Sıçanlarda Nöroplastisiteyi Tersine Çevirmek ve Kokain Arayışını Engellemek için Optogenetiği Kullanmak

Özet

Burada açıklanan yöntemler, sıçanlarda davranışsal olarak ilgili bir devrede kokain kaynaklı plastisiteyi optogenetik olarak tersine çevirmek için kullanılan bir prosedürü özetlemektedir. Talamo-amigdala sinapslarının sürekli düşük frekanslı optik stimülasyonu uzun süreli depresyona (LTD) neden olur. Kokain deneyimli sıçanlarda in vivo optogenetik olarak indüklenen LTD, ipucu güdümlü uyuşturucu arayışının daha sonra zayıflamasına neden oldu.

Özet

Bu protokol, sıçanda sonraki kokain arama davranışlarını azaltmak için talamo-amigdala devrelerinde kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için optogenetik araçları kullanmak için gereken adımları göstermektedir. Araştırmamızda, sıçanlar görsel-işitsel bir ipucu ile eşleştirilmiş intravenöz kokaini kendi kendine uyguladıklarında, talamusun (MGN) medial genikülat çekirdeğinden lateral amigdala'nın (LA) ana nöronlarına yapılan girdilerde oluşan sinapsların, ipucu-kokain ilişkisi öğrenildikçe güçlendiğini bulmuştuk. Bu sinapslarda kokain kaynaklı plastisitenin tersine çevrilmesinin, ipucu motivasyonlu kokain arama davranışını azaltacağını varsaydık. Bu tip nöromodülasyonu in vivo olarak gerçekleştirmek için, MGN-LA sinapslarının gücünü azaltan sinaptik uzun süreli depresyonu (LTD) indüklemek istedik. Bu amaçla, ışık kullanarak beyin devrelerinin nöromodülasyonuna izin veren optogenetiği kullandık. Uyarıcı opsin oChiEF, LA'daki presinaptik MGN terminallerinde, MGN'ye oChiEF içeren bir AAV infüze edilerek eksprese edildi. Optik fiberler daha sonra LA'ya implante edildi ve 473 nm lazer ışığı, LTD'yi indüklemek ve kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için 15 dakika boyunca 1 Hz frekansında darbelendi. Bu manipülasyon, kokain ile ilişkili ipuçlarının uyuşturucu arama eylemlerini tetikleme yeteneğinde uzun süreli bir azalma sağlar.

Giriş

Madde bağımlılığı, ABD'de ve dünya çapında çok ciddi bir halk sağlığı sorunudur. Onlarca yıllık yoğun araştırmalara rağmen, çok az sayıda etkili terapötik seçenek vardır ^1,2. Tedavideki önemli bir gerileme, kronik uyuşturucu kullanımının çevresel ipuçları ile ilacın kendisi arasında uzun süreli ilişkisel anılar oluşturmasıdır. İlaçla ilgili ipuçlarına yeniden maruz kalmak, devam eden uyuşturucu kullanımını ve nüksetmeyi motive eden fizyolojik ve davranışsal tepkileri yönlendirir³. Yeni bir terapötik strateji, ilaç-ipucu ilişkilerinin düzenlenmesinde yer alan devreleri manipüle etmeyi amaçlayan hafıza tabanlı tedavileri yürürlüğe koymaktır. Son zamanlarda, lateral amigdaladaki (LA) sinapsların, özellikle talamusun medial genikülat çekirdeğinden (MGN) kaynaklananların, tekrarlanan ipucu ile ilişkili kokain kendi kendine yönetimi ile güçlendirildiği ve bu potansiyelin kokain arama davranışını destekleyebileceği gözlenmiştir ^4,5. Bu nedenle, MGN-LA sinapslarında plastisiteyi tersine çevirerek ipucu kaynaklı eski haline getirmenin zayıflatılabileceği önerilmiştir.

Belirli bir beyin devresinin sinaptik plastisitesini tam olarak hedefleme yeteneği, alan için büyük bir zorluk olmuştur. Geleneksel farmakolojik araçlar, nüks davranışlarını azaltmada bazı başarılara sahiptir, ancak bireysel sinapsları manipüle edememe ile sınırlıdır. Bununla birlikte, in vivo optogenetiğin son zamanlardaki gelişimi, bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve nöral yolları zamansal ve mekansal hassasiyetle kontrol etmek için gereken araçları sağlamıştır ^6,7,8. Belirli bir beyin devresinde ışığa duyarlı opsinleri ifade ederek, lazer ışığı daha sonra devreyi aktive etmek veya inhibe etmek için kullanılabilir. Frekansa bağlı optik stimülasyon, davranan bir hayvanda devrenin sinaptik plastisitesini spesifik olarak manipüle etmek için kullanılabilir.

