA Helsinki Deklarasyonu'nu (insan denekleri içeren tıbbi araştırmalar için etik ilkeler) takip etti ve Kurumsal İnceleme Kurulu: NTUH'deki Araştırma Etik Komitesi Ofisi (#201612099RINC) tarafından onaylandı. Diğer iPSC-CM'ler ticari satıcılardan temin edildi. iPSC türevlerinin kullanımı kurumumuzda belirli izinler gerektirmez.

1. iPSC türevi kardiyomiyositlerin hazırlanması

1. iPSC-CM çözülmek üzere soğuk hava deposundan çıkarılmadan önce çok kuyulu plakayı hazırlayın. 96 delikli mikro plakanın her bir oluğunu, tüm yüzeyleri iyice kaplamak için 100 μL 50 μg / mL fibronektin / % 0.2 jelatin çözeltisi ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. Hücre çözülmeden önce ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığına 30 dakika ısıtın.
   NOT: Mevcut protokol oda sıcaklığını 25 °C olarak tanımlamaktadır.
4. iPSC-CM'yi sıvı azot depolama tankından 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın.
   NOT: iPS-CM'ler genellikle akademik veya ticari kaynaklar tarafından kuru buz üzerinde gönderilir. Alındıktan sonra kullanıma kadar sıvı azot deposuna aktarılırlar.
5. Buz tamamen erimeden önce şişeyi çıkarın ve% 75 etanol ile şişeyi püskürtün.
6. Şişeyi bir Sınıf II biyogüvenlik kabinine alın ve içeriği 9 mL oda sıcaklığında ortam içeren yeni bir 15 mL konik tüpe yavaşça aktarın.
7. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
8. Süpernatantı pipetle atın ve hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü (Y27632) ile 1 mL ortamda yavaşça yeniden askıya alın (bkz.
   NOT: Maksimum hücre geri kazanımı sağlamak için çözülmüş hücrelerin tekrar tekrar pipetlenmesinden kaçının.
9. Kaplama çözeltisini kuyudan çıkarın ve hızlı bir şekilde 10 μM ROCK inhibitörü ile 50 μL ortam ekleyin.
10. Bir hemositometre¹⁵ ile tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücrelerin sayısını onaylayın.
11. Üreticinin talimatlarına göre 100.000-150.000 hücre /^cm2 yoğunlukta kaplanmış 96 delikli plakadaki plaka hücreleri¹⁶.
12. 24 saat sonra, plakanın yüzeyine tutturulmuş hücrelerin diğer hücrelerle temas halinde olduğundan emin olun.
    NOT: Tek hücreler uzun süreli kültürde zayıf bir şekilde hayatta kalır ve tipik olarak daha değişken davranırlar.
13. Önceden ısıtılmış bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.
    NOT: Uzun süreli ilaç tedavisi için, LVNC iPSC-CM, her 2 günde bir küçük moleküllü ilaçlarla veya küçük moleküllü ilaçlar olmadan yarım orta replasmanlarla değiştirildi.

2. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin ekspresyonu

1. Hücreleri 72 saat boyunca kapladıktan sonra, GECI'nin viral kitlerini ( bakınız Malzeme Tablosu) buz üzerinde çözün.
2. Bakım ortamı ile 2x viral kit stok çözümü hazırlayın.
3. Orta hacmi kuyucuk başına 100 μL'ye ayarlayarak hücreleri enfeksiyona hazırlayın. Önceden karıştırılmış viral çözeltiden 100 μL ekleyin ve 37 ° C'de 8-16 saat boyunca inkübe edin.
4. Kuluçkadan sonra 200 μL önceden ısıtılmış ortam ile değiştirin.
5. GECI'lerin transdüksiyon sonrası 24 saat ifadesini bir görüntüleme sistemi kullanarak görselleştirin (bkz.
   NOT: İfade düzeyi, iletim sonrası 48-72 saatte maksimuma ulaşır. Hücreler 24 saatlik zaman noktasından görüntülenebilir. Bununla birlikte, GECI'lerden elde edilen sinyaller bir aydan fazla sürer.
6. Fonksiyonel testler yapılmadan önce nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri koruyun.
7. iPSC-CM'leri (LVNC hasta kaynaklı iPSC-CM'ler) ChR2-K-GECO viral kiti ile enfekte edin (bakınız Malzeme Tablosu) enfeksiyon protokolünü kullanarak farklılaşma sonrası 25. günde (adım 2.1-2.6).

