Yöntem makalesi

Böbrekte Salgılanan Proteinlerin Kaynağının Brefeldin A Enjeksiyonu ile Belirlenmesi

DOI:

10.3791/63178

⸱

10 Kasım 2021

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sitokinlerin salgılanmasından sorumlu hücre tipinin tanımlanması, böbrek hastalığının patobiyolojisini anlamak için gereklidir. Burada, bir sekresyon inhibitörü olan brefeldin A ve hücre tipine özgü belirteçler kullanılarak böbrek epitel veya interstisyel hücreler tarafından üretilen sitokinler için böbrek dokusunu kantitatif olarak boyamak için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kronik böbrek hastalığı (KBH), ABD'de önde gelen on ölüm nedeninden biridir. Akut böbrek hasarı (ABH), sıklıkla iyileşebilir olsa da, hastaları daha sonraki yaşamlarında KBH'ye yatkın hale getirir. Böbrek epitel hücreleri, hem ABH hem de KBH'de anahtar sinyal düğümleri olarak tanımlanmıştır, bu sayede hücreler sitokinlerin ve diğer proteinlerin salgılanması yoluyla hastalığın seyrini belirleyebilir. Özellikle KBH'de, çeşitli kanıtlar, uyumsuz olarak onarılmış tübüler hücrelerin, dönüştürücü büyüme faktörü-beta (TGF-β), bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF) ve diğer profibrotik sitokinlerin salgılanması yoluyla hastalığın ilerlemesini tetiklediğini göstermiştir. Bununla birlikte, in vivo olarak farklı hücre tiplerinden salgılanan proteinlerin kaynağını ve nispi sayısını belirlemek zor olmaya devam etmektedir.

Bu yazıda, sitokinlerin salgılanmasını önlemek için brefeldin A (BFA) kullanan ve standart immünofloresan teknikleri kullanılarak böbrek dokusundaki sitokinlerin boyanmasını sağlayan bir teknik açıklanmaktadır. BFA, sitokinlerin ve diğer proteinlerin salgılanması için gerekli olan endoplazmik retikulumdan (ER) Golgi aygıtına taşınmayı inhibe eder. Fedakarlıktan 6 saat önce BFA enjeksiyonu, AKI'nin bir fare sisplatin modelinde proksimal tübül hücreleri (PTC'ler) ve bir fare aristochic asit (AA) CKD modelinde TGF-β içinde TGF-β, PDGF ve CTGF birikmesine yol açar. Analiz, BFA + sisplatin veya BFA + AA'nın, tek başına BFA + salin, sisplatin veya AA'ya kıyasla TGF-β pozitif sinyali önemli ölçüde artırdığını ortaya koydu. Bu veriler, BFA'nın spesifik sitokinler üreten hücre tipini tanımlamak ve üretilen nispi miktarları ve / veya farklı sitokin türlerini ölçmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya nüfusunun %>10'unun bir tür böbrek hastalığına sahip olduğu tahmin edilmektedir1. Hızlı başlangıcı ile tanımlanan ABH, büyük ölçüde tedavi edilebilir; bununla birlikte, ABH'nin bir atağı, hastaları daha sonraki yaşamlarında KBH geliştirmeye yatkın hale getirebilir 2,3. AKI'den farklı olarak, KBH ilerleyici fibroz ve kötüleşen böbrek fonksiyonu ile işaretlenir ve böbrek replasman tedavisi gerektiren son dönem böbrek hastalığına yol açar. Böbreklerdeki yaralanmaların çoğu, nefronu oluşturan podositler veya proksimal tübül hücreleri gibi özelleşmiş epitel hücrelerini hedef alır 4,5. Yaralanmayı takiben, hayatta kalan epitel hücreleri, sitokinlerin ve diğer proteinlerin salgılanması yoluyla onarım yanıtını koordine etmeye yardımcı olur. Bu şekilde, hayatta kalan hücreler bağışıklık tepkisini modüle edebilir, hücre dışı matrisin yeniden şekillenmesini yönlendirebilir ve organ iyileşmesine yardımcı olabilir.

Sitokinler, çok hücreli organizmaların olgunlaşmasını, büyümesini ve yanıt verebilirliğini modüle etmek için gerekli olan küçük, salgılanan proteinlerdir 6,7. Bağışıklık ve epitel hücreleri8 dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri arasında sinyal habercileri olarak işlev görürler. Sitokinlerin esas olarak bağışıklık hücreleri tarafından salgılandığı düşünülse de, uzun süredir devam eden araştırmalar, böbrek epitel ve interstisyel hücrelerin, tübül hücreleri, interstisyel hücreler ve bağışıklık hücreleri gibi diğer yerleşik böbrek hücreleri için sinyal olarak sitokinler salgıladığını göstermiştir 9,10. Özellikle PTC'ler, ABI11 sonrası başlangıç ve iyileşme aşamasında önemli bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, uyumsuz olarak onarılan PTC'lerin, transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β), trombosit kaynaklı büyüme faktörü-D (PDGF-D) ve bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF) gibi profibrotik sitokinler salgıladığı ve KBH ilerlemesine katkıda bulunduğu bilinmektedir12. Bu nedenle, böbrek epitel hücreleri, böbrek hasarını modüle etmek için salgılanan sitokinleri kullanır.

Böbrek epitel hücrelerinin sitokin salgıladığı bilinmekle birlikte, salgılanan proteinleri incelemenin teknik zorlukları nedeniyle her hücre tipinin kesin kaynağını ve nispi katkısını belirlemek zor olmuştur13. Sitokinleri ölçmek için kullanılan yaygın bir yaklaşım olan akış sitometrisi, özellikle yüksek fibrotik olanlarda, yaralı böbreklerde gerçekleştirmek zordur. Bir sitokin promotörü tarafından yönlendirilen Cre rekombinaz ile, sitokin raportör fareler genellikle belirli bir sitokini eksprese eden hücre tipini tanımlamak için kullanılır. Bununla birlikte, muhabir farelerin kullanımı, muhabir fareleri çeşitli nakavt geçmişlerine çaprazlama gerekliliği, uygun raportörlerin olmaması ve bir seferde yalnızca bir sitokinin analiz edilebilmesi nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, sitokin salgılayan böbrek hücrelerini tespit etmek için basit, çok yönlü ve uygun fiyatlı bir teknik geliştirmek gerekir.

İn vivo olarak endoplazmik retikulum-Golgi taşınmasını bloke eden bir sekresyon inhibitörü olan BFA enjeksiyonunun, akış sitometrisi bazlı testler 14,15 ile gösterildiği gibi, böbrek dokusunda salgılanan proteinlerin boyanmasına izin vereceğini varsaydık (Şekil 1A,B). Hücre tipine özgü yapıcılarla birlikte, bu teknik, yaralı böbreklerde sitokin üreten hücrelerin kaynağını ve göreceli katkısını belirlemek için kullanılabilir. Akış sitometrisi için alınan örneklerin aksine, sabit dokular, proteinlerin ve hücresel yapıların korunmasıyla uzun süreli tutulabilir ve bu da salgı hücrelerinin daha kapsamlı bir şekilde araştırılmasına olanak tanır. Bu hipotezi test etmek için, fare böbrekleri bir ABH modeli (sisplatin) ve bir CKD modeli (aristochic asit nefropatisi (AAN)) ile yaralandı, BFA enjekte edildi ve standart immünofloresan teknikleri kullanılarak boyandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanıcı Komitesi tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvanlar

  1. Sisplatin veya aristolovik asit kaynaklı nefropati için 8-12 haftalık BALB / c erkek fareler (vücut ağırlığı: yaklaşık 25 g) kullanın.
  2. Farelerin sağlıklı olduğundan ve savaştan kaynaklanan belirgin bir sıkıntı veya yara belirtisi olmadığından emin olun.
    NOT: Özellikle kuyruktaki yaralar, burada açıklanan protokolü etkileyebilir. BALB/c fareleri, bu farelerde enjeksiyon için kuyruk damarını görselleştirmek daha kolay olduğu için seçildi. Burada açıklanan protokol diğer fare türleri için de geçerlidir; Bununla birlikte, sisplatin veya aristovolkanik asidin dozu, suştan suşa farklılık gösterebilir.

2. Sisplatin enjeksiyonu

  1. Sisplatini steril salin içinde 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözün.
    NOT: Sisplatin oda sıcaklığında tamamen çözünmez. Çeker ocakta ele alınmalıdır.
  2. Sisplatin çözeltisini 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın ve sisplatin tamamen eriyene kadar tekrar tekrar girdaplayın.
  3. Fareleri tartın ve 20 mg / kg vücut ağırlığı (bw) enjekte etmek için gereken sisplatin çözeltisinin hacmini hesaplayın.
  4. Karın derisini povidon-iyot (% 7.5) ve alkol (% 70) bezleri kullanarak dezenfekte edin, her biri 3 kez.
  5. 25 G iğneli bir insülin şırıngası kullanarak, sisplatin çözeltisini intraperitoneal olarak enjekte edin.
  6. Enjeksiyondan sonraki 3. günde 4. bölüme geçin.

3. Aristoloşik asit (AA) enjeksiyonu

  1. Aristolochic acid-I'i fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 0.5 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda çözün.
    NOT: AA, çeker ocakta tutulmalıdır. AA-I, böbrek hasarına neden olan baskın form olduğu için kullanılmalıdır.
  2. AA çözeltisini 37 ° C'de bir su banyosunda ısıtın ve tamamen eriyene kadar tekrar tekrar vorks yapın.
  3. Fareleri tartın ve 5 mg / kg vücut ağırlığı enjekte etmek için AA çözeltisinin hacmini hesaplayın.
  4. Karın cildini povidon-iyot (% 7.5) ve alkol (% 70) 3x swab kullanarak dezenfekte edin.
  5. 25 G iğneli bir insülin şırıngası kullanarak, AA çözeltisini intraperitoneal olarak enjekte edin.
  6. Toplam 3 enjeksiyon için her gün AA enjekte edin.
  7. Son enjeksiyondan sonraki 4. günde 42. bölüme geçin.

4. BFA çözeltisinin hazırlanması

  1. Bir stok çözeltisi yapmak için BFA'yı 10 mg / mL konsantrasyonda dimetilsülfoksit içinde çözün.
  2. Stok çözeltisini -20 °C'de saklayın.
  3. BFA stok çözeltisini 1.25 mg / mL'lik son çalışma konsantrasyonunda steril PBS ile seyreltin
    NOT: Enjeksiyondan hemen önce her seferinde yeni bir çalışma solüsyonu hazırlayın.

5. BFA'nın kuyruk damarı enjeksiyonu

  1. Enjeksiyondan önce, vücut sıcaklığındaki düşüşü önlemek için farelerin sıcak olduğundan emin olmak için kafesin yarısını 10 dakika boyunca bir ısıtma yastığının yarısını koyun, bu da kuyruktaki damarların vazokonstriksiyonuna neden olabilir ve enjeksiyonu engelleyebilir.
    NOT: Kafesi ısıtma yastıklarının üzerine yerleştirin, böylece kafesin yarısı pedin üzerinde olurken yarısı üzerinde olmayacak şekilde yerleştirin. Bu şekilde, fareler ısındıklarında kafesin diğer tarafına geçebilirler ve bunun tersi de geçerlidir.
  2. Uygun boyutta ticari olarak temin edilebilen kısıtlama cihazlarını kullanarak fareleri kısıtlayın.
  3. Yukarıda tarif edildiği gibi povidon-iyot ve alkollü çubuk kullanarak kuyruğu üç kez dezenfekte edin.
  4. Kuyruğu yatay olarak tutun ve yanal kuyruk damarlarını görselleştirin (Şekil 1C). Damarları görselleştirmeye yardımcı olması için kuyruğun altında bir ışık kaynağı kullanın.
  5. İğneyi ve şırıngayı damara paralel olarak başın yönüne doğru tutarak 28 G'lik bir iğne yerleştirin.
  6. 1.25 mg / mL BFA çözeltisinin 200 μL'sini (0.25 mg BFA) enjekte edin. Kan, enjeksiyonun başarılı olduğunu gösteren enjeksiyon solüsyonu ile değiştirilirken damarın berraklaşmasını bekleyin.
  7. İğneyi çıkarın ve kanama durana kadar kuyruğu hafifçe bastırın.
  8. Fareleri kafese geri koyun ve ek kanama veya sıkıntı belirtileri açısından izleyin.

6. Böbreklerin kurban edilmesi ve toplanması

  1. Fareleri aşırı dozda izofluran ile ötenazi yapın ve ardından BFA enjeksiyonundan 6 saat sonra servikal çıkık yapın.
    NOT: 6 saatlik zaman noktası, diğer organlarda 6 saatlik BFA tedavisinin, immünofloresan boyama16 ile hücreler içinde yeterli sitokin birikimine izin verdiğini gösteren literatüre dayanarak seçilmiştir.
  2. Kurban edildikten hemen sonra, farenin karnını ve kalbini ventral orta hat kesisi ile ortaya çıkarın.
  3. Kardiyak ponksiyon ile kan üre azotu (BUN) testi için 100-500 μL kan toplayın. Kanı almak için 1 mL insülin şırıngaları ile 25 G iğneler kullanın. Pıhtılaşmayı önlemek için, her numuneye 5 μL heparin çözeltisi (100 mg / 15 mL dH2O) ekleyin.
    NOT: BUN testi için en az 20 μL kan gereklidir; bununla birlikte, ötenaziden sonra kardiyak ponksiyon ile yaklaşık 500 μL toplanabilir, bu da diğer tahliller için yararlı olabilir. Mümkün olduğunca çok kan toplayın.
  4. Aşağıdaki 7. bölümde böbrekler toplanana kadar kan örneklerini buz üzerinde saklayın.
    1. Kan örneklerini 1,300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    2. Plazmayı nazikçe izole edin ve aşağıdaki bölüm 17'deki BUN testini gerçekleştirmeye hazır olana kadar -20 °C'de saklayın. Alternatif olarak, plazma örneklerini kreatinin tahlilleri için saklayın.

7. Böbreklerin perfüzyonu ve çıkarılması

  1. Fareyi 10-20 mL PBS ile sol ventrikülden 20 mL'lik bir şırınga kullanarak 2-4 mL / dk'lık bir akış hızında perfüze edin.
  2. Forseps ile renal atardamar ve toplardamarı papillaya yakın tutarak ve böbrekten uzak taraftaki damarları keserek böbrekleri çıkarın.
  3. Böbrek kapsülünü elle veya bir çift ince, steril forseps ile soyarak nazikçe çıkarın.
  4. Antikora bağlı olarak, sabit parafine gömülü dokunun hazırlanması için bölüm 8'e veya sabit donmuş dokunun hazırlanması için bölüm 10'a geçin.
    NOT: Boyama için kullanılacak her antikor için doku işlemenin optimize edilmesi gerekecektir.

8. TGF-β ve PDGF-D boyama için parafine gömülü doku

  1. Böbreği temiz bir cam lam üzerine yerleştirerek ve yeni bir tıraş bıçağıyla yatay olarak keserek ikiye bölün. 10 mL'lik %4 paraformaldehitin (PFA) yarısını 24 saat boyunca PBS'de dakikada 10 dönüş (rpm) hızında uçtan uca döndürücüye yerleştirin.
    NOT: Seksiyon için böbreğin tamamına gerek yoktur. Böbreğin yarısı saklanabilir veya diğer tahliller için kullanılabilir.
  2. PFA'yı %70 etanol ile değiştirin.
  3. Bu aşamada böbrek yarısını işleme ve parafin gömme için gönderin, ardından parafine gömülü böbrek dokularını bir mikrotom kullanarak 4-6 μm'de bölümlere ayırın ve bunları önceden temizlenmiş, yüklü slaytlara17,18 monte edin.
    NOT: Böbrekler, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Translasyonel Patoloji Ortak Kaynağı tarafından işlendi ve parafine gömüldü ve oda sıcaklığında saklandı.

9. Deparafinizasyon ve rehidrasyon

  1. Slaytları bir slayt boyama rafına yerleştirin ve 5 dakika boyunca D-limonen içeren bir boyama kuyusuna batırın ve dokunun tamamen suya batırıldığından emin olun. Taze D-Limonen içeren bir kuyuda tekrarlayın.
  2. Slaytları her biri 5 dakika boyunca %100 (2x), %95, %90 ve %70 etanol seri dilüsyonlarına batırarak dokuları yeniden sulandırın.
  3. Slaytları akan dH2O'da 5 dakika yıkayın.
  4. Bölümleri sitrat tamponunda (pH 6.0) bir düdüklü tencerede 121 ° C'de ve 15 psi'de 45 dakika inkübe ederek antijen alımını gerçekleştirin.
  5. Slaytları akan dH2O'da 20 dakika yıkayın.
  6. Bölüm 12'ye geçin.

10. CTGF boyama için donmuş dokunun hazırlanması

  1. Yeni bir tıraş bıçağı kullanarak böbreği yatay eksen boyunca ikiye bölün.
    NOT: Seksiyon için böbreğin tamamına gerek yoktur. Böbreğin yarısı saklanabilir veya diğer tahliller için kullanılabilir.
  2. Böbrek yarısını, 10 rpm hızında 4 ° C'de 2 saat boyunca bir döndürücü üzerinde 15 mL'lik bir tüpte 10 mL% 0.5 PFA'ya koyun.
  3. PFA'yı uygun şekilde bertaraf etmek için bir kaba boşaltın ve PBS'ye 10 rpm hızında 4 ° C'de 1 saat boyunca 10 mL 0,1 M glisin ekleyin.
  4. Glisini boşaltın, PBS'de çözünmüş 10 mL% 15 sükroz ekleyin ve tüpü gece boyunca 4 ° C ve 10 rpm'de bir döndürücüye yerleştirin.
  5. % 15 sükrozu boşaltın ve% 30 sakaroz% 30 ile değiştirin, PBS'de 1 saat boyunca 4 ° C ve 10 rpm'de çözülür.
  6. Gömme kalıbını optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ile doldurun ve böbreğin yarısını, böbreğin kesilmiş yüzeyi aşağı bakacak şekilde adım 10.5'ten gömün.
  7. Yarım böbrek ve OCT içeren kalıbı dondurmak için dikkatlice bir sıvı nitrojen havuzuna yerleştirin.
    NOT: Kabarcık oluşumuna neden olabileceğinden sıvı nitrojenin OCT ile doğrudan temas etmesine izin vermeyin. Sıvı nitrojen kullanırken gözlük/yüz siperi, kriyojenik eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. Kalıpları sıvı nitrojen içine yerleştirmek için uzun, ~ 25 cm forseps kullanmak en iyisidir.
  8. Katı donduktan sonra kalıbı -80 °C'de saklayın.

11. Donmuş kesit alma

  1. Kriyostatın -20 °C'de olduğundan emin olun.
  2. Sıcaklığı dengelemek için OCT'de numune içeren kalıpları kriyostatta -20 °C'de 2 saat saklayın.
  3. Tırnakları tutarak ve alttan bastırarak kalıbı çıkarın.
  4. Taze OCT'yi bir numune tutucuya koyun ve donmuş numune bloğunu, doku tarafı numune tutucudan uzağa bakacak şekilde üstüne yerleştirin.
  5. Numune tutucuyu ve numuneyi dondurucu rafa yerleştirin.
  6. Yüzeyi düzleştirmek için bloğun üzerine ağırlıklı bir ısı aspiratörü yerleştirin. Sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için kullanılmadığı zaman kriyostat kapağını kapalı tutun.
  7. Numune bloğu ile numune tutucu arasındaki taze OCT donduktan sonra, bağlantının sağlam olduğundan emin olmak için kontrol edin.
  8. Numune tutucuyu kriyostat mikrotom kafasına sıkıştırın.
  9. Doku numune bloğunda görünene kadar kesit almaya başlayın.
  10. Böbrek dokusunu 4-6 μm'de bölümlere ayırın ve bölümleri oda sıcaklığında şarj edilmiş bir slayta19 alın.
  11. Mendil alındıktan sonra, lekelenmeye hazır olana kadar slaytı -20 °C ila -80 °C arasında saklayın. Lekelenmeye başlamaya hazır olana kadar çözülmesine izin vermeyin.
  12. Boyamadan önce, slaytları depodan çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Bölümlerin kurumasına izin vermeyin.
  13. Oda sıcaklığına geldikten sonra, OCT bileşiğini ortadan kaldırmak için bölümleri hemen oda sıcaklığında iki kez 5 dakika PBS ile yıkayın.
  14. Bölüm 12'ye geçin.

12. İmmünofloresan boyama

  1. Doku bölümlerini hidrofobik bir bariyer işaretleyici kalemle çizin. Dokudan hidrofobik bariyer taslağına en az 5 mm mesafe bırakın.
  2. Bölümün üzerine %3 eşek serumu ve %1 sığır serum albümini/Tris tamponlu salin (TBS) içinde %0.1 Triton içeren 50 μL bloke edici tampon ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  3. Birincil antikorları uygun konsantrasyonda PBS ile seyreltin. Sitokinlerin tespiti için, TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) ve CTGF'ye (1:200) karşı yönlendirilmiş 50 μL primer antikor çözeltileri kullanın. Miyofibroblastları etiketlemek için, 1:200'de Cy3 ile konjuge edilmiş alfa-düz kas aktinine (α-SMA) karşı yönlendirilmiş 50 μL'lik bir birincil antikor çözeltisi kullanın.
  4. Bloke edici solüsyonu çıkarın ve birincil antikorları bölüme ekleyin, dairesel hidrofobik anahattan sızmamasını sağlayın ve nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Sızıntı meydana gelirse hidrofobik bariyeri yeniden uygulayın.
  5. 3x'i PBS ile 5 dakika yıkayın.
  6. Uygun ikincil antikorları PBS ile 1:200'de seyreltin.
  7. Numuneleri 50 μL ikincil antikor solüsyonları ile nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  8. PBS ile 5 dakika yıkayınız.
  9. PBS'de floresein ile konjuge edilmiş lotus tetragonolobus lektinini (LTL) 10 μg/mL konsantrasyonda Ca2+ ve Mg2+ ile seyreltin.
    NOT: LTL bağlaması için Ca2+ ve Mg2+ gereklidir.
  10. Dokuları 50 μL LTL çözeltisi ile nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  11. PBS ile Ca2+ ve Mg2+ ile 5 dakika yıkayın.
  12. DNA/çekirdekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyamak için 50 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, suda 5 μg/mL) ile inkübe edin.
  13. Doku üzerine 20 μL antifade montaj reaktifi ekleyerek ve lameli yavaşça yerleştirerek lamellerin montajını yapın. Görüntülemeden önce antifade reaktifinin katılaşması için 24 saat bekleyin.
    NOT: Lektin bağlanması zamanla bozulabilir ve bu da sinyal kaybına neden olabilir. Montaj reaktifi kurulduktan hemen sonra lektin lekeli numuneleri görüntülemek en iyisidir. Sinyal kaybı gözlenirse, lekelenmeyi korumak için montaj reaktifine Ca2+ ve Mg2+ eklenebilir.

13. Görüntü edinme

  1. Ters çevrilmiş mikroskobu otomatik bir XY aşaması ile açın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  2. 20x reklam verme amacını seçin.
  3. Görüntü alma yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  4. Canlı görüntü penceresini açmak için Canlı'ya tıklayın.
  5. Doku bölümünü bulun ve odakta olduğundan emin olun.
  6. Edin'e tıklayın menüsüne tıklayın ve Büyük Resmi Tara'yı seçin.
  7. Büyük Görüntüyü Tara penceresinde, oyun çubuğunu kullanarak sahneyi doku bölümünün en sol kısmına hareket ettirerek taranacak alanı ayarlayın ve sol oka tıklayın. En üst, en sağ ve alt doku segmentleri için tekrarlayın.
  8. Satın alma menüsüne tıklayın.
  9. Büyük resim için onay kutusunun işaretli olduğundan emin olun.
    1. Çok kanallı görüntüler çekiyorsanız Lambda sekmesine tıklayın.
    2. Her kanala tıklayın ve pozlama süresini , görüntünün herhangi bir bölümünün doygunluğu olmadan lekelenmenin belirgin olduğu bir seviyeye ayarlayın.
      NOT: Bu ayarların tek bir deney grubu içinde tutarlı olması gerekir. Numuneler arasında alım ayarlarının değiştirilmesi yanlış sonuçlara yol açacaktır.
    3. Toplanacak her kanal için adım 9.2'yi tekrarlayın.
  10. Tara'ya tıklayın.

14. Görüntü analizi

  1. Görüntü alma yazılımını açın.
  2. Dosya | Görüntüyü açın ve seçin.
  3. Görüntü penceresine sağ tıklayın ve çokgen ilgi alanı (ROI) öğesini seçin.
  4. Serbest el aracıyla yatırım getirisini ana hatlarıyla belirtin. LTL-pozitif tübül hücrelerini veya α-SMA-pozitif interstisyel hücreleri ana hatlarıyla belirtin.
  5. Ölçüm sekmesine tıklayın | Eşik.
  6. Kaydırıcıları pozitif sinyal alanının her iki tarafına ayarlayarak eşiğin üst ve alt sınırlarını ayarlayın.
  7. ROI sekmesine tıklayın.
  8. Değerleri kaydetmek için Dışa Aktar simgesine tıklayın. Pozitif sinyal alanı/ROI alanı yüzdesini hesaplamak için elektronik tablo yazılımını kullanın.

15. Alternatif: Özgür yazılım ile görüntü analizi (ImageJ)

  1. ImageJ'yi açın.
  2. Dosya | Bir resmi görüntülemek için açın.
  3. Serbest seçimleri tıklayın.
  4. Serbest el aracıyla ana hatlarını çizerek yatırım getirisini seçin. LTL-pozitif tübül hücrelerini veya α-SMA-pozitif interstisyel hücreleri ana hatlarıyla belirtin.
  5. Düzenle menüsünü tıklayın ve Dışını temizle'yi seçin.
  6. ROI alanını belirlemek için Analiz Et'e tıklayın ve Ölç'ü seçin.
  7. Resme Git | Renk | Kanalları Böl.
  8. Pozitif sinyal alanını algılamak için eşiğin üst ve alt sınırlarını ayarlayın.
  9. Analiz Et'e tıklayın ve Ölç'ü seçin.
  10. Verileri kaydedin.
  11. Verileri elektronik tablo yazılımıyla açın ve pozitif sinyal alanı/ROI alanı oranını hesaplayın.

16. İsteğe bağlı: Lazer taramalı konfokal mikroskop ile görüntüleme

NOT: Yayın için daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için, taramalı konfokal mikroskopi, böbrek dokusunda daha net görüntüler ve azaltılmış arka plan sağlar.

  1. Lazer taramalı konfokal mikroskobu açın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  2. 40x objektifi seçin ( Malzeme Tablosuna bakın).
  3. Bul sekmesine tıklayın ve odağı ayarlayarak dokuları bulun.
  4. Edinme sekmesine gidin, Kanallar'a tıklayın ve iğne deliği ayarında 1 AU'yu seçin.
  5. Her kanaldaki lazer kazanç yoğunluğunu, pozitif sinyal görünür olacak ancak doygun olmayacak şekilde ayarlayın. Bir dizi deneysel örnek içindeki ayarların sabit kaldığından emin olun.
  6. Tuttur'a tıklayın ve görüntüyü istediğiniz formatta kaydedin.