Bu makale, in vivo optogenetik kullanarak davranışsal olarak ilgili MGN-LA devresini manipüle etmek için alınan prosedürü özetlemektedir. İlk olarak, uyarıcı opsin oChIEF MGN'de eksprese edildi ve optik fiberler LA'ya iki taraflı olarak implante edildi. Hayvanlar daha sonra MGN-LA yolunu güçlendiren ipucuna bağımlı bir şekilde kokaini kendi kendine yönetmek için eğitildi. Daha sonra, 473 nm lazer ışığı ile sürekli, düşük frekanslı stimülasyon, devreye özgü LTD üretmek için kullanıldı. kokain kullanımının neden olduğu plastisiteyi tersine çevirmek, uyuşturucu arama davranışı ile ilişkili eylemleri tetiklemek için ipuçlarının kapasitesinde uzun süreli bir azalma yarattı.

Protokol

Bu protokolde açıklanan deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından ortaya konan kılavuzlarla tutarlıydı ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler, varışta 275-325 g ağırlığındaki yetişkin, naif Sprague-Dawley sıçanları kullanılarak gerçekleştirildi.

1. Optik Fiber İmplantların ve Patch Kabloların Yapımı

1. Daha önce yayınlanmış protokolleri izleyerek optik fiber implantlar hazırlayın⁹. Bu protokolde açıklanan deneylerde 200 μm çekirdek fiber (0.5 NA) ve Ø1.25 mm Çok Modlu LC/PC Seramik yüksük, Ø230 μm delik boyutu kullanılmıştır.
   1. Bir yüksüğün alt üçte birini (yüksüğün düz ucuna en yakın) puanlamak için bir Dremel aracı kullanın. Yüksüklerin puanlanması, diş çimentosuna bağlı kalmalarına yardımcı olur ve tüm deney boyunca güvende kalma olasılıklarını artırır.
   2. ~ 35 mm elyaf kesmek için tel kesiciler kullanın. ~ 25 mm elyafı sıyırmak için fiber sıyırma aletini kullanın ve 10 mm'yi maruz kalmadan bırakın.
   3. Üreticinin talimatlarına göre ısıl kürlenebilir epoksi hazırlayın. 1 g reçine tozunu 100 mg sertleştirici bileşiğinde çözün. 1 mL'lik bir şırıngaya körelmiş 25 gauge iğne takın. Şırıngayı epoksi ile doldurun ve körelmiş 25 gauge iğne ucu takın.
   4. Yüksüğü düz tarafı yukarıya, dışbükey tarafı aşağıya bakacak şekilde güvenli bir şekilde tutmak için bir mengene veya kelepçe kullanın. Epoksi dolu şırınga ile, yüksüğün kenarlarından fazla epoksiyi silmek için dikkatli davranarak yüksüğün düz tarafına bir damla epoksi ekleyin.
   5. Elyafın soyulmuş kısmını, fazladan 5 mm soyulmuş lifin açığa çıkmasına izin veren yüksüğün içinden yerleştirin. LA implantları durumunda, lif bregmaya 7.9 mm ventral olarak implante edilecektir, bu nedenle soyulmamış lifin maruz kalan uzunluğu ~ 13 mm olmalıdır.
   6. Epoksiyi siyah / kehribar rengine dönene kadar yaklaşık 30-40 s ısı tabancasıyla kürleyin.
   7. Fiberi doğrudan yüksüğün dışbükey ucunun arayüzünde elmas bıçakla puanlayın ve elyafa hafifçe dokunmak için parmağınızı kullanın.
   8. Yüksüğün dışbükey ucunu bir hemostatla tutarak, eşit basınç uyguladığınızdan emin olarak ve bir dizi parlatma kağıdı üzerinde her biri 20 dairesel dönüş yaparak (yüksek dereceden düşük dereceye; 5, 3, 1, 0.3 μm) cilalayın.
   9. Şeritsiz elyafı bant kullanarak masaya sabitleyin ve soyulmuş lifi puanlayın, ventral koordinatın ötesinde fazladan 2 mm bırakın (LA implantları için, lifin son uzunluğu ~ 10 mm'dir). Yüksüğü çekmek için bir hemostat kullanın ve lifi puanlandığı yerde eşit şekilde kırın. Puanlama sırasında lifi tamamen kesmemeye dikkat edin, aksi takdirde lifin çekirdeği zarar görür.
2. Optik fiber implantlarla uyumlu yamalı kablolar oluşturun. Özel tasarım yamalı kablolar satın alınmıştır ( Bkz. Malzeme Tablosu). Alternatif olarak, yama kabloları daha önce yayınlanmış protokoller⁹ izlenerek oluşturulabilir.
   NOT: Yüksük lifi ve yama kablosu fiberinin çapı ve NA'sı, aşırı ışık kaybını önlemek için bağlantı noktasında eşleşmelidir, bu da nöral aktivitenin yeterince uyarılmamasına neden olabilir.
3. Yama kablosu/optik fiberi uygun bir lazer ışık kaynağına (473 nm, 1 mW çıkış) takarak ve bir ışık sensörü ile çıkışı ölçerek patch kablo ve optik fiber implantlar aracılığıyla ışık çıkışını ölçün. Başarılı bir şekilde inşa edilmiş bir fiber, eşmerkezli bir ışık çemberi yayar ve% 30'dan fazla ışık kaybına sahip olmaz.

