Burada açıklanan yöntemler, sıçanlarda davranışsal olarak ilgili bir devrede kokain kaynaklı plastisiteyi optogenetik olarak tersine çevirmek için kullanılan bir prosedürü özetlemektedir. Talamo-amigdala sinapslarