Yöntem makalesi

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

DOI:

10.3791/63177

⸱

21 Aralık 2021

 ,  , 
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken gelişim, zigotik genom aktivasyonuna kadar gelişim için gerekli tüm hücresel fonksiyonları yerine getiren oogenez sırasında matür oosite dahil edilen maternal faktörlerin bir havuzuna bağlıdır. Tipik olarak, bu maternal faktörlerin genetik olarak hedeflenmesi, annelik etkisi fenotiplerini tanımlamak için ek bir nesil gerektirir ve bu da gelişim sırasında maternal olarak eksprese edilen genlerin rolünü belirleme yeteneğini engeller. CRISPR-Cas9'un bialelik düzenleme yeteneklerinin keşfi, enjekte edilen embriyoların veya "gevreklerin" somatik dokularındaki embriyonik fenotiplerin taranmasına izin vererek, zigotik olarak eksprese edilen genlerin gelişim programlarında oynadığı rolün anlaşılmasını arttırmıştır. Bu makalede, crispant yönteminin bir uzantısı olan bir protokol açıklanır. Bu yöntemde, germ hücrelerinin bialelik düzenlenmesi, tek bir nesilde veya "maternal gevrekler" de maternal etkili bir fenotipin izolasyonuna izin verir. RNA'ları tek bir hedefe multipleks etmek, maternal gevreklerin verimli üretimini teşvik ederken, maternal gevrek haploidlerin sekans analizi, maternal etkili bir fenotip üreten genetik lezyonları doğrulamak için basit bir yöntem sağlar. Maternal gevreklerin kullanımı, annelik tarafından ifade edilen temel genlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını destekler, böylece erken gelişimin anlaşılmasını kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maternal olarak biriken ürünlerden oluşan bir havuz (örneğin, RNA'lar, proteinler ve diğer biyomoleküller), embriyonun zigotik genomu aktive edilene kadar tüm erken hücresel süreçler için gereklidir1. Bu ürünlerin oositten erken tükenmesi tipik olarak embriyonik öldürücüdür. Bu genlerin gelişimdeki önemine rağmen, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü şu anda bilinmemektedir. Zebra balıklarında CRISPR-Cas9 gibi gen düzenleme teknolojisindeki ilerleme, anne tarafından eksprese edilen genlerinhedeflenmesini sağlar 2,3,4. Bununla birlikte, bir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün geliştirilmesine yol açan çalışmalarda, tüm zebra balığı barınma ve deneyleri Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC-M005268-R2) tarafından onaylanmıştır.

1. Kılavuz RNA'ların Sentezi

NOT: Zigotik gevrekler, tek bir kılavuz RNA kullanılarak veya çoklu kılavuz RNA'ları tek bir hedefe 5,6,7,8,9,10 olarak çoğaltarak oluşturulmuştur. Kılavuz RNA'lar....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşım, maternal etki fenotiplerinin hızlı, kaynak verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlar (Şekil 1).

Maternal gevrekliklerin üretilmesi:
Dört kılavuz RNA'yı tek bir aday anne-etki genini hedefleyecek şekilde tasarlarken, kılavuz RNA'ların DNA'ya bağlanacağı yere özel dikkat gösterilmelidir. Genel olarak, hepsi ilk tahmin edilen protein alanının başlangıcında kılavuz RNA'lar arasında en az örtüşen bölgeler v.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede sunulan protokol, hem ileri hem de geri genetik teknikler için gerekli olan çoklu nesiller yerine, tek bir nesilde bir anne-etkili fenotipin tanımlanmasına ve birincil moleküler karakterizasyonuna izin vermektedir. Şu anda, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü bilinmemektedir. Bu bilgi eksikliği kısmen, anne-etki genlerini tanımlarken bir fenotipi görselleştirmek için gereken ekstra üretimden kaynaklanmaktadır. Geçmişte, zebra balığında anne-etkisi genlerinin hızlı bir şekilde tanımlanması, trans.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçmişteki ve şu anki Pelegri laboratuvarı hayvancılık personeline su tesislerine gösterdikleri özen için teşekkür ederiz. Ayrıca Ryan Trevena ve Diane Hanson tarafından el yazması hakkındaki yorumlar ve içgörüler için minnettarız. Finansman F.P.'ye NIH hibesi ile sağlandı (GM065303)

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M Tris-HCl (pH 8.4)Invirogen15568025PCR karışımı için
1.5 mL Eppendorf TüpleriHerhangi Bir Yapıcı
10 mM dNTP'lerThermo Fischer Bilimsel18427013gRNA
100 BP merdiveniJel elektroforezi içinHerhangi Bir Yapıcı
%100 RNAse içermeyen etanolHerhangi Bir Yapıcı
%100 RNAse ücretsiz etanolHerhangi Bir Yapıcı
100ml BeherIVF içinHerhangi Bir Yapıcı
5 M Amonyum AccetateThermo Fischer BilimselMEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kitinde BulundugRNA Sentezi
% 70 etanolgRNA sentezi (70 mL etanol + 30 mL   nükleaz içermeyen su)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm IDFHC INC27-30-1Mikroenjeksiyon
Toplu İlaç için Sodyum Bikarbonat 35 poundToplu Resif Kaynağı255Balık malzemeleri
CaCl2MiliporeSigmaC7902
Cas9 Proteini, NLS'liPNABioCP01
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
Sabit oligonükleotidEntegre DNA Teknolojiler (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
Tüp
içinDepresyon CamPlaka Thermo Fischer Scientific13-748B
Tüp Bebek Diseksiyon ForsepsDumontSS
Tüp
Bebek için Diseksiyon Makası Güzel Bilim Araçları 14091-09Diseksiyon Steroskopu (iletilen ışık kaynağı ile)IVFHerhangi Bir Yapıcı
Yoğunlaştırıcı -5Zymo ResearchD4014gRNA DNA Jel Yükleme Boyasının Sentezi
(6x)Jel elektroforezi içinHerhangi Bir Yapıcı
EconoTaq DNA PolimerazLucigen30032-1PCR karışımı için
Elektroferez Güç KaynağıJel elektroforezi içinHerhangi Bir Yapıcı
Toplulukhttps://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf  Femtojet Mikroenjektör için Femtotips Mikro Yükleyici İpuçlarıThermo Fischer Mikroenjeksiyon
için Bilimsel E5242956003 Etanol (200 geçirmez, nükleaz içermez)Any Maker
FemtoJet 4iEppendorf5252000021Mikroenjeksiyon
Balık AğıHerhangi Bir MakerBalık malzemeleri
Dondurulmuş Salamura KaridesSalamura Karides DoğrudanBalık malzemeleri
Genel Çok Amaçlı AgarozJel elektroforezi içinHerhangi Bir Yapıcı
Gene Spesifik oligonükleotidEntegre DNA Teknolojileri (IDT)TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
EldivenHerhangi Bir Yapıcı
Buz KovasıHerhangi Bir Yapıcı
Anında Okyanus tuzuHerhangi Bir YapıcıBalık malzemeleri
Invitrogen UltraPure Etidyum Bromür, 10 mg / mLThermo Fischer Scientific15-585-011
KClMiliporeSigmaP5405
KH2< / sub>PO4< / sub>MiliporeSigma7778-77-0
KimwipesThermo Fischer Scientific06-666
Erkek & Dişi zebra balığı
MEGAshortscript T7 Transkripsiyon KitiThermo Fischer ScientificAM1354gRNA
Metilen MavisiThermo Fischer BilimselAC414240250
2< / sub>MiliporeSigma7791-18-6PCR karışımı için
MgSO2· 7H2OMiliporeSigmaM2773
Mikroenjeksiyon plastik kalıpDünyası Hassas AletlerMikroenjeksiyonZ-Kalıpları
Mikroenjeksiyon için Herhangi Bir YapıcıMikropipetleyiciler için
Herhangi Bir Maker
Mikropipet ÇektirmeSutterP-87
Filtreli mikropipetleyici uçları (tüm boyutlar)Filtresiz herhangi bir Maker
Micropippetter uçları (tüm boyutlar)Mikroenjeksiyon
Maker
Mikrodalga Mineral YağMiliporeSigmam5904-5ml
(Trikain-D)Herhangi bir MakerFDA onaylı
Na2 HPO4>MiliporeSigmaS3264
NaClMiliporeSigmaS5886
NaHC03MiliporeSigmaS5761
NanodropHerhangi Bir Yapıcı
NaOHMiliporeSigma567530
Yapışmaz, RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mLAmbionAM12450gRNA
nükleaz içermeyen suHerhangi Bir Yapıcı
KağıtHavlu Herhangi Bir Yapıcı
Pastro PipetlerHerhangi Bir Yapıcı
PCR Şerit TüpleriHerhangi Bir Yapıcı
Petri Plakaları 100 mm çapHerhangi Bir Yapıcı
Fenol Kırmızısı çözeltisiMiliporeSigmaP0290Mikroenjeksiyon
Plastik HaşerelerVWR47747-358Tüp Bebek
Plastik KaşıkHerhangi Bir YapıcıIVF