2. Kemirgen İntravenöz Kateterizasyon, Virüs Dağıtımı ve Optik Fiber İmplantasyonu

1. Hayvanı ameliyat için hazırlayın.
   1. Kurumsal kılavuzlara dayanarak tercih edilen anestezi ile sıçanları tamamen anestezi altına alın. Bir seçenek ketamin hidroklorür (87.5-100 mg / kg, i.m.) ve ksilazin hidroklorürdür (5 mg / kg, i.m.). Ayak parmağı sıkışma refleksinin eksikliğini kontrol ederek sıçanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
      DİKKAT: Ketamin, kurumsal yönergelere göre ele alınması gereken kontrollü bir maddedir.
      NOT: Bu çalışmada intramüsküler anestezik enjeksiyonu, intraperitoneal enjeksiyondan daha hızlı ve güvenilir bir anestezi indüksiyonu sağladığı için kullanılmıştır. Sıçanın solunumunu ve duyarlılığını sürekli izleyin ve ameliyat boyunca termal destek sağlayın.
   2. Sıçanın sırtının geniş bir alanını (üst sırttan omuz bıçaklarının hemen üstünden sırtın ortasına kadar) ve ayrıca sağ ön ayağın altındaki boynun alanını ve kafa derisini tıraş edin.
   3. Sıçanı cerrahi bölgeye yerleştirin ve gözlere puralube (yapay gözyaşı) uygulayın. Üst sırtın derisinden deri altından (s.c.) bir vücut ağırlığı karprofen (analjezik) hacmi enjekte edin, ardından alt sırtın derisinden 5 mL Laktasyonlu Ringer çözeltisi sc'yi enjekte edin.
   4. Bir parça steril gazlı bezi betadin ile ıslatarak ve dairesel bir hareket kullanarak tıraş edilmiş cerrahi alanı silerek tüm cerrahi bölgeleri sterilize edin. Ardından% 70 etanol ile işlemi tekrarlayın. Bu alternatif döngüyü üç kez tekrarlayın.
2. İntravenöz kateter implantasyonunu daha önce yayınlanmış protokollere göre^{yapın 4,10}.
   NOT: Kateter implantasyonu sırasında tahrişi önlemek için bu ameliyat sırasında cerrahi bir örtü kullanılmaz. Kullanmadan önce tüm aletleri ve ekipmanları sterilize edin. Steril eldivenler kullanın ve steril olmayan herhangi bir yüzeye temas edilirse eldivenleri değiştirin.
3. Kateter implantasyonlarının hemen ardından, AAV enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için sıçanı stereotaksik bir çerçevede sabitleyin.
   1. Lokal anestezik olarak kafa derisine% 2 lidokain (0.2-0.3 mL) subkutan (s.c) enjeksiyonu yapın.
      NOT: İntravenöz kateter implantasyonu sırasında cerrahi sonuçlarda değişiklik olmasını önlemek için lokal anestezik kullanılmaz.
   2. 26 gauge paslanmaz çelik enjeksiyon kanülünü, 1 μL konsantre AAV çözeltisi ile doldurulmuş bir Hamilton şırıngasına bağlayın: AAV5-hSyn-tdDomates veya AAV5-hSyn-oChIEF-tdDomates
      NOT: oChIEF, çok çeşitli frekanslara ^8,11 yanıt verebilen mavi ışığa duyarlı opsin channelrhodopsin (ChR2) bir varyantıdır ve bu nedenle bu protokolde tartışılan düşük frekanslı LTD deneyleri için değil, aynı zamanda yüksek frekanslı LTP deneyleri için de faydalıdır (burada tartışılmamıştır). oChIEF yapısı Dr. Roger Tsien tarafından bağışlandı ve Duke Viral Vector Core tarafından paketleme ve saflaştırma için işlendi. MGN akson terminallerinde optimal virüs ekspresyonuna izin vermek için enjeksiyon günü ile LTD indüksiyonu günü arasında en az 3-4 hafta gereklidir.
      DİKKAT: Genel olarak, AAV, üretiminde yardımcı bir virüs kullanılmadığı sürece kendi kendine enfeksiyon riski düşük olan bir Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL-1) organizması olarak kabul edilir. Kullanımı IACUC onayını gerektirir ve gereksiz maruziyeti sınırlamak için kurumsal yönergelere uygun olarak her zaman uygun KKD kullanılmalıdır.
   3. Bir neşter kullanarak, kafatasının önünden arkasına 0,5 mm'lik bir kesi yapın ve kafatasının yüzeyini ortaya çıkarmak için üstteki dokuyu çıkarın.
   4. Sıçanın kafasını anterior / posterior eksende düzleştirin ve bregma'ya sıfır stereotaksik koordinat verin.
   5. Küçük bir matkap ucuyla donatılmış bir Dremel aleti kullanarak kafatasından üç küçük delik açın. Paslanmaz çelik vidaları (M2x4 965-A2) yerine sıkıca monte etmek için tornavida kullanın.
      NOT: Vidalar, diş çimentosunun uygun şekilde bağlanması ve sağlam, uzun ömürlü kafa kapaklarının oluşturulması için gereklidir. Vidaların pozisyonu, kafatasının ön-arka ekseni boyunca ve AAV enjeksiyon bölgesinden uzağa yayılmalıdır.
   6. Medial genikülat çekirdeğin (MGN) medial kısmı için Sıçan Beyin Atlası'ndan (Watson ve Paxinos)¹² koordinatlarına dayanarak AAV enjeksiyonu için iki taraflı delikler açın; bregma'dan mm cinsinden, AP: -5.4; ML: ±3.0; DV: -6.6. MGN'ye yerleştirilene kadar enjeksiyon kanüllerini (4 mm / dak) yavaşça indirin. Konsantre AAV çözeltisini 0,1 μL/dak oranında enjekte edin.
   7. İnfüzyonlar tamamlandıktan sonra enjeksiyon kanülünü kanülden uzağa difüzyona izin vermek için 5 dakika boyunca yerinde bırakın ve ardından kanülü beyinden yavaşça çekin.
4. Virüs enjeksiyonlarının hemen ardından, MGN-LA terminallerini hedefleyen optik fiberler ^4,9'u implante etmeye devam edin.
   1. Lateral amigdala'yı hedefleyen optik fiber implantlar için iki taraflı delikler açmak için bir Dremel aleti kullanın (bregma'dan mm cinsinden, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. Optik fiber implantın yüksüğünü tutmak için forseps kullanın ve stereotaksik adaptörlere sabitleyin, böylece güvenli bir şekilde yerinde tutulurlar.
   3. Liflerin ucu LA'nın dorsal kısmına oturana kadar lifleri 2 mm / dak hızında yavaşça indirin (DV: -7.9 mm).
   4. Yüksükleri önce ince bir Loctite anlık yapıştırıcı tabakası kullanarak kafatasına sabitleyin, ardından diş çimentosu ve 1.25 mm çapında yüksük manşonları ve toz kapakları ile örtü yüksüklerini örtün.
      NOT: Yüksükleri kafatasına sabitlemek için yapıştırıcı seçimi, yerel veya kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanmalıdır. Loctite, bu çalışmada, birden fazla yapıştırıcı ile deneme yanılma sonrası yüksükleri kafatasına güvenilir bir şekilde sabitlemek için kullanılır; ancak, mevcut alternatifler düşünülebilir.
5. Cerrahi prosedürleri takiben, fareleri ayrı ayrı barındırır ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlar. Kurumsal yönergelere uygun postoperatif bakım sağlayın. Açıklığı korumak için kateterleri günlük olarak gentamisin (5 mg / mL) ve heparin (30 USP / mL) içeren salin ile yıkayın. Ameliyattan en az 5 gün sonra ve davranışsal deneylerin başlamasından 24 saat önce, yiyecekler sıçanları serbest beslenme ağırlıklarının ~% 90'ı ile sınırlar.