3. Fluo-4 kullanarak boya bazlı kalsiyum görüntüleme

1. Fluo-4 tozunu (bakınız Malzeme Tablosu) DMSO'da bir stok çözeltisi (5 mM) olarak çözün.
2. Stok çözeltisini Tyrode tamponunda 10 μM Fluo-4 konsantrasyonuna kadar seyreltin.
   NOT: Tirod tamponu 1.0 g / L sodyum bikarbonat, 0.2 g / L kalsiyum klorür, 0.1 g / L magnezyum klorür, 0.2 g / L potasyum klorür, 8.0 g / L sodyum klorür, 0.05 g / L sodyum fosfat monobazik ve 1.0 g / L D-glikozdan oluşur.
3. Yarım ortamı 10 μM Fluo-4 çözeltisi ile değiştirin (5 μM'lik bir nihai konsantrasyon verir).
4. Hücreleri 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
5. Hücreleri önceden ısıtılmış Tyrode tamponuyla yıkayın ve görüntü almadan önce ortamla değiştirin.
6. Akış alma protokolüyle kayda başlayın.
   NOT: Akış alımı, aralık süresi olmadan sürekli olarak görüntü elde etmektir. iPSC-CM'nin atma frekansı yaklaşık 1 Hz'dir ve bu akış edinme protokolü dayak modellerini toplamak için kullanılır.

4. Toksisite testi ve fenotipik tarama için görüntü toplama ve fonksiyonel testler

1. Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi'nin tüm cihazlarını açın (bkz.
2. Oda sıcaklığının% 5 CO₂ takviyesi ile 37 ° C'ye ulaştığını doğrulayın. Görüntü yakalamadan önce sistemi 2 saat boyunca dengede tutun.
   NOT: Termal sürüklenme, uzun süreli canlı hücre gözlemleri için önemli bir sorundur, 1 ° C, odak düzlemini ~ 1 μm değiştirebilir, bu nedenle lensin ve sahnenin hedef sıcaklığa ulaşmasına izin vermek görüntü elde etmeden önce çok önemlidir.
3. Görüntüleme yazılımını açın (bkz . Malzeme Tablosu) ve 96 delikli bir plaka için plaka ayarını seçin.
4. Odaya kapaksız 96 delikli bir plaka yerleştirin ve üstüne canlı hücre sızdırmazlık halkası ile yükleyin.
   NOT: Canlı hücre sızdırmazlık halkası, çevresel dengeye ulaşmak için kullanılan bir adaptördür.
5. Gerekli uzamsal çözünürlüğe göre 20x (Şekil 1 ve Şekil 2), 60x (Şekil 3 ve Şekil 4) ve 20x (Şekil 5) suya daldırma objektif lensini seçin.
6. Deneysel elde etmeden önce net görüntüler çekmek için odağı ayarlayın.
7. Kalsiyum aktivitesi kaydı için kuyu başına rastgele 3-5 bölge seçin.
   NOT: Her bölge en az 20 hücre içermelidir (n ≥ 20).
8. Farklı göstergeler için uygun filtreleri seçin. mNG-GECO, mtGCEPIA3 ve Oria1-G-GECO için FITC 475/536; NIR-GECO2 için Cy5 631/692; ER-LAR-GECO IÇIN ER 530/593; K-GECO için Texas Red 560/624.
9. Kullanılan her görüntüleme kanalı için uygun ışık yayan diyot (LED) gücünü ayarlayın.
   NOT: LED gücünü, sinyal (nesnenin algılanan yoğunluğu) ile gürültü (arka planın algılanan yoğunluğu) oranıyla görüntüleme elde etmek için optimize ederken, S/N oranı 2'den yüksek olmalıdır. Bu protokolde TRITC ve FITC için %10 LED gücü; Cy5 için% 20 tipikti.
10. Kardiyomiyositlerde eksprese edilen mNG-GECO ve K-GECO probları tarafından bildirilen kalsiyum geçicilerini gözlemlemek için kamera pozlama süresini maksimum 40 ms (25 Hz) ve 30 sfor stream edinimi kayıt süresine ayarlayın (Şekil 1-3 ve Şekil 5). Sinyal/gürültü daha yüksek kare hızlarında <2 ise LED gücünü artırın.
11. Optogenetik stimülasyon için (Şekil 2 ve Şekil 3C, D), 1 Hz'de mavi ışığın gücünü (tipik olarak% 5-10) ve frekansını optimize edin.
    NOT: Genel olarak, insan iPSC-CM'si ~ 1 Hz civarında kendiliğinden atar ve operatörün kendiliğinden hızdan daha hızlı adım atması gerekir.
12. Sıralı (Şekil 3) veya genişletilmiş (Şekil 4) ölçümler planlanıyorsa, ne pahasına olursa olsun fototoksisiteden kaçının. Bu, aydınlatma gücü yoğunluğunu azaltmak ve kamera pozlama süresini, örneğin hücre altı Ca²⁺ sinyallerinin üç kanallı gerçek zamanlı gözlemi için kullanılan hızlandırılmış protokolle 100 ms'ye çıkararak bunu telafi etmek anlamına gelebilir (Şekil 4).
13. Otomatik mikroakışkanlar sistemi aracılığıyla 10 mM kafein ilavesi için asenkron dağıtım protokolünü kullanın (bkz.
    NOT: Asenkron dağıtım protokolü, kafein gibi ilaçlar eklenirken, görüntüler arasında boşluk olmadan görüntü elde etmenin gerçekleşmesine izin verir.
14. Satın almaya başlayın.