17. Plazma BUN seviyesi

  1. Numuneleri -20 °C'den çıkarın ve buz üzerinde çözdürün.
  2. Plazmayı 1:10 oranında dH2O ile seyreltin.
  3. Her numune için, 96 oyuklu bir plakada iki kez üç ayrı reaksiyon ayarlayın.
    1. Numune artı standart için 5 μL 200 mg/dL üre ve 20 μL seyreltilmiş plazma ekleyin.
    2. Sadece numune için 5 μL dH2Ove 20 μL seyreltilmiş plazma ekleyin.
    3. Boş numune için 5 μL dH2O ve 20 μL seyreltilmiş plazma ekleyin.
  4. Çalışma solüsyonunu hazırlamak için numune başına 85 μL reaktif + 1 μL üreaz karıştırın.
  5. 'Numune artı standart' ve 'tek başına numune' kuyucuklarına 80 μL çalışma solüsyonu ekleyin.
  6. Yukarıdaki adım 17.3'ten itibaren 'numune boşluğuna' 80 μL reaktif (üreaz yok) ekleyin.
  7. Karıştırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmek için plakaya hafifçe vurun.
  8. OD560'ı bir plaka okuyucu ile okuyun.
  9. Üre konsantrasyonunu Eq (1) hesaplayın ve Eq (2) kullanarak BUN'a dönüştürün.
    Üre (mg/dL) = (Tek başına numune-Numune boş)/(Standart-Tek başına numune) x (Standart/4) x (seyreltme faktörü) (1)
    BUN (mg/dL) = Üre konsantrasyonu/2.14 (2)
    NOT: Bu test, serumun üre (moleküler ağırlık: 60) içeriğini ölçer; bununla birlikte, BUN yalnızca ürenin nitrojen içeriğine atıfta bulunur (moleküler ağırlık: 28). Bu nedenle, üre konsantrasyonunu BUN'a dönüştürmek için 2.14'lük (60/28) bir düzeltme gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sisplatin kaynaklı ABH'yi takiben sitokin üretiminde tübüler epitel hücrelerinin rolünü incelemek için, sisplatin enjeksiyonundan sonraki 3. günde 20 mg / kg'lık bir konsantrasyonda sisplatin enjekte edildi ve ardından 0.25 mg BFA intravenöz enjeksiyonu yapıldı. Böbrekler 6 saat sonra alındı. Parafine gömülü böbrekler, ABH'de doku onarımından sorumlu temsili sitokinler olan TGF-β, PDGF-D ve CTGF ile kesitlere ayrıldı ve boyandı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, BFA varlığında sisplatin ile ted...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbrek PTC'lerinin TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve diğer birçok proteinin salgılanması yoluyla ABH ve KBH'yi düzenlediği bilinmektedir 20,21,22,23. Benzer şekilde, glomerüller, distal tübüller ve diğer böbrek epitel hücreleri ile interstisyel hücreler, yaralanma sırasında bunları ve/veya diğer proteinleri salgılar 24,25,26.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amerikan Kalp Derneği (AHA): Kensei Taguchi, 20POST35200221; HHS | NIH | Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK): Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL İnsülin şırıngalarıBD329654
10 mL ŞırıngaBD302995
2 mL tüpFisher marka05-408-138
20 mL ŞırıngaBD302830
25 G iğnelerBD305125
28 G iğnelerBD329424
96 kuyulu plakaCorning9017
Aristolochic acid-ISigma-AldrichA9461
α-SMA antikoru, Cy3Sigma-AldrichC6198RRID ile konjuge edilmiştir: AB_476856
Kriyostat CL Sturkey için bıçak. IncDT315R50
Sığır serum albümini (BSA)  Sigma-AldrichA7906
Brefeldin ASigma-AldrichB6542
SisplatinSigma-AldrichP4394
Sitrik asitSigma-Aldrich791725
Konfokal mikroskopZEISS  LSM710
Konfokal mikroskopi objektifleriZEISS40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
Konfokal yazılımZEISSZEN
Coplin kavanozFisher Scientific19-4
Kapak camıFisher marka12545F
KriyostatLeicaCM1850
CTGF antikoruGenetexGTX124232RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson immün araştırma711-165-152RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Eşek Anti-Keçi IgG (H + L)Jackson immün araştırma705-175-147RRID: AB_2340415
DAPISigma-AldrichD9542
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Tek kullanımlık taban kalıplarıFisher marka22-363-553
eşek serumuJackson immunoresearch017-000-121
EtanolDecon Labs, Inc.2701
ForsepsVETUSESD-13
GlisinFisher marka12007-0050
Isıtma pedleriKent scientificDCT-20
Heparin sodyum tuzuACROS organikleri41121-0010100mg/15ml dH2O
Nemlendirilmiş odaInvitrogen44040410Folyo ile kaplı plastik bir kutu olarak kullanılabilir. alternatif nemlendirilmiş oda.
İnsülin şırıngalarıBD329461
Ters mikroskopNIKONEclipse Ti-E2immünofloresan
KIM-1 antikoruR & DAF1817RRID: AB_2116446
Lemozol (Histo-clear)Ulusal tanıHS-200
lotus tetragonolobus lektinVektörFL-13212
Mikroskop lamıFisher scientific12-550-343
MikrotomReichertJung 820 II
monokrom CMOS kameraNIKON  DS-Qi-2
Fare cerrahi kitiKent scientificINSMOUSEKIT
NIS ElemanlarıNIKON
HedefleriNIKONPlan Apo 20x/0.75Eclipse Ti-E2'ye bağlı görüntü elde etme yazılımı (ters mikroskop)
OCT bileşiğiScigen4586
Pap kalemVectorH-4000
Kalsiyum ve magnezyum içeren PBSCorning21-030-CV
Kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS  Corning21-031-CV
PDGF-D antikoruThermo-Fisher bilimsel40-2100
PFAElektron Mikroskobu Bilimi15710RRID: AB_2533455
Plaka okuyucuPromegaGloMax ve reg; Discover Microplate Reader4% PFA, PBS'de% 16'dan seyreltilir.
povidon-iyot (Betadine)Avrio Health L.P.NDC 67618-151-17
Düdüklü tencere  Tristar 8Qt. Power Cooker Plus
ProLong Altın Antifade ReaktifiInvitrogenP36930
Quantichrom Üre (BUN) test Kiti IIBioAssay SistemleriDUR2-100
Böbrek diseksiyonu için tek kenarlı tıraş bıçağı (.009", 0.23 mm)IDL aletleri521013
Slayt ısıtıcıLab Scientific Inc.,XH-2001
YazılımNIKONNIS elemanları
SükrozRPIS24060
TGF-b1 anitbodySigma-AldrichSAB4502954
Tris EDTA tamponuCorning46-009-CMRRID: AB_10747473
Trisodyum sitrat dihidratSigma-AldrichSLBR6660V
Trisodyum sitrat dihidratSigma-Aldrich
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Beyaz Cam Şarjlı Mikroskop Slaytı, 25 x 75 mm Boyut, Zemin Kenarları, Mavi BuzluKüre Scientific1358D
SLBR6660V