3. Kemirgen Kokain Öz Yönetimi ve Enstrümantal Kol Neslinin Tükenmesi

NOT: Tüm davranışsal prosedürler, bir duvarda iki geri çekilebilir kol, her kolun üzerinde bir uyaran ışığı, bir ton jeneratörü, bir ev ışığı ve bir infüzyon pompası ile donatılmış standart çalışma koşullandırma odalarında gerçekleştirilir.

1. Sıçanları, FR1 takviye programı kapsamında günlük 1 saatlik kokain (2 mg / mL) kendi kendini yönetme eğitim oturumlarına maruz bırakın.
   1. Sıçanları her gün operant odasına yerleştirin ve sıçanların kol basmasına izin verin. Belirlenen 'aktif kol' üzerindeki bir baskı (sol ve sağ kollar arasında dengelenmiş), bir kokain infüzyonu (1.0 mg / kg / infüzyon) ve bir bileşik ışık ve ton ipucunun 10 s sunumu ile sonuçlanır. Belirlenen 'etkin olmayan kol' üzerindeki bir presin programlanmış bir etkisi yoktur.
   2. En az 10 d boyunca kendi kendine yönetim deneylerine devam edin ve sıçanlar art arda 3 gün boyunca en az 8 infüzyon / gün başarılı bir şekilde kazanana kadar. 20. güne kadar edinme kriterlerine ulaşılamaması çalışmadan dışlanma ile sonuçlanır.
2. Edinme kriterleri başarıyla karşılandıktan sonra, sıçanları 6-10 d için 1 saatlik enstrümantal yok olma seanslarına tabi tutar.
   1. Sıçanları operant odalara yerleştirin ve sıçanların serbestçe basmalarına izin verin. Bununla birlikte, hem aktif hem de aktif olmayan kaldıraçlardaki tepkilerin programlanmış sonuçları yoktur.
   2. Sıçanlar, art arda iki gün boyunca ortalama < 25 kol presi gerçekleşene kadar günlük olarak enstrümantal yok olmaya devam etmelerini sağlayın.

4. LTD'nin İnvivo Optogenetik İndüksiyonu

NOT: Optogenetik inhibisyon deneyleri, enstrümantal yok oluşun son gününden 24 saat sonra gerçekleşir.

1. Yama kablolarını, kapağı çıkarılmış temiz, standart bir kemirgen muhafaza kafesinin üzerine asılı bir döner mafsal aracılığıyla 473 nm mavi lazer diyota bağlayın. Bu kurulum, kemirgenlerin optogenetik stimülasyon sırasında kafesin etrafında serbestçe hareket etmelerini sağlar.
2. Lazer diyotu kullanım talimatlarına göre açın ve bir darbe jeneratörüne bağlayın. Ayarları, sıçan açıldığında 1 Hz'de 900 2 ms ışık darbesi alacak şekilde ayarlayın.
   DİKKAT: Lazeri kullanırken her zaman uygun göz koruması kullanılmalıdır.
3. Bir ışık sensörü kullanarak yama kablosundan ışık yoğunluğunu ölçün. Lazerin yoğunluğunu, yama kablosundan ışık çıkışı ~ 5-7 mW olacak şekilde ayarlayın.
4. Sıçanları temiz bir muhafaza kafesine yerleştirin. Toz kapaklarını ve yüksük manşonlarını çıkarın ve yüksükleri açığa çıkarın. Yama kablolarını optik fiber implantlara iki taraflı olarak bağlayın. Sıçanların LTD indüksiyonundan önce 3 dakika boyunca çevreyi keşfetmelerine izin verin.
5. Optogenetik stimülasyonu başlatmak için nabız jeneratörünü açın.
   NOT: Her ne kadar olası olmasa da, sıçan stimülasyona karşı herhangi bir olumsuz reaksiyon yaşarsa, deney derhal sonlandırılır ve sıçanlar kurumsal yönergelere dayanarak uygun şekilde ötenazi yapılır.
6. LTD indüksiyonunu takiben, fareleri kafeste 3 dakika tutun ve ardından ev kafeslerine geri yerleştirin.
7. Kontrol deneyleri için, AAV5-tdDomates kontrol virüsünü eksprese eden sıçanlarda aynı stimülasyon prosedürünü kullanın. Sahte deneyler için, AAV5-oChIEF virüsünü ifade eden sıçanların optik fiberine bir yama kablosu takın, ancak 15 dakikalık bir seans sırasında hiçbir stimülasyon yapılmaz.

5. Optogenetik Stimülasyonun İşaret Kaynaklı Kokain Arayışı Üzerindeki Etkisini Test Edin

1. İn vivo optogenetik stimülasyonlardan 24 saat sonra, fareleri operant koşullandırma odalarına geri yerleştirin. Sıçanlar, kokain arama davranışını değerlendirmek için 1 saatlik standart ipucu kaynaklı eski haline getirme oturumuna tabi tutulur.
   NOT: İşaret kaynaklı eski haline getirme sırasında, aktif koldaki bir yanıt, kokainle ilişkili ipucunun 10 saniyelik bir sunumunu verir, ancak kokain infüzyonu yoktur.
2. Optogenetik LTD indüksiyonunun kokain arayışının uzun süreli baskılanmasıyla sonuçlanıp sonuçlanmadığını belirlemek için ilk testten en az 1 hafta sonra ikinci bir eski haline getirme testi yapın