Premium Sınıf Salamura Karides YumurtalarıSalamura Karides Doğrudanİnce Mesh
RNA Jel Yükleme BoyasıMEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kitinde bulunduJel elektroforezi
için RNAse AWAYThermo Fischer Scientific21-402-178
ÖlçekHerhangi Bir
Maker SharpieHerhangi Bir Maker
  SpatulaHerhangi Bir Yapıcı
Steril H2OPCR karışımı içinHerhangi Bir Yapıcı
T4 DNA PolimerazNEBM0203gRNA Sentezi
BantHerhangi Bir Yapıcı
TBE (Tris-Borat-EDTA) 10xJel elektroforezi içinHerhangi Bir Yapıcı
Çay LekeleyiciAmazonIMU-71133WBalık malzemeleri
Thermo Scientific Owl 12 Dişli Tarak, 1.0/1.5 mm Kalınlık, B2 için Çift TaraflıThermo Fischer ScientificB2-12Jel elektroforezi için
Thermo Scientific  Owl EasyCast B2 Mini Jel Elektroforez SistemleriThermo Fischer Scientific09-528-110BJel elektroforezi için
ThermocyclerAny Maker
ThermocyclerAny Maker
TransilluminatorAny Maker
UV lambasıUVPModel XX-15 (Cat NO. UVP18006201)IVF
UV güvenlik gözlükleriTüpHerhangi Bir Yapıcı
Thermo Fischer ScientificS39015Balık malzemeleri
Zebra balığı çiftleşme kutularıAqua SchwarzSpawningBox1Balık malzemeleri
1.5ml Eppendorf TüpleriFisher Scientific05-402-11
10 Molar dNTPThermo Fischer Scientific18427013
100 BP merdivenThermo Fischer Scientific15628019
%100 RNAse içermeyen etanolherhangi bir yapıcı
5m Amonyum AccetateThermo Fischer Scientific
%70 Etanol70ml etanol ve 30 ml nükleaz içermeyen su
Yatay Jel Kutusu için AksesuarlarFisher Scientific0.625 mm
Agarozherhangi bir yapıcı
CaCl2Sigma10043-52-4
CaCl2, dihidratSigma10035-04-8E3 Orta Kılcal
BoruCole-ParmerUX-03010-68enjeksiyon iğneleri için
Cas9 ProteinThermo Fischer ScientificA36496
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
Bilgisayarherhangi bir yapımcı
Diseksiyon Forceptsherhangi bir maker
Diseksiyon Mikroskobuherhangi bir maker
Diseksiyon Makasıherhangi bir maker
DNA Temiz & Yoğunlaştırıcı -5Zymo ResearchD4014
DNA Jel Yükleme Boyası (6X)Thermo Fischer ScientificR0611
EconoTaq DNA PolimerazLucigen30032-1
Ensemblehttps://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader Pipet UçlarıFischer Scientific1028965120 mikrolitre
Etanol (200 geçirmez, nükleaz içermez)herhangi bir yapımcı
Etidyum BromürThermo Fischer Scientific15585011
Balık Ağıherhangi bir yapımcıince örgü
Dondurulmuş Salamura KaridesLiveAquariaCD-12018balık yemi
Jel Tarak (0.625mm)herhangi bir yapımcı
Jel Elektroferez Sistemiherhangi bir yapımcı
Gen Spesifik OligonükleotidEntegre DNA Teknolojileri (IDT)
Cam Kapiller İğneGrainger21TZ99https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!! g!438976
780705!& gucid=N:N:PS:Ödenen
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB& gclsrc=aw.ds
Cam Tabaklarherhangi bir yapıcı
Eldivenherhangi bir yapımcı
Hank'in Son Çalışma Çözümü9.9 ml Hank's Premix'i 0.1 ml HS Stock #6 ile birleştirin
Hank's Premixaşağıdakileri sırayla birleştirin: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Tüm HS Solosyonlarını 4C'de saklayın
Hanks Çözümü
Hank'in Çözümühttps://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank'in Stok Çözümü #18.0 g NaCl, 0.4 g KCl 100 ml ddH2O
içinde Hank'in Stok Çözümü #20.358 g Na2HPO4 susuz; 0.60 g K2H2PO4 içinde 100 ml ddH2O
Hank'in Stok Çözeltisi #40.72 g CaCl2 içinde 50 ml ddH2O
Hank'in Stok Çözeltisi #51.23 g MgSO47H2O 50 ml ddH20
içinde Hank'in Stok Çözümü #610.0 ml ddH20 içinde 0.35g NaHCO3; taze bir gün kullanın
HClSigma7647-01-0
Buz Kovasıherhangi bir yapıcı
Anında Okyanus tuzubalık suyu içinherhangi bir üretici
In-Vitro Transkripsiyon Kiti, Mega Kısa SenaryoThermo Fischer, ScientificAM1354
