Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Erken gelişim, zigotik genom aktivasyonuna kadar gelişim için gerekli tüm hücresel fonksiyonları yerine getiren oogenez sırasında matür oosite dahil edilen maternal faktörlerin bir havuzuna bağlıdır. Tipik olarak, bu maternal faktörlerin genetik olarak hedeflenmesi, annelik etkisi fenotiplerini tanımlamak için ek bir nesil gerektirir ve bu da gelişim sırasında maternal olarak eksprese edilen genlerin rolünü belirleme yeteneğini engeller. CRISPR-Cas9'un bialelik düzenleme yeteneklerinin keşfi, enjekte edilen embriyoların veya "gevreklerin" somatik dokularındaki embriyonik fenotiplerin taranmasına izin vererek, zigotik olarak eksprese edilen genlerin gelişim programlarında oynadığı rolün anlaşılmasını arttırmıştır. Bu makalede, crispant yönteminin bir uzantısı olan bir protokol açıklanır. Bu yöntemde, germ hücrelerinin bialelik düzenlenmesi, tek bir nesilde veya "maternal gevrekler" de maternal etkili bir fenotipin izolasyonuna izin verir. RNA'ları tek bir hedefe multipleks etmek, maternal gevreklerin verimli üretimini teşvik ederken, maternal gevrek haploidlerin sekans analizi, maternal etkili bir fenotip üreten genetik lezyonları doğrulamak için basit bir yöntem sağlar. Maternal gevreklerin kullanımı, annelik tarafından ifade edilen temel genlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını destekler, böylece erken gelişimin anlaşılmasını kolaylaştırır.
Giriş
Maternal olarak biriken ürünlerden oluşan bir havuz (örneğin, RNA'lar, proteinler ve diğer biyomoleküller), embriyonun zigotik genomu aktive edilene kadar tüm erken hücresel süreçler için gereklidir1. Bu ürünlerin oositten erken tükenmesi tipik olarak embriyonik öldürücüdür. Bu genlerin gelişimdeki önemine rağmen, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü şu anda bilinmemektedir. Zebra balıklarında CRISPR-Cas9 gibi gen düzenleme teknolojisindeki ilerleme, anne tarafından eksprese edilen genlerinhedeflenmesini sağlar 2,3,4. Bununla birlikte, bir anne-etki fenotipinin tanımlanması, zigotik bir fenotiple karşılaştırıldığında ekstra bir nesil gerektirir, bu nedenle daha fazla kaynak gerektirir. Son zamanlarda, CRISPR-Cas9'un bialelik düzenleme yeteneği, "gevrekler" olarak bilinen enjekte edilen (F0) embriyoların somatik dokularındaki embriyonik fenotipleri taramak için kullanılmıştır5,6,7,8,9,10. Crispant tekniği, somatik hücrelerdeki aday genlerin kaynak verimli bir şekilde taranmasına izin verir ve gelişimdeki belirli yönlerin anlaşılmasını kolaylaştırır. Bu yazıda açıklanan protokol, anne-etki fenotiplerinin veya "maternal gevreklerin" tek bir nesil11'de tanımlanmasına izin vermektedir. Bu şema, kılavuz RNA'ları tek bir gene çoklayarak ve germ hattındaki bialelik düzenleme olaylarını teşvik ederek elde edilebilir. Bu maternal gevrek embriyolar brüt morfolojik fenotiplerle tanımlanabilir ve hücre sınırları için etiketleme ve DNA modellemesi11 gibi birincil karakterizasyona tabi tutulur. Gözlemlenebilir fenotipin ve indüklenen INDELL'lerin temel moleküler karakterizasyonunun kombine analizi, hedeflenen genin erken gelişimdeki rolünün tahmin edilmesini sağlar.
Zebra balığında, döllenme sonrası ilk 24 saat (hpf) sırasında, küçük bir hücre grubu, germ hattı12,13,14,15'in öncüsü olan ilkel germ hücrelerine dönüşür. F0 dişileri tarafından yerleştirilen debriyajlarda, geri kazanılan maternal gevrek embriyoların oranı, hedeflenen gende kaç germ hücresinin bialelik bir düzenleme olayı içerdiğine bağlıdır. Genel olarak, embriyoda düzenleme olayı ne kadar erken gerçekleşirse, germ hattında CRISPR-Cas9 mutasyonlarının gözlenme olasılığı o kadar yüksek olur. Çoğu durumda, maternal gevrek embriyoların fenotipleri, gelişmekte olan oositte bulunan iki maternal aleldeki fonksiyon kaybından kaynaklanır. Oosit mayozu bitirdiğinde, maternal alellerden biri embriyodan polar cisim yoluyla ekstrüde edilirken, diğer alel maternal pronükleusa dahil edilir. Çoklu maternal gevrek haploidlerin dizilimi, fenotip-11'e katkıda bulunan germ hattında bulunan mutasyonların (eklemeler ve / veya delesyonlar (INDEL'ler)) bir karışımını temsil edecektir.
Aşağıdaki protokol, maternal etki genlerinde CRISPR-Cas9 mutasyonları oluşturmak ve maternal crispant yaklaşımı kullanarak karşılık gelen fenotipi tanımlamak için gerekli adımları açıklamaktadır (Şekil 1). Birinci bölüm, kılavuz RNA'ların etkili bir şekilde nasıl tasarlanacağını ve oluşturulacağını açıklarken, ikinci ve üçüncü bölümler mikroenjeksiyonla maternal gevreklikler oluşturmak için kritik adımlar içermektedir. CRISPR-Cas9 karışımı enjekte edildikten sonra, enjekte edilen embriyolar PCR (bölüm dört) aracılığıyla somatik düzenlemeler için taranır. Enjekte edilen F0 embriyoları geliştikten ve cinsel olgunluğa ulaştığında, F0 dişileri vahşi tip erkeklere geçirilir ve yavruları annelik etkisi fenotipleri için taranır (beşinci bölüm). Altıncı bölüm, CRISPR-Cas9 kaynaklı INDEL'leri tanımlamak için Sanger dizilimi ile birleştirilebilen maternal gevrek haploidlerin yapımına ilişkin talimatları içermektedir. Ek olarak, Tartışma, bu yöntemin duyarlılığını ve gücünü artırmak için protokolde yapılabilecek değişiklikler içerir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolün geliştirilmesine yol açan çalışmalarda, tüm zebra balığı barınma ve deneyleri Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC-M005268-R2) tarafından onaylanmıştır.
1. Kılavuz RNA'ların Sentezi
NOT: Zigotik gevrekler, tek bir kılavuz RNA kullanılarak veya çoklu kılavuz RNA'ları tek bir hedefe 5,6,7,8,9,10 olarak çoğaltarak oluşturulmuştur. Kılavuz RNA'ların çoklanması, zigotik gevrek fenotip10 gösteren embriyoların yüzdesini arttırır. Fenotip sergileyen embriyoların bu artan sıklığı nedeniyle, maternal gevrekler, dört kılavuz RNA'nın tek bir gene kopyalanmasıyla oluşturulur. Kılavuz RNA'ları tasarlamak için CHOPCHOP'u kullanma konusunda daha ayrıntılı bir protokol ve zebra balığı için kılavuz RNA'ları sentezlemek için bir tavlama yöntemi16,17,18,19,20 başka bir yerde bulunabilir.
- Hedeflenecek anne tarafından eksprese edilen bir geni tanımlamak için, gelişim sırasında mRNA transkript seviyelerini, zigottan 5 gün21'e kadar transkriptom bilgisi sağlayan bir RNA dizisi veritabanı aracılığıyla tespit edin. Genel olarak, anneye özgü genler erken embriyoda yüksek oranda eksprese edilir ve zigotik genom aktive edildikten sonra parçalanır22.
- Anne tarafından ifade edilen bir hedef gen tanımlandıktan sonra, Ensembl genom tarayıcısı23'te bulunan "etki alanları ve özellikler" bölümünü kullanarak ilk tahmin edilen protein alanını belirleyin. Bu etki alanını dört kılavuz RNA için hedef bölge olarak kullanın.
- İlk aktif alandaki dört kılavuz RNA hedef bölgesini tanımlamak için kılavuz RNA seçim programı CHOPCHOP'u kullanın. Her hedef bölge için aşağıda gösterildiği gibi gene özgü oligonükleotidler tasarlayın. Gen-spesifik oligonükleotidde, N20 bölümü, CHOPCHOP'dan PAM bölgesi (NGG) eksi hedef diziye karşılık gelir. Bu gen-spesifik oligonükleotidleri ve standart tuzdan arındırma saflaştırmasını kullanarak sabit oligonükleotidi sipariş edin (bakınız Malzeme Tablosu).
Gen-spesifik oligonükleotid:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Her bir gen-spesifik oligonükleotid için bir kılavuz RNA şablonu oluşturmak için, onu sabit oligonükleotidi tavlayın ve çıkıntıları daha önce tarif edildiği gibi T4-DNA polimeraz ile doldurun16. Dört kılavuz RNA şablonu bir araya getirildikten sonra, üreticinin talimatlarına göre bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak bunları saflaştırın ve konsantre edin (bkz.
- Bir in vitro T7 transkripsiyon kiti kullanarak havuzlanmış kılavuz RNA şablonundan sgRNA karışımını sentezleyin (bkz. İn-vitro transkripsiyonu üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin. T7 Transkripsiyon kitinin yarı reaksiyonlarının kullanılması, reaksiyon başına maliyeti azaltabilir.
- RNA sentezinden sonra, daha önce tarif edildiği gibi bir etanol / amonyum asetat protokolü kullanarak ortaya çıkan sgRNA havuzunu saflaştırın 16,20,24. RNA izole edildikten sonra, 20 μL nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın. T7 Transkripsiyon kitinin yarı reaksiyonları sgRNA havuzunu transkripte etmek için kullanılmışsa, saflaştırılmış RNA'yı 10-15 μL nükleaz içermeyen suya yeniden askıya alın.
- Bir spektrofotometre kullanılarak oluşturulan havuzlanmış sgRNA'ların miktarını ölçün. Nükleaz içermeyen sudaki sgRNA havuzunu 1500 ng / μL ± 500 ng / μL'lik bir seyreltmeye seyreltin. tipik olarak, çalışma seyreltmesinin son hacmi 30-50 μL arasında değişir.
- SgRNA havuzunun konsantrasyonunu belirledikten sonra,% 1'lik bir agaroz jeli üzerindeki sgRNA'ların bütünlüğünü doğrulayın.
- % 1 agaroz / 0.5 μg / mL ethidyum bromür / TBE jeli dökün. Jel katılaştıktan sonra, TBE çalışma tamponuna yerleştirin.
- 1 μL sgRNA karışımı ve 1 μL RNA jel yükleme tamponu karıştırın (bkz. Bu numuneyi jele yükleyin ve jeli 5 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.
- Ultraviyole (UV) ışık kullanarak bantları görselleştirin. SgRNA havuzu tek bir bant olarak görünmelidir. Bir yayma gözlenirse, RNA bozulması muhtemelen meydana gelmiştir.
- SgRNA havuzunu -80 °C dondurucudaki nükleaz içermeyen PCR şerit tüplerinde tek kullanımlık 1 μL alikotlarda saklayın. Büyük hacimli sgRNA karışımı (30 μL veya daha fazla) için, hacmin yarısını nükleaz içermeyen PCR şerit tüplerine aliquot edin ve diğer yarısını nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde daha büyük bir hacim olarak saklayın. Gerektiğinde çözülün ve aliquot.
- RNA bozulmasını önlemek için, mikrosantrifüj tüpündeki numunelerin ikiden fazla donma-çözülme döngüsüne maruz kalmadığından emin olun.
2. Mikroenjeksiyon için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
NOT: Zebra balığında, Cas9 mRNA enjeksiyonu zigotik gevrekler oluşturabilir. Bununla birlikte, çalışmalar Cas9 proteininin enjekte edilen embriyolarda INDEL oluşturmada daha etkili olduğunu göstermiştir16,25. Bu protokol, maternal gevrekler üretmek için Cas9 proteinini kullanır, çünkü bu protein enjekte edilen Cas9 mRNA ile aktivitede aynı gecikmeyi yaşamaz. Teorik olarak, bu, gelişimin erken dönemlerinde bialelik bir mutasyon olasılığını arttırmalı, bu da germline'ın daha geniş bir bölümünün etkilenme şansının artmasına neden olmalıdır. Mikroenjeksiyonlara nasıl hazırlanılacağını detaylandıran diğer protokoller ve kaynaklar başka bir yerde bulunabilir24,26.
- Cas9 proteini satın alın veya üretin (bkz. Cas9 proteinini nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alarak 2 mg/mL'lik bir çözelti ve RNaz içermeyen polipropilen mikrosantrifüj tüplerine 1 μL alikot yapın. Bunları -80 °C'de tek kullanımlık tüpler olarak saklayın.
- Enjeksiyondan önceki öğleden sonra, bir cam kılcal damarı çekmek ve bir enjeksiyon iğnesi oluşturmak için bir mikropipet çektirici kullanın. Kırılmamış iğneyi, mikroenjeksiyon sabahına kadar kapalı bir iğne tutucuda saklayın.
- Bir enjeksiyon plakası oluşturmak için, 100 mm X 15 mm Petri kabının yarısını doldurmak için20mL% 1,5 agaroz / steril H 2 O dökün ve katılaşmasını bekleyin. Agaroz çözeltisi ayarlandıktan sonra, Petri kabına 20 mL% 1.5 agaroz / steril H2O ekleyin ve plastik kalıbı ( Malzeme Tablosuna bakınız) sıvı agarozun içine yerleştirin ve sertleşmesine izin verin.
- Agaroz sertleştikten sonra, plastik kalıbı çıkarın ve enjeksiyon plakasını enjeksiyon sabahına kadar buzdolabında baş aşağı saklayın. Kuyular bütünlüklerini koruduğu sürece çoklu enjeksiyonlar için tek bir plaka kullanılabilir.
3. Maternal gevrekler üretmek için CRISPR-Cas9 kokteylinin tek hücreli zebra balığı embriyosuna mikroenjeksiyonu
NOT: Zebra balığı embriyolarına mikroenjeksiyon için daha fazla kaynak başka bir yerde bulunabilir24,26,27. CRISPR-Cas9 karışımının tek hücreli embriyoların gelişmekte olan blastodiskine enjekte edilmesi, maternal gevrekler oluşturma olasılığını artırabilir. Karışım ayrıca 2 hücreli aşamaya kadar yumurta sarısı kesesine enjekte edilebilir. Bununla birlikte, yumurta sarısına enjekte edilen karışımlar, blastodiske ulaşmak için ooplazmik akışa bağlıdır, bu nedenle yumurta sarısına enjekte edilen CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas928'in kesme verimliliğini azaltabilir.
- Mikroenjeksiyonlardan önceki öğleden sonra, zebra balığı çiftleşme kutularında vahşi tip haçlar kurun. Hem erkek hem de dişi balıkları aynı tankta tutun, ancak bir çiftleşme kutusu bölücüsü ile ayırın veya dişiyi yumurtlayan bir ekin içine yerleştirin.
- Deneyin sabahında, Cas9 proteininden bir adet 2 mg/mL aliquot ve sgRNA havuzundan bir aliquot alın. Cas9 proteinini içeren RNaz içermeyen polipropilen mikrosantrifüj tüpünde, sgRNA havuzunu, 1 μL% 0.5 fenol kırmızı çözeltisini ve nükleaz içermeyen suyu içeren 5 μL'lik bir enjeksiyon karışımı oluşturun. RNaz içermeyen suda 400 ng / μL Cas9 proteininin ve 200 ng / μL'lik havuzlanmış sgRNA'ların nihai konsantrasyonunu veya enjekte edilen embriyodaki Cas9 proteininin sgRNA'lara 2: 1 oranını hedefleyin. Bu enjeksiyon karışımı, enjeksiyon sabahı için buz üzerinde saklanabilir.
- Bir enjeksiyon plakasını buzdolabından çıkarın ve en az 20 dakika boyunca oda sıcaklığına (RT) ısınmasına izin verin.
- Enjeksiyon kokteyli monte edildikten sonra, erkek ve dişinin çiftleşmesine izin verin, örneğin, çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya erkeği dişiyle aynı yumurtlama ekine yerleştirerek, uygun şekilde.
- Balıklar serildikten sonra, ancak embriyolar toplanmadan önce, embriyo hasarını önlemek için yeterince küçük bir deliğe sahip ancak enjeksiyon karışımı ile tıkanmayacak kadar geniş bir iğne oluşturmak için yeni bir tıraş bıçağı veya ince forseps kullanarak kırılmamış bir iğnenin ucunu kesin. İğne kesildikten sonra, kılcal damarın arka ucuna yerleştirilmiş bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak iğneyi enjeksiyon karışımıyla yükleyin (bkz.
- İğne doldurulduktan sonra, Cas9-sgRNA komplekslerini birleştirmek için iğneyi RT'de 5 dakika inkübe edin.
- Mikroenjektörü açın ve iğneyi mikromanipülatöre yerleştirin. Bir mikrometre sürgüsüne bir damla mineral yağ yerleştirin ve iğne mineral yağa 1 nL'lik bir bolus çıkarana kadar enjeksiyon basıncını ayarlayarak iğneyi kalibre edin.
NOT: Mineral yağa enjekte edilirken, 1 nL'lik bir bolus, mikrometre kızağı ile ölçüldüğü gibi yaklaşık 0,125 mm (veya 0,062 mm yarıçap) çapa sahip olacaktır. - Embriyoları senkronize etmek için, plastik bir süzgeç kullanarak 10 dakika sonra toplayın ve 1x E3 ortamı (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) kullanarak bir Petri kabında durulayın ve 1 L'lik 1x E3 başına 20 μL 0.03 M Metilen Mavisi ekleyin. 10-15 embriyoyu çıkarın ve enjekte edilmemiş kontroller olarak tutulmak üzere ayrı bir Petri kabına yerleştirin.
- Gelişmekte olan embriyoların geri kalanını enjeksiyon plakasının kuyucuklarına aktarın.
- Tek hücreli bir embriyonun gelişmekte olan blastodiskine 1 nL çözelti (toplam 400 pg Cas9 proteini ve 200 pg sgRNA) enjekte edin. İğnenin ucu tıkanırsa, ucu geri kırmak için forseps kullanın ve 1 nL'lik bir bolusu çıkarmak için iğneyi yeniden kalibre edin. Döllenmeden sonraki gelişimin ilk 40 dakikasında tüm embriyoları enjekte ettiğinizden emin olun.
- Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, enjekte edilen embriyoları 1x E3 ortamı içeren etiketli bir Petri kabına geri koyun ve gün boyunca gelişmelerine izin verin. Zebra balığı evreleme serisi29'a göre döllenmemiş veya normal şekilde gelişmemiş embriyoları çıkarın.
4. F0 enjekte edilen embriyolarda somatik INDEL taraması
NOT: T7 endonükleaz I testi veya yüksek çözünürlüklü erime analizi gibi INDEL'leri tanımlamak için diğer yöntemler, embriyoların somatik INDEL 30 içerip içermediğini belirlerken kullanılabilir.
- Enjeksiyonlardan sonraki ertesi gün, Petri kabından kusurlu ve lize olmuş embriyoları çıkarın ve embriyo sağlığını korumak için 1x E3 ortamını değiştirin.
- Çanağı temizledikten sonra, enjekte edilmemiş plakadan altı sağlıklı enjeksiyonlu embriyo ve iki kontrol embriyosu toplayın. Her embriyoyu ayrı ayrı bir PCR şerit tüpünün tek bir kuyucuğuna yerleştirin ve tüplerin üstünü etiketleyin.
- Tek tek embriyoların genomik DNA'sını çıkarmak için, fazla E3 ortamını şerit tüpünün kuyucuklarından çıkarın ve kuyu başına 100 μL 50 mM NaOH ekleyin.
- Embriyoları 20 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. Daha sonra numuneleri 4 °C'ye kadar soğutun, 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7.5) ekleyin ve 5 ila 10 sn boyunca vorteks yapın. Bu ekstrakte edilen DNA, önemli DNA bozulması olmadan en az 6 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
- CRISPR-Cas9 hedef bölgesini içeren 100-110 bp DNA parçasını yükseltmek için her kılavuz site için benzersiz tarama primerleri tasarlayın. Mümkünse, hedef siteyi güçlendirilmiş parçanın ortasına yerleştirin ve daha büyük silmelerin tanımlanmasına izin verin.
- Dört kılavuz hedef bölgenin her biri için, hazırlanan tek embriyolu genomik DNA'nın 5 μL'sini, PCR karışımını ve hedef bölgedeki somatik mutasyonları tanımlamak için kılavuza özgü tarama primerlerini kullanarak sekiz adet 25 μL PCR reaksiyonu ayarlayın (Tablo 1).
- Yaklaşık 0,625 cm genişliğinde kuyucuklar oluşturan taraklar kullanarak %2,5 agaroz/0,5 μg/mL ethidyum bromür/TBE jeli dökün. Bu geniş tarak, genomik dizideki boyut değişikliklerini tespit ederken daha iyi çözünürlük sağlar. Jel katılaştıktan sonra, TBE çalışma tamponu içeren bir elektroforez odasına yerleştirin.