6. Viral ekspresyonun histolojik doğrulaması ve optik fiber yerleşimi için boyama, floresan ve görüntüleme

1. 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve% 4 paraformaldehit (PFA) yapın. Her iki çözümü de buz üzerinde saklayın. Toplam hacim, çalışmadaki sıçan sayısına bağlı olacaktır (sıçan başına ~ 100 mL PBS ve 200 mL PFA kullanılacaktır).
   DİKKAT: PFA toksik bir kimyasaldır ve kanserojen olarak bilinir. Solunmasını ve ciltle temasını önlemek için uygun özen gösterin. Kullanımı ve bertarafı, uygun KKD ve kimyasal akış başlığı kullanımı da dahil olmak üzere kurumsal yönergelere uygun olmalıdır.
2. Peristaltik pompayı 20 mL/dak debide kurun. Pompanın borusunu 1x PBS ile doldurun. Borunun ucuna körelmiş 20 gauge iğne takın.
3. Sıçanları sodyum pentobarbital (100 mg / kg, i.p.) ile derinlemesine uyuşturun. Daha fazla ilerlemeden önce ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek anestezi derinliğini onaylayın.
   NOT: Perfüzyon bir terminal prosedürü olduğu için sodyum pentobarbital kullanılır.
4. Sıçanın karın boşluğunu diyaframın altında kesmek için cerrahi makas kullanın. Sıçanın kalbini açığa çıkarmak için göğüs kafesini yanal kenarlar boyunca rostral olarak kesin. Göğüs kafesinin rostral kısmını kalpten uzağa sıkıştırmak için hemostat kullanın. Kalbi çevreleyen üstteki yağ dokusunu kesin.
5. Körelmiş iğneyi sol ventrikülden ve yukarı doğru aortun içine yerleştirin. Kalbe geri dönerken çözeltiyi boşaltmak için sağ atriyumda küçük bir delik açın.
6. Her sıçanı 5 dakika boyunca 1x PBS ile perfüze edin, ardından 10 dakika boyunca% 4 PFA, pH 7.4 ile.
7. Sıçanın kafasını kes, beyni çıkar ve 24 saat boyunca% 4 PFA'ya sabitle. Daha sonra beyni 2-3 d için% 30 sakkaroz çözeltisine aktarın.
8. Bir kriyostat kullanarak 50 μm'de kesit beyinleri.
9. LA veya MGN içeren tüm dilimleri cam slaytlara ve kapak kaymasına monte edin.
10. MGN'deki AAV-oChIEF-tdDomates ekspresyonunu ve LA'ya projeksiyonlarını doğrulamak için bir epifloresan mikroskop kullanarak görüntü dilimleri ve ayrıca optik fiberin LA'nın üzerine yerleştirilmesi.

7. Elektrofizyoloji Deneyleri için Perfüzyon ve Akut Beyin Dilimi Hazırlığı

NOT: Elektrofizyolojik deneyler, in vivo LTD'nin başarısını doğrulamak için hayvanların bir alt kümesi üzerinde gerçekleştirilir.

1. Tablo 1-3 ^4,13'te listelenen reaktifleri kullanarak elektrofizyoloji çözeltileri hazırlayın. HCl ile tüm çözeltilerin pH'ını 7,4'e ayarlayın ve ozmolariteyi 300-310 mOsm/kg_H2O'ya ayarlayın. Kullanım sırasında tüm çözeltileri her zaman karbojenle (%95 O 2/%5 CO₂) doyurun.
2. Yerel veya kurumsal hayvan bakımı ve kullanım kılavuzlarına göre izofluran kullanarak, sıçanı kapalı bir ötenazi odasında derinlemesine anestezi altına alın.  Hayvanın ayak parmağını sıkıştırma refleksi ile tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın.
3. Küçük bir beheri 50 mL buz gibi soğuk kesme çözeltisi ile doldurun. Peristaltik pompanın borusunu çözelti ile doldurun ve akış hızını 20 mL / dak'ya ayarlayın. Borunun ucuna körelmiş 20 gauge iğne takın.
4. Karın boşluğunu açın (Bkz. adım 6.4 ve 6.5) ve sıçanı kesme çözeltisi ile kısaca perfüze edin (maksimum 1-2 dakika).
5. Perfüzyonu takiben, hemen sıçanın kafasını keser. Beyni çıkarın ve 30 s-1 dakika boyunca 4 °C kesme çözeltisi ile doldurulmuş küçük bir beherin içine yerleştirin.
6. Beyinleri bir spatula ile aktarın ve hızlı bir şekilde bir vibratomun odasına sabitleyin. İnce forseps kullanarak piayı çıkarın. Odayı 4 °C kesme çözeltisi ile doldurun ve 0,37 mm / sn hızında ve 70 Hz frekansında amigdala'nın akut koronal dilimlerini (250 μm kalınlığında) hazırlayın.
7. Dilimler elde edilirken, her birini kesme çözeltisi ile doldurulmuş bir tutma odasına yerleştirin ve 10-12 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hayvan başına LA içeren yaklaşık 5-7 dilim elde edilebilir.
8. Dilimleri oda sıcaklığı (RT) tutma çözeltisinin bir kabına aktarın ve denemeden önce >30 dakika boyunca iyileşmeye izin verin.
   NOT: Dilimler genellikle 4-6 saat boyunca tutma solüsyonunda tutulurken sağlıklı kalır. AAV'nin floresan doğası nedeniyle, dilimler düşük ışık koşullarında tutulur.