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).
  2. Canaud, G., Bonventre, J. V. Cell cycle arrest and the evolution of chronic kidney disease from acute kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 30 (4), 575-583 (2015).
  3. Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes. New England Journal of Medicine. 371 (1), 58-66 (2014).
  4. Berger, K., Moeller, M. J. Mechanisms of epithelial repair and regeneration after acute kidney injury. Seminars in Nephrology. 34 (4), 394-403 (2014).
  5. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. The Journal of clinical investigation. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  6. Kurts, C., Panzer, U., Anders, H. J., Rees, A. J. The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications. Nature Reviews. Immunology. 13 (10), 738-753 (2013).
  7. Panzer, U., Steinmetz, O. M., Stahl, R. A., Wolf, G. Kidney diseases and chemokines. Current Drug Targets. 7 (1), 65-80 (2006).
  8. Commins, S. P., Borish, L., Steinke, J. W. Immunologic messenger molecules: cytokines, interferons, and chemokines. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 53-72 (2010).
  9. Jaber, B. L., et al. Cytokine gene promoter polymorphisms and mortality in acute renal failure. Cytokine. 25 (5), 212-219 (2004).
  10. Black, L. M., Lever, J. M., Agarwal, A. Renal inflammation and fibrosis: A double-edged sword. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (9), 663-681 (2019).
  11. van Kooten, C., Woltman, A. M., Daha, M. R. Immunological function of tubular epithelial cells: the functional implications of CD40 expression. Experimental Nephrology. 8 (4-5), 203-207 (2000).
  12. Canaud, G., et al. Cyclin G1 and TASCC regulate kidney epithelial cell G2-M arrest and fibrotic maladaptive repair. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
  13. Burton, C. J., Combe, C., Walls, J., Harris, K. P. Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 14 (11), 2628-2633 (1999).
  14. Ripley, C. R., Fant, J., Bienkowski, R. S. Brefeldin A inhibits degradation as well as production and secretion of collagen in human lung fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3677-3682 (1993).
  15. Kovacs, S. B., Oh, C., Aachoui, Y., Miao, E. A. Evaluating cytokine production by flow cytometry using brefeldin A in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100244(2021).
  16. Fujiwara, T., Oda, K., Yokota, S., Takatsuki, A., Ikehara, Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 263 (34), 18545-18552 (1988).
  17. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  18. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58288(2018).
  19. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53179(2015).
  20. Chung, S., et al. TGF-β promotes fibrosis after severe acute kidney injury by enhancing renal macrophage infiltration. JCI Insight. 3 (21), 123563(2018).
  21. Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. TGF-β: the master regulator of fibrosis. Nature Reviews. Nephrology. 12 (6), 325-338 (2016).
  22. Kok, H. M., Falke, L. L., Goldschmeding, R., Nguyen, T. Q. Targeting CTGF, EGF and PDGF pathways to prevent progression of kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 10 (12), 700-711 (2014).
  23. Engel, J. E., Williams, E., Williams, M. L., Bidwell, G. L., Chade, A. R. Targeted VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy induces long-term renal recovery in chronic kidney disease via macrophage polarization. Hypertension. 74 (5), 1113-1123 (2019).
  24. Liu, B. C., Tang, T. T., Lv, L. L., Lan, H. Y. Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease. Kidney International. 93 (3), 568-579 (2018).
  25. de Haij, S., Woltman, A. M., Bakker, A. C., Daha, M. R., van Kooten, C. Production of inflammatory mediators by renal epithelial cells is insensitive to glucocorticoids. British Journal of Pharmacology. 137 (2), 197-204 (2002).
  26. Hong, S., Healy, H., Kassianos, A. J. The emerging role of renal tubular epithelial cells in the immunological pathophysiology of lupus nephritis. Frontiers in Immunology. 11, 578952(2020).
  27. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  28. See, P., Lum, J., Chen, J., Ginhoux, F. A single-cell sequencing guide for immunologists. Frontiers in Immunology. 9, 2425(2018).
  29. Gewin, L., et al. Deleting the TGF-β receptor attenuates acute proximal tubule injury. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (12), 2001-2011 (2012).
  30. Nlandu-Khodo, S., et al. Blocking TGF-β and β-catenin epithelial crosstalk exacerbates CKD. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3490-3503 (2017).
  31. Brooks, C. R., et al. KIM-1-/TIM-1-mediated phagocytosis links ATG5-/ULK1-dependent clearance of apoptotic cells to antigen presentation. EMBO Journal. 34 (19), 2441-2464 (2015).
  32. Kishi, S., et al. Proximal tubule ATR regulates DNA repair to prevent maladaptive renal injury responses. The Journal of Clinical Investigation. 129 (11), 4797-4816 (2019).
  33. Yu, S. M., Bonventre, J. V. Acute kidney injury and maladaptive tubular repair leading to renal fibrosis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (3), 310-318 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

B brek Salg l ProteinlerSitokin TespitiAkut B brek HasarKronik B brek HastalProksimal T b l H crelerimm nofloresan BoyamaTGF Beta BirikimiKuyruk Veni EnjeksiyonuKonfokal Mikroskopi

İlgili makaleler