- PCR ürününe 5 μL 6x yükleme boyası ekleyin ve bu karışımın 25 μL'sini jele yükleyin. Enjekte edilen ve kontrol edilen numunelerin jelin aynı sırası üzerinde çalıştırıldığından emin olun. Tüm numuneler yüklendikten sonra, jel kutusunun pozitif ucuna 1 L TBE çalışma tamponu başına 5 μL ethidyum bromür ekleyin.
- DNA bantları çözülene veya DNA şeridin sonuna yaklaşana kadar jeli 120 V'ta çalıştırın. Cas9 hedef bölgede INDEL oluşturduysa, enjekte edilen numunelerde tipik olarak bir yayma gözlenir, ancak kontrollerde gözlenmez.
- Dört kılavuz RNA ile enjekte edilen embriyolardaki dört kılavuz bölgeden en az üçünde smear gözlenirse, kardeş enjekte edilen embriyoları büyütün.
- Enjekte edilen numuneler gerekli sayıda kılavuz bölgesinde yayma içermediğinde, çalışmayanların yerini almak için yeni kılavuz RNA'lar tasarlayın ve işe yarayanları ve yeni tasarlananları içeren yeni bir kılavuz RNA havuzu oluşturun. Yeni havuzu yukarıda açıklandığı gibi somatik INDEL'ler için enjekte edin ve test edin.
5. Maternal gevrek embriyolarda maternal etki fenotiplerinin tanımlanması
NOT: Enjekte edilen F0 dişileri cinsel olgunluğa ulaştıktan sonra, germline hücreleri maternal gevrek ve vahşi tip embriyoların bir karışımını üretme potansiyeline sahiptir. Bu karışım döllenme ve gelişimsel zamanlama için iç kontrollere izin verse de, F0 dişisinden bir debriyajın sadece maternal gevrek embriyolar içermesi durumunda harici bir kontrol olarak vahşi tipte bir çaprazlama kurmak hala faydalıdır.
- Deneyden önceki öğleden sonra, F0 enjekte edilen dişileri vahşi tip erkeklere karşı ayarlayın ve standart zebra balığı çiftleşme kutularında vahşi tip haçları kontrol edin. Hem erkek hem de dişi balıkları aynı tanka yerleştirin, ancak çiftleşme kutusu bölücüsü ile ayırın veya dişiyi yumurtlayan bir ekin içine yerleştirin.
- Deneyin sabahında, erkek ve dişinin çiftleşmeye başlamasına izin verin, örneğin çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya erkeği dişi ile aynı yumurtlama ekine yerleştirerek.
- Yumurtlama ekini taze sistem suyu içeren yeni bir çiftleşme tankı tabanına hareket ettirerek embriyoları her 10 dakikada bir toplayın ve tankı bireysel F0 dişisini tanımlayan bir etiketle etiketleyin. Eski çiftleşme tankını alın ve embriyoları 10 dakikalık bir debriyajdan toplamak için suyu bir çay süzgecinden dökün.
- Tek bir 10 dakikalık debriyajdan elde edilen embriyolar süzgeçte toplandıktan sonra, bunları 1x E3 ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. Petri kabını toplama zamanı ve balık bilgileriyle etiketleyin.
- İletilen bir ışık kaynağı ile diseksiyon yapan bir mikroskop altında, ilk 6-8 saat boyunca her saat başı ve sonraki 5 gün boyunca günlük olarak gelişim gösteren embriyoları gözlemleyin.
- Potansiyel maternal gevrek embriyoları, zaman uyumlu vahşi tip kontrollere kıyasla gelişimlerindeki brüt morfolojik değişikliklerle tanımlayın29.
- Potansiyel maternal gevrek embriyoları, 1x E3 ortamı ve 24 hpf'de morfolojik fenotip ve döllenmeden sonraki 5 günde canlılık (örneğin, yüzme mesanesi şişirmesi) için tahlil içeren bir Petri kabına taşıyın.
6. Maternal gevrek haploidlerde dizileme alelleri
NOT: Maternal gevrek haploidler, hedeflenen lokusta tek bir alel içerir ve Sanger dizilimi yoluyla hedef gendeki INDEL'lerin tanımlanmasına izin verir. Maternal gevrek haploid embriyoları da yeni nesil dizileme testleri kullanılarak analiz edilebilir. Maternal gevrek fenotip gösteren embriyoların dört hedef bölgeden en az birinde lezyon taşıması beklenmektedir (Bkz. Tartışma).
- Deneyden önceki öğleden sonra, maternal gevrek embriyolar ürettiği bilinen F0 dişi çiftlerinin çiftleşmesi, vahşi tip erkeklere geçti. Vahşi tip erkekleri bir çiftleşme kutusu bölücü kullanarak dişilerden fiziksel olarak ayrı tutun veya dişi yumurtlama ekine yerleştirin.
- Deneyin sabahında, fiziksel bölümü çıkarın veya çiftleşmeyi başlatmak için hem erkekleri hem de dişileri yumurtlama ekinin içine yerleştirin. Yumurtlamanın ilk belirtisinde, erkek ve F0 dişilerini ayırarak üremeyi kesin. Her ayrılmış F0 dişisini ayrı ayrı çiftleşme kutularında saklayın.