8. Ex vivo Elektrofizyolojik Kayıtlar

1. Tablo 4-5'te listelenen reaktifleri kullanarak hücre içi çözeltiler hazırlayın.
   NOT: Hücre içi çözeltiler deneylerden önce yapılmalı ve -80 °C'de uzun süreli (3-12 ay) veya -20 °C'de kısa süreli (1-2 ay) saklanabilir. Çözeltiler pH 7.3'e ayarlanır (Cs bazlı hücre içi çözelti için CsOH ve K bazlı hücre içi çözelti için KOH ile). Son ozmolaritesi 290-300 mOsm/kg H₂O olarak ayarlayın.
2. Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözünmüş 500 mM pikrotoksin stok çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Picrotoxin stokları aliquoted edilir ve -20 °C'de saklanır. Kullanım günü, alikotlar çözülür ve 100 μM'lik son konsantrasyona kayıt çözeltisine eklenir.
   DİKKAT: Pikrotoksin, GABA A reseptörlerinin rekabetçi olmayan bir antagonistidir, bu nedenle pikrotoksin infüzyonu uyarıcı_bir etkiye sahiptir. Oral alım veya cilt emilimi ile ciddi şekilde toksiktir. Pikrotoksin ile çalışırken her zaman uygun KKD kullanılmalıdır.
3. Dilimleri elektrofizyoloji deneyleri için tasarlanmış dik bir mikroskopa aktarın.
4. Deneyler sırasında, 31-33 ° C'ye ısıtılan kayıt çözeltisi ile sürekli banyo perfüze dilimleri.
5. 4x hedefi kullanarak LA'yı büyütün. Ana nöronları 40x su daldırma lensi ile morfoloji ile tanımlayın.
6. Tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını elde etmek için Cs tabanlı hücre içi çözelti (voltaj kelepçesi deneyleri için) veya K tabanlı hücre içi çözelti (mevcut kelepçe deneyleri için) ile doldurulmuş bir cam pipet (3-5 MΩ) kullanın.
7. Floresan altında AAV ile enfekte MGN aksonal projeksiyonlarını tanımlayın (bir RFP filtresi kullanarak). Bir darbe jeneratörüne bağlı mavi ışık (473 nm) DPSS lazer kullanarak projeksiyonları uyarın.
   DİKKAT: Lazere maruz kalmayı sınırlamak için, kolimasyonlu lazer ışığı mikroskop üzerindeki bir floresan portuna bağlanır ve objektif yoluyla dilime odaklanır.
   NOT: Voltaj kelepçesi modunda, uyarıcı postsinaptik akımlar (EPSC'ler) optik olarak 0.1 Hz'de uyarılır.
8. Ex vivo LTD'yi indüklemek için, mevcut kelepçe modunda, en az 10 dakika boyunca uyarıcı postsinaptik potansiyellerin (EPSP'ler) sabit bir taban çizgisini kaydedin. Ardından, 1 Hz frekansında 900 adet 2 ms'lik 473 nm ışık darbesi gönderin (toplam süre = 15 dakika). Ardından EPSP'leri ≥60 dakika boyunca 0,1 Hz'de sürekli olarak kaydedin.

Sonuçlar

Deneylerin sırasını özetleyen bir zaman çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir. Davranışsal deneyler boyunca, kokain infüzyonlarının sayısı ve aktif kolda verilen tepkilerin sayısı, kokain arama davranışının yoğunluğunun bir ölçüsü olarak hizmet eder. Kokainin kendi kendini yönetmesinin ilk günlerinde, ikinci hafta boyunca istikrara kavuşmadan önce, aktif yanıtların sayısı her edinim günü boyunca kademeli olarak artmalıdır. Tersine, inaktif kol yanıtları deneyin tamamı boyunca düşük kalmalıdır ...