5. Küçük molekül hazırlama

1. DMSO'da E4031, dofetilide ve verapamil'i yeniden askıya alın ve Tyrode tamponuyla seyreltin. DMSO'nun ortamdaki son konsantrasyonu %0.1 (v/v) idi.
2. Bileşik çözeltileri, istenen çalışma konsantrasyonunun iki katında (yani 2x) hazırlayın ve eklemeden önce 37 ° C'de dengeleyin.
   NOT: Orta ilaveyi takiben sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek, kontraktilitenin sıcaklığa bağlı olması ve değişen sıcaklığın etkisinin hızlı olması nedeniyle hayati önem taşır.
3. Bileşikleri karşılık gelen hedefe iyi yerleştirin.
4. Otomatik mikroakışkan sistemi aracılığıyla çift mukavemetli (2x) bileşiklerin 100 μL'sini kuyucuklara ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve istenen (tipik olarak 15 dakika) inkübasyon süresinden sonra edinime başlayın.

6. Görüntüleme işleme ve analizi

1. Yazılım ile zaman devrimi boyunca darbenin özelliğini otomatik olarak algılayarak sinyal alanını arka plandan izole edin.
2. Vuruş sıklığını (BPM), Tepe sinyalini (Genlik), Kalsiyum geçici süresi% 50 (CTD50), Kalsiyum geçici süresi% 90 (CTD90), yükselme süresini ve bozunma süresini (Şekil 1C) analiz etmek için Kalsiyum pik analiz yazılımını (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
   NOT: Bu ayarlarda, fotobeyazlatma ilk 10 sn üzerinde belirgindi ve sinyaller bundan sonra stabilize edildi. Böylece, kalsiyum zirvesi 11-30 s'den analiz edildi. Üç kanallı kayıtlarda (Şekil 4), hücre konturu yoğunluk değişimini ölçmek için manuel olarak sınırlanmıştır.

İlaç tedavileri olsun veya olmasın, iPSC kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CM'ler) tarafından eksprese edilen mNG-GECO10'daki spontan kalsiyum salınımının gözlemlenmesi Şekil 1 ve Animasyonlu Video 1'de gösterilmiştir. mNG-GECO kullanılarak elde edilen kinetik izler, küçük moleküler iyon kanalı inhibitörleri verapamil, dofetilit ve E4031'in kalsiyum geçicilerini beklendiği gibi etkilediğini göstermektedir (Şekil 1B). Şekil 1C'de gösterilen tipik kalsiyum geçicisi, Peak sinyali (Genlik), Kalsiyum geçici süresi% 50 (CTD50), Kalsiyum geçici süresi% 90 (CTD90), yükselme süresi ve bozunma süresi elde etmek için Kalsiyum pik analiz yazılımı ile analiz edilebilir. L-tipi bir kalsiyum blokeri17 olan Verapamil, hücrelerdeki kalsiyum akışını beklendiği gibi tamamen inhibe eder (Şekil 1B). Dofetilide ve E4031, deneysel sınıf III antiaritmik ilaçlar olarak listelenen hERG kanal inhibitörleri 18,19,20'dir. Bozunma süresi, araç grubuyla karşılaştırıldığında hem Dofetilide (p < 0.05) hem de E4031 tedavisi (p < 0.001) ile uzar. CTD50 (p < 0.01) ve CTD90'ın (p < 0.001) E4031 tedavisi ile uzaması, sadece araçla karşılaştırıldığında gözlenmiştir (Tablo 1), bu sonuçlar, Q-dalgasının başlangıcı ile T dalgasının sonu arasındaki uzun bir süre boyunca yüzey elektrokardiyogramından belirlenen klinik olarak ilgili bir repolarizasyon ölçümü olan QT aralığı üzerinde bildirilen etkilerle tutarlıdır. önceki çalışmalarda 12,21.