- Dahaönce tarif edildiği gibi bir dişiden ekstrüde yumurtaları döllemek için yeterli olan Hank çözeltisinin her 100 μL'si için bir vahşi tip erkekten testisler kullanarak UV ile muamele edilmiş sperm çözeltisi hazırlayın (Tablo 2).
- Önceden seçilmiş F0 dişilerinden olgun yumurtaları manuel olarak ekstrüzyon yapın ve UV ile tedavi edilmiş sperm31'i kullanarak in vitro fertilizasyon (IVF) gerçekleştirin.
- İn vitro fertilizasyondan sonra, maternal gevrek fenotip gözlenene kadar haploid embriyoların gelişmesine izin verin ve bu embriyoları farklı bir Petri kabına yerleştirin.
- Maternal gevrek haploid embriyolar tanımlandıktan sonra, döllenme sonrası en az 6 saat boyunca gelişmelerine izin verin.
- Genomik DNA'yı en az on maternal gevrek haploid embriyodan çıkarmak için, tek bir haploid embriyoyu bir PCR şerit tüpünün bireysel bir kuyucuğuna yerleştirin, fazla E3 ortamını kuyudan çıkarın ve 50 μL 50 mM NaOH ekleyin.
- Embriyoları 20 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. Daha sonra numuneleri 4 °C'ye kadar soğutun, 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7.5) ekleyin ve 5-10 sn vorteks ekleyin. Ekstrakte edilen DNA, 6 aya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
- Hangi kılavuz bölgelerinin INDEL içerdiğini belirlemek için, dört CRISPR-Cas9 hedef bölgesinin tümünü içeren bir DNA parçasını yükseltmek için dizileme primerleri tasarlayın. Bu sıralama primerleri, birden fazla kılavuz alanına yayılan INDEL'lerin tanımlanmasına izin verir.
- Hazırlanan genomik DNA'nın 5 μL'sini ve dizileme primerlerini kullanarak embriyo başına iki adet 25 μL PCR reaksiyonu ayarlayın.
- PCR bittikten sonra, bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak iki numuneyi saflaştırın ve konsantre edin (bkz. Daha sonra DNA fragmanını hem ileri hem de geri dizileme primerlerini kullanarak Sanger dizilimine gönderin.
- Haploid maternal gevrek parça sıralandıktan sonra, onu vahşi tip diziye hizalayın ve bir dizi hizalama programı kullanarak hedef bölgelerdeki INDEL'leri tanımlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşım, maternal etki fenotiplerinin hızlı, kaynak verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlar (Şekil 1).
Maternal gevrekliklerin üretilmesi:
Dört kılavuz RNA'yı tek bir aday anne-etki genini hedefleyecek şekilde tasarlarken, kılavuz RNA'ların DNA'ya bağlanacağı yere özel dikkat gösterilmelidir. Genel olarak, hepsi ilk tahmin edilen protein alanının başlangıcında kılavuz RNA'lar arasında en az örtüşen bölgeler v...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede sunulan protokol, hem ileri hem de geri genetik teknikler için gerekli olan çoklu nesiller yerine, tek bir nesilde bir anne-etkili fenotipin tanımlanmasına ve birincil moleküler karakterizasyonuna izin vermektedir. Şu anda, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü bilinmemektedir. Bu bilgi eksikliği kısmen, anne-etki genlerini tanımlarken bir fenotipi görselleştirmek için gereken ekstra üretimden kaynaklanmaktadır. Geçmişte, zebra balığında anne-etkisi genlerinin hızlı bir şekilde tanımlanması, trans...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Geçmişteki ve şu anki Pelegri laboratuvarı hayvancılık personeline su tesislerine gösterdikleri özen için teşekkür ederiz. Ayrıca Ryan Trevena ve Diane Hanson tarafından el yazması hakkındaki yorumlar ve içgörüler için minnettarız. Finansman F.P.'ye NIH hibesi ile sağlandı (GM065303)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | PCR karışımı için |
| 1.5 mL Eppendorf Tüpleri | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| 10 mM dNTP'ler | Thermo Fischer Bilimsel | 18427013 | gRNA |
| 100 BP merdiveni | Jel elektroforezi için | Herhangi Bir Yapıcı | |
| %100 RNAse içermeyen etanol | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| %100 RNAse ücretsiz etanol | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| 100ml Beher | IVF için | Herhangi Bir Yapıcı | |
| 5 M Amonyum Accetate | Thermo Fischer Bilimsel | MEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kitinde Bulundu | gRNA Sentezi |
| % 70 etanol | gRNA sentezi (70 mL etanol + 30 mL nükleaz içermeyen su) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | Mikroenjeksiyon |
| Toplu İlaç için Sodyum Bikarbonat 35 pound | Toplu Resif Kaynağı | 255 | Balık malzemeleri |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Proteini, NLS'li | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Sabit oligonükleotid | Entegre DNA Teknolojiler (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC Tüp | |
| için | Depresyon Cam | Plaka Thermo Fischer Scientific | 13-748B |
| Tüp Bebek Diseksiyon Forseps | Dumont | SS | |
| Tüp | |||
| Bebek için Diseksiyon Makası Güzel Bilim Araçları 14091-09Diseksiyon Steroskopu (iletilen ışık kaynağı ile) | IVF | Herhangi Bir Yapıcı | |
| Yoğunlaştırıcı -5 | Zymo Research | D4014 | gRNA DNA Jel Yükleme Boyasının Sentezi |
| (6x) | Jel elektroforezi için | Herhangi Bir Yapıcı | |
| EconoTaq DNA Polimeraz | Lucigen | 30032-1 | PCR karışımı için |
| Elektroferez Güç Kaynağı | Jel elektroforezi için | Herhangi Bir Yapıcı | |