Tartışma

Yukarıda açıklandığı gibi, uygun deneysel sonuçlara ulaşmak için önemli olan birkaç kritik adım vardır. Protokol muhtemelen yalnızca kokainin kendi kendini yönetmesini uygun şekilde elde eden hayvanlarda etkili olacaktır ve bugüne kadar yalnızca yukarıda belirtilen parametreler kullanılarak test edilmiştir. Kokain dozu, takviye programı ve işaret parametrelerinin, davranışsal sonuçlar üzerinde muhtemelen çok az etkisi olacak şekilde değiştirilmesi mümkündür, ancak ikinci dereceden bir takviye programı, prosedürün etkinli...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%0.9 Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Uyarıcı İzolatör	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vektör Çekirdeği (Roger Tsien aracılığıyla)	#268	Bkz. Lin ve diğerleri, 2009; Nabavi ve ark., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Kontrol)	Duke Viral Vektör Çekirdek Kontrolü		Bkz. Lin ve ark., 2009; Nabavi ve ark., 2014
Yapay Gözyaşları (Oftalmik Merhem)	Covetrus	70349
ATP Magnezyum Tuzu	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Kalsiyum klorür	Fisher Scientific	C1016
Sezyum klorür	Fisher Scientific	289329
Sezyum hidroksit	Fisher Scientific	516988
Sezyum metansülfonat	Fisher Scientific	C1426
Kokain HCl	NIDA İlaç Tedarik Merkezi	9041-001
Kriyostat	Leica	CM1950
D-Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Çift Kanallı Sıcaklık Kontrol Cihazı	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Etanol	Pittsburgh Üniversitesi Kimya Deposu	200C5000
Yüksük Toz	Kapakları Thor Labs	CAPL	1.25 mm Yüksükler için beyaz plastik toz kapakları
Yüksük Çiftleşme Kılıfları	Dorik Lensler	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronz, 1.25 mm İç
Çap Yüksükler	Hassas Fiber Ürünler	MM-FER2007C-2300	& 1,25 mm Çok Modlu LC/PC Seramik yüksük, & 230 μ m delik boyutu
Fiber Optik	Thor Labs	FP200URT	200 &; m çekirdek çok modlu fiber (0.5 NA)
Fiber Optik Döner Eklem	Prizmatix	(Amazon'dan sipariş edildi)	18 mm çap, fiber Fiber
Sıyırma Aleti	Thor Labs	T12S21
DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodyum Tuzu	Fisher Scientific	ile FluoroshieldG8877
Hamilton şırınga	Hamilton	80085	10 μ L hacim, 26 gauge, 2 inç, nokta stili 3
Isı Tabancası	Müttefik Elektronik	972-6966	250 V, 750-800 & derece; F
Isıl Kürlenebilir Epoksi Hassas	Elyaf Ürünler	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hidroklorik Asit	Fisher Scientific	219405490
İzofluran	Henry Schein	29405
Ketamin HCl	Henry Schein	55853	Ketamin kontrollü bir maddedir ve kurumsal yönergelere göre ele alınmalıdır
s	Henry Schein	9846
Lazer, sürücü ve lazerden fibere bağlayıcı	OEM Lazer Sistemleri	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473 nm, diyot pompalı katı hal lazeri (Bir seçenek)
L-glutatyon	Fisher Scientific	G4251
Lidokain	Butler Schein	14583
Işık Sensörü	Thor Labs	PM100D	Dijital ekranlı kompakt enerji ölçer konsolu
Loctite anında yapıştırıcı	Grainger	5E207
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	203726
Mikroelektrot Amplifikatörü/Veri Toplama	Moleküler Cihazlar	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Mikroenjektör pompası	Harvard Aparatı	70-4501	Çift şırınga
Mikromanipülatör	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Mikroskop	Olympus	BX51WI	Elektrofizyoloji için dik mikroskop
Mikroskop	Olympus	BX61VS	Epifloresan slayt tarama mikroskobu
N-metil-D-glukamin	Sigma-Aldrich	M2004
Ortojet diş çimentosu, sıvı	Lang Dental	1504BLK	siyah
Orthojet diş çimentosu, toz	Lang Dental	1530BLK	Çağdaş toz, siyah
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148
Yama Kabloları	Thor Labs	FP200ERT	Çok Modlu, FT030 Boru
Pikrotoksin	Fisher Bilimsel	AC131210010
Parlatma Diski	Thor Labs	D50FC
Parlatma Pedi	Thor Labs	NRS913	9 "x 13"
Parlatma Kağıdı	Thor Labs	LFG5P	5 & mu; m grit
Parlatma Kağıdı	Thor Labs	LFG3P	3 & mu; m kumlu
Parlatma Kağıdı	Thor Labs	LFG1P	1 & mu; m kumlu
Parlatma Kağıdı	Thor Labs	LFG03P	0.3 & mu; m kum
Potasyum klorür	Sigma-Aldrich	P9333
Potasyum hidroksit	Fisher Scientific	P5958
Potasyum metansülfonat	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Kendi Kendine Yönetim Odalar / Yazılım	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S5761
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	S7653
Sodyum Hidroksit	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodyum L-Askorbat	Sigma-Aldrich	A7631
Sodyum Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodyum fosfat	Sigma-Aldrich	S9638
Sodyum fosfokreatin	Fisher Scientific	P7936
Sodyum piruvat	Sigma-Aldrich	P2256
Paslanmaz çelik makine vidaları	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Makine Vidası, Pan, Phillips, A2 Paslanmaz Çelik, Düz, 3 mm Uzunluk
Yüksükler için stereotaksik adaptör	Thor Labs	XCL
Stereotaksik Çerçeve	Çalmak	51603
Sükroz	Sigma-Aldrich	S8501
Sütür İpliği	Güzel Bilim Araçları	18020-50	İpek iplik; Boyut: 5/0, Çap: 0,12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Doku Yapıştırıcı	Covetrus	001505
Vibratom	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198