Invitrojen ve ticaret; UltraPure ve ticaret; DNase / RNaz İçermeyen Damıtılmış SuFisher Scientific10-977-023
KClSigma7447-40-7E3 Orta
KH2PO4Sigma7778-77-0
KimwipesFisher Scientific06-666
Erkek ve Dişi Zebra Balığı
Mega Kısa Senaryo T7 İletim KitiThermo Fischer ScientificAM1354
metilen mavisiFisher ScientificAC414240250E3 Orta
MgSO2-7H2OSigmaM2773
Mikromikromanipülatör
Mikroenjeksiyon plastik kalıpDünyası Hassas AletlerZ-Kalıpları
Mikroenjektör
Mikroiğne Slayt
Mikropipetleyici (1-10) uçluherhangi bir üreticininfiltrelenmiş p10 uçlara ihtiyacı vardır
Mikropipetleyici (20-200) uçluherhangi bir yapıcı
Micropippetter (100-1000) uçluherhangi bir yapıcı
Mikroplastik kaydırak
Mikrodalgaherhangi bir yapıcı
MiliQ Suherhangi bir Maker
mineral yağsigma-aldrichm5904-5ml
Na2HPO4Sigma
NaClSigmaS9888
NaHC02Sigma223441
Nanodrop
NaOHSigma567530
Dar Spatulaherhangi bir yapıcı
İğne ÇektirmeSutterP-97
Kağıt Havluherhangi bir yapıcı
Pastro PipetlerFisher Scientific13-678-20A
PCR astar yan kılavuz sitesiEntegre DNA Teknolojileri (IDT)
PCR primerleri yan kılavuz RNA kesim bölgesiEntegre DNA Teknolojileri (IDT)Standart tuzdan arındırılmış
PCR Şerit TüpleriThermo Fischer ScientificAB0771W
Petri KaplarıFisher ScientificFB087571410 cm çap 100mm x 15mm
Fenol RedFisher ScienceS25464https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipet UçlarıHerhangi bir yapımcı10ul, 200ul ve 1000ul uçlar
Plastik HaşerelerFisher Scientific12-141-364
Plastik Kaşıkherhangi bir yapıcı
Astar Kılavuzu SiteEntegre DNA Teknolojileri (IDT)
Tıraş BıçağıUlineH-595B
RNA jelMegashort script kitinde Boya Yükleme (in vitro transciption kiti)
RNAseaway Fisher21-402-178
RNAse içermeyen polipropilen mikrosantrifüj tüpleriThermo Fischer ScientificAM12400
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 RNAse içermeyen suFisher Scientific10-977-023
Herhangibir yapıcıyı
Sharpieherhangi bir yapıcı
Sodyum bikarbonat (hücre kültür test edildi)SigmaS5761balık suyu
Sodyum Bromür SolotionSigmaE1510
Sanger dizileme yazılımı Analiz
Spektrofotometre
Steril H2Oherhangi bir marka
T4 DNA PolimerazNEBM0203Shttps://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Herhangibir marka
TBE (Tris-Borat-EDTA) 10XThermo Fischer ScientificB52https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Çay LekeleyiciamazonIMU-71133Wçoğu mutfak mağazasında mevcuttur
Thermocycler
Transfer PipetiUline S-24320
Transilluminatör
Trikainfisher bilimselNC0872873
Tris HCl 7.5Thermo Fischer Scientific15567027
Evrensel PrimerEntegre DNA Teknolojileri (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lambasıUVP
UV güvenlik gözlükleriherhangi bir yapımcı
Yıkama Şişesifisher scientificS39015
Zebra balığı çiftleşme kutularıherhangi bir yapımcı
PCR Tampon Tarifi171.12 mL steril H20 ekleyin; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616 mL 1M MgCl2; 2.618 mL, 1M, Tris-HCl (pH 8.4), 13.092mL, 1M KCl; 0.262 mL %1 Jelatin. 20 dakika otoklavlayın, ardından soloyu buz üzerinde soğutun. Daha sonra 3.468 mL 100mg / mL BSA ekleyin; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);   0.262 mL dTTP (100 mL). Alliquote steril eppendorf tüplerine
sentezi Bebek DNA Temiz ve İçin için E3 MgCl için Sentezi Mikromanipülatör için MS-222 için Herhangi bir sentezi için İçin içinBebek Yıkama Şişesi İçin , , , , ölçeklendirin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Maternal Etki GenleriCRISPR Cas9 D zenlemeRehber RNA o ullamaZebrafish EmbriyogeneziSomatik MutasyonlarSanger DizilemeHaploid EmbriyolarMaternal Etki Fenotipi

İlgili makaleler