| Topluluk | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtojet Mikroenjektör için Femtotips Mikro Yükleyici İpuçları | Thermo Fischer Mikroenjeksiyon | ||
| için Bilimsel E5242956003 Etanol (200 geçirmez, nükleaz içermez) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | Mikroenjeksiyon |
| Balık Ağı | Herhangi Bir Maker | Balık malzemeleri | |
| Dondurulmuş Salamura Karides | Salamura Karides Doğrudan | Balık malzemeleri | |
| Genel Çok Amaçlı Agaroz | Jel elektroforezi için | Herhangi Bir Yapıcı | |
| Gene Spesifik oligonükleotid | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Eldiven | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| Buz Kovası | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| Anında Okyanus tuzu | Herhangi Bir Yapıcı | Balık malzemeleri | |
| Invitrogen UltraPure Etidyum Bromür, 10 mg / mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Erkek & Dişi zebra balığı | |||
| MEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kiti | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | gRNA |
| Metilen Mavisi | Thermo Fischer Bilimsel | AC414240250 | |
| 2< / sub> | MiliporeSigma | 7791-18-6 | PCR karışımı için |
| MgSO2· 7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Mikroenjeksiyon plastik kalıp | Dünyası Hassas Aletler | Mikroenjeksiyon | Z-Kalıpları |
| Mikroenjeksiyon için Herhangi Bir Yapıcı | Mikropipetleyiciler için | ||
| Herhangi Bir Maker | |||
| Mikropipet Çektirme | Sutter | P-87 | |
| Filtreli mikropipetleyici uçları (tüm boyutlar) | Filtresiz herhangi bir Maker | ||
| Micropippetter uçları (tüm boyutlar) | Mikroenjeksiyon | ||
| Maker | |||
| Mikrodalga Mineral Yağ | MiliporeSigma | m5904-5ml | |
| (Trikain-D) | Herhangi bir Maker | FDA onaylı | |
| Na2 HPO4 | >MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Yapışmaz, RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | gRNA |
| nükleaz içermeyen su | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| Kağıt | Havlu Herhangi Bir Yapıcı | ||
| Pastro Pipetler | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| PCR Şerit Tüpleri | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| Petri Plakaları 100 mm çap | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| Fenol Kırmızısı çözeltisi | MiliporeSigma | P0290 | Mikroenjeksiyon |
| Plastik Haşereler | VWR | 47747-358 | Tüp Bebek |
| Plastik Kaşık | Herhangi Bir Yapıcı | IVF | |
| Premium Sınıf Salamura Karides Yumurtaları | Salamura Karides Doğrudan | İnce Mesh | |
| RNA Jel Yükleme Boyası | MEGAshortscript T7 Transkripsiyon Kitinde bulundu | Jel elektroforezi | |
| için RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Ölçek | Herhangi Bir | ||
| Maker Sharpie | Herhangi Bir Maker | ||
| Spatula | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| Steril H2O | PCR karışımı için | Herhangi Bir Yapıcı | |
| T4 DNA Polimeraz | NEB | M0203 | gRNA Sentezi |
| Bant | Herhangi Bir Yapıcı | ||
| TBE (Tris-Borat-EDTA) 10x | Jel elektroforezi için | Herhangi Bir Yapıcı | |
| Çay Lekeleyici | Amazon | IMU-71133W | Balık malzemeleri |
| Thermo Scientific Owl 12 Dişli Tarak, 1.0/1.5 mm Kalınlık, B2 için Çift Taraflı | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | Jel elektroforezi için |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Jel Elektroforez Sistemleri | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | Jel elektroforezi için |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lambası | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | IVF |
| UV güvenlik gözlükleri | Tüp | Herhangi Bir Yapıcı | |
| Thermo Fischer Scientific | S39015 | Balık malzemeleri | |
| Zebra balığı çiftleşme kutuları | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Balık malzemeleri |
| 1.5ml Eppendorf Tüpleri | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTP | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP merdiven | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| %100 RNAse içermeyen etanol | herhangi bir yapıcı | ||
| 5m Amonyum Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| %70 Etanol | 70ml etanol ve 30 ml nükleaz içermeyen su | ||
| Yatay Jel Kutusu için Aksesuarlar | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agaroz | herhangi bir yapıcı | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihidrat | Sigma | 10035-04-8 | E3 Orta Kılcal |
| Boru | Cole-Parmer | UX-03010-68 | enjeksiyon iğneleri için |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Bilgisayar | herhangi bir yapımcı | ||
| Diseksiyon Forcepts | herhangi bir maker | ||
| Diseksiyon Mikroskobu | herhangi bir maker | ||
| Diseksiyon Makası | herhangi bir maker | ||
| DNA Temiz & Yoğunlaştırıcı -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Jel Yükleme Boyası (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polimeraz | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader Pipet Uçları | Fischer Scientific | 10289651 | 20 mikrolitre |
| Etanol (200 geçirmez, nükleaz içermez) | herhangi bir yapımcı | ||
| Etidyum Bromür | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Balık Ağı | herhangi bir yapımcı | ince örgü | |
| Dondurulmuş Salamura Karides | LiveAquaria | CD-12018 | balık yemi |
| Jel Tarak (0.625mm) | herhangi bir yapımcı | ||