Spontan dövülen hücrelerde CTD değerlendirmesinin zorluğu, CTD'ye dayatılan değişkenlik atış hızıdır. Bu, iPSC-CM modeli için özel bir sorundur; burada 96 kuyu plakasının her bir kuyusu, tüm hücreler aynı ana şişeden gelse bile kendi vuruş hızına sahip olabilir. Optik veya elektriksel hız ile bir vuruş hızı empoze etmek mümkündür. E4031'in doz-yanıtını standartlaştırılmış tempolu koşullar altında değerlendirmek için, iPSC-CM'leri ifade eden ChR2 ve K-GECO7, 1 Hz 470 nm ışık darbesi kullanılarak optik olarak kontrol edildi ve kırmızı K-GECO sinyali kullanılarak gözlemlendi (Şekil 2A ve Ek Şekil 1). Kalsiyum geçicilerinin pik genliğinde ilerleyici azalmalar (p < 0.01) ve çürüme süresinde artış (p < 0.05) artan E4031 konsantrasyonları ile ortaya çıkar (Şekil 2B1). E4031'in doza bağımlı etkisi, pik genlikteki azalmalar için en belirgin olanıydı (Şekil 2B1, B2).

Dakikalar süren kısa süreli çalışmalar tipik olarak kardiyotoksisite değerlendirmeleri için kullanılsa da, kronik toksisite değerlendirmeleri için hastanın haftalar, aylar veya yıllar boyunca ilaçlara maruz kalmasına paralel olarak kör bir nokta vardır. Klinik uygulama ile ilgili tedavi sürelerini yansıtan aralıklar boyunca hastalık veya toksisite etkilerini incelemek avantajlı olacaktır. Sol ventrikül sıkıştırmasız (LVNC) olan bir hastadan iPSC türevi kardiyomiyositleri incelemek için tamamen optik kontrol ve algılama sistemimizi kullandık. iPSC-CM'ler, farklılaşma Günü 25. Günden sonra bir K-GECO viral kiti (adım 2.2-2.6) ile dönüştürüldü. K-GECO sinyali daha sonra her 1-2 haftada bir, ek ilaç tedavileri olsun veya olmasın, aynı kuyucuklarda izlendi. Hem spontan kalsiyum aktivitesi (Şekil 3A,3B) hem de optik pacing altındaki kalsiyum dinamiği (Şekil 3C,D, adım 4.11) yüksek içerikli Görüntüleme Sistemi (adım 4.1-4.12) kullanılarak elde edilmiş ve kalsiyum tepe analiz yazılımı (adım 6) ile işlenmiştir. Şekil 3A, C'de gösterildiği gibi, berrak kalsiyum geçicileri, viral transdüksiyondan bir ay sonra, optik pacing için kullanılan ek ışıkla veya ışık olmadan görünür kalır. Bu çalışma, LVNC iPSC-CM modelinde atım hızını arttıran, kasılma aralığını düzenleyen ve geçici kalsiyum genliğini artıran bir ilacı tanımlamıştır (Şekil 3A, B). Bu verilerden yapılacak iki önemli gözlem vardır. İlk olarak, terapötik perspektiften bakıldığında, ilaç etkisi Gün 63 ve Gün 70 zaman noktalarında dayanıklı görünmektedir. İkincisi ve genel olarak kısa pencereler (<1 dakika) sırasında daha önceki zaman noktalarında (tipik olarak <50 gün) bileşik etkileri tahlil eden bir alanla ilgilidir; Bileşiğin hastalık fenotipi modifiye edici etkileri ancak 60. günden sonra belirgindir, bu da standart tarama protokollerinde yavaş etki mekanizmalarına sahip ilaçların indirgenmesinin kolay olabileceğini düşündürmektedir.

Vuruş frekansının değişkenliği ve ardından kalsiyum geçici süresi üzerindeki etkisi, herhangi bir zaman noktasında sadece iyiden iyiye bir problem değildir. Aynı zamanda iPSC-CM kültürde muhafaza edildikçe de değişir, bu da zamanla bir kuyu içinde değişir (Şekil 3B). Sıralı deneylerde tutarlılık sağlamak için, ilaç tedavisi ile veya ilaç tedavisi olmadan 1 Hz optik pacing uygulanabilir (Şekil 3C, D). Burada, Gün 63 sonuçları, kalsiyum geçicisinde önemli ölçüde daha yüksek genlik, daha kısa CTD90 ve daha kısa bozunma süresi ile cesaret verici eğilimler göstermesine rağmen; 70 günlük zaman dilimine göre - ve nadir hastalıklar için ilaç tarama sürecinde kronik değerlendirmelere duyulan ihtiyacın göstergesi - depolarizasyonlardan (EAD) sonra erken tespit edilir. Hastalık fenotiplemesine veya küçük molekül değerlendirmesine bir pacing protokolü eklemenin değeri, Şekil 3B, D'de beat hızı, kalsiyum geçici genliği, CTD90 ve bozunma süresi için sunulan sonuçların karşılaştırılmasıyla nitel olarak değerlendirilebilir.

Bir GECI'nin, kalsiyum geçicisini görselleştirmek için kimyasal boyaya kıyasla, metodolojiye dayalı bir avantajı, probu bir hücre içindeki belirli bir bölmeyle sınırlama yeteneğidir. Bu, tek hücrelerde birden fazla renk ve / veya afinite varyantını çoğaltarak daha da genişletilebilir. Bu nedenle, sırasıyla endoplazmik retikulum / sarkoplazmik retikulum (ER / SR), mitokondri (veya CRAC kanalı) ve sitozolde ortaya çıkan gerçek zamanlı kalsiyum aktivitesi ölçümü için hücre modellerinde ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (veya Oria1-G-GECO) ve NIR-GECO2 8,24 dahil olmak üzere çeşitli GECI'ler geliştirilmiştir. Farklı hücre içi kalsiyum depoları arasındaki etkileşimi incelemek için iPSC-CM modelinde (Şekil 4A, C) birleştirilebilirler. Örneğin, SR kalsiyum deposunu boşaltmak için 10 mM kafein tedavisi kullanılabilir. Burada ER-LAR-GECO sinyalinin azalması (SR'den kalsiyum kaybının göstergesi), beklendiği gibi NIR-GECO sinyalinin (sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki artışın göstergesi) düşüşüne paraleldir. Diğer hücre içi bölmelerin bu dalgalanmalardan nasıl etkilendiği iyi çalışılmamıştır. Yine de, yeşil bir mitokondriyal hedefli mtGCEPIA3'ün dahil edilmesi, bu koşullarda mitokondride kalsiyum alımının meydana geldiğini göstermektedir (Şekil 4A, B).

Benzer şekilde, farklı kalsiyum akımları arasındaki etkileşimin görselleştirilmesi, kalsiyum salınımıyla aktive edilen kanal (CRAC) Ca 2+ akımını ortaya çıkarmak için bir prob olan Orai1-G-GECO25'in dahil edilmesiyle görülebilir (Şekil 4C, D). iPSC-CM modelinde bu sinyal spontan sitozolik kalsiyum geçici ile artar (Şekil 4D1,D2). Buna uygun olarak, kafein ile tedavi hem sitosolde hem de Orai1 kanalından büyük bir kalsiyum geçici uyarır.

Kardiyomiyosit modellerinde kalsiyum geçici görüntülemenin çoğunun kalsiyum boyaları kullanılarak belirlendiği kabul edilmektedir26. Genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi, farklı kalsiyum görüntüleme yaklaşımlarının yan yana karşılaştırılmasını sağlamak için iPSC türevi kardiyomiyosit modelindeki kimyasal bir boya ile karşılaştırıldı. iPSC-CM'leri eksprese eden K-GECO, Fluo-4 yüklü hücrelerle birlikte görüntülendi. Kardiyomiyositleri eksprese eden K-GECO zaman içinde tutarlı dayak davranışı göstermiştir (Şekil 5A,C). Bununla birlikte, Fluo-4 yüklemesi bu modelde hem vuruş frekansını hem de CTD'yi etkilemiştir (Şekil 5B, C), Fluo-4'ün kendisinin bu tür deneylerin sonuçlarını etkileyebileceğini düşündürmektedir. Bu, özellikle görüntüleme probuna uzun süre maruz kaldıktan sonra geçerli olacaktır; bu, kuyu başına bir dakikalık bekleme süresiyle iyi görüntüleme gerçekleşirse, çok duvarlı görüntüleme formatında ortaya çıkabilir.

Şekil 1: iPSC türevi kardiyomiyositlere uygulanan küçük moleküllü iyon kanalı inhibitörleri. (A-B) IPSC-CM'nin mNG-GECO'yu eksprese eden hızlandırılmış görüntüleri 25 Hz. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Bileşik ilavesinden sonra temsili Ca2+ salınımları. mNG-GECO eksprese eden hücrelerden elde edilen floresan sinyalleri, F0'ın bazal yoğunluk ve F'nin her zaman noktasında tespit edilen yoğunluk olarak tanımlandığı bir floresan oranı F / F0 olarak sunulur. (C

LumiSTAR, K-GECO, NIR-GECO ve LAR-GECO kullanımının patent koruması için başvuruda bulunmuştur.