| Jel Elektroferez Sistemi | herhangi bir yapımcı | ||
| Gen Spesifik Oligonükleotid | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | ||
| Cam Kapiller İğne | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Ödenen :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds |
| Cam Tabaklar | herhangi bir yapıcı | ||
| Eldiven | herhangi bir yapımcı | ||
| Hank'in Son Çalışma Çözümü | 9.9 ml Hank's Premix'i 0.1 ml HS Stock #6 ile birleştirin | ||
| Hank's Premix | aşağıdakileri sırayla birleştirin: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Tüm HS Solosyonlarını 4C'de saklayın | ||
| Hanks Çözümü | |||
| Hank'in Çözümü | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank'in Stok Çözümü #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl 100 ml ddH2O | ||
| içinde Hank'in Stok Çözümü #2 | 0.358 g Na2HPO4 susuz; 0.60 g K2H2PO4 içinde 100 ml ddH2O | ||
| Hank'in Stok Çözeltisi #4 | 0.72 g CaCl2 içinde 50 ml ddH2O | ||
| Hank'in Stok Çözeltisi #5 | 1.23 g MgSO47H2O 50 ml ddH20 | ||
| içinde Hank'in Stok Çözümü #6 | 10.0 ml ddH20 içinde 0.35g NaHCO3; taze bir gün kullanın | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Buz Kovası | herhangi bir yapıcı | ||
| Anında Okyanus tuzu | balık suyu için | herhangi bir üretici | |
| In-Vitro Transkripsiyon Kiti, Mega Kısa Senaryo | Thermo Fischer, Scientific | AM1354 | |
| Invitrojen ve ticaret; UltraPure ve ticaret; DNase / RNaz İçermeyen Damıtılmış Su | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Orta |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Erkek ve Dişi Zebra Balığı | |||
| Mega Kısa Senaryo T7 İletim Kiti | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| metilen mavisi | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Orta |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Mikromikromanipülatör | |||
| Mikroenjeksiyon plastik kalıp | Dünyası Hassas Aletler | Z-Kalıpları | |
| Mikroenjektör | |||
| Mikroiğne Slayt | |||
| Mikropipetleyici (1-10) uçlu | herhangi bir üreticinin | filtrelenmiş p10 uçlara ihtiyacı vardır | |
| Mikropipetleyici (20-200) uçlu | herhangi bir yapıcı | ||
| Micropippetter (100-1000) uçlu | herhangi bir yapıcı | ||
| Mikroplastik kaydırak | |||
| Mikrodalga | herhangi bir yapıcı | ||
| MiliQ Su | herhangi bir Maker | ||
| mineral yağ | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Dar Spatula | herhangi bir yapıcı | ||
| İğne Çektirme | Sutter | P-97 | |
| Kağıt Havlu | herhangi bir yapıcı | ||
| Pastro Pipetler | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR astar yan kılavuz sitesi | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | ||
| PCR primerleri yan kılavuz RNA kesim bölgesi | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | Standart tuzdan arındırılmış | |
| PCR Şerit Tüpleri | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Kapları | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm çap 100mm x 15mm |
| Fenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipet Uçları | Herhangi bir yapımcı | 10ul, 200ul ve 1000ul uçlar | |
| Plastik Haşereler | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastik Kaşık | herhangi bir yapıcı | ||
| Astar Kılavuzu Site | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | ||
| Tıraş Bıçağı | Uline | H-595B | |
| RNA jel | Megashort script kitinde Boya Yükleme (in vitro transciption kiti) | ||
| RNAse | away Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse içermeyen polipropilen mikrosantrifüj tüpleri | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 RNAse içermeyen su | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Herhangi | bir yapıcıyı | ||
| Sharpie | herhangi bir yapıcı | ||
| Sodyum bikarbonat (hücre kültür test edildi) | Sigma | S5761 | balık suyu |
| Sodyum Bromür Solotion | Sigma | E1510 | |
| Sanger dizileme yazılımı Analiz | |||
| Spektrofotometre | |||
| Steril H2O | herhangi bir marka | ||
| T4 DNA Polimeraz | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Herhangi | bir marka | ||
| TBE (Tris-Borat-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Çay Lekeleyici | amazon | IMU-71133W | çoğu mutfak mağazasında mevcuttur |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipeti | Uline S-24320 | ||
| Transilluminatör | |||
| Trikain | fisher bilimsel | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Evrensel Primer | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC | |
| UV lambası | UVP | ||
| UV güvenlik gözlükleri | herhangi bir yapımcı | ||
| Yıkama Şişesi | fisher scientific | S39015 | |
| Zebra balığı çiftleşme kutuları | herhangi bir yapımcı | ||
| PCR Tampon Tarifi | 171.12 mL steril H20 ekleyin; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616 mL 1M MgCl2; 2.618 mL, 1M, Tris-HCl (pH 8.4), 13.092mL, 1M KCl; 0.262 mL %1 Jelatin. 20 dakika otoklavlayın, ardından soloyu buz üzerinde soğutun. Daha sonra 3.468 mL 100mg / mL BSA ekleyin; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100 mL). Alliquote steril eppendorf tüplerine |
Kaynaklar
- Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860(2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319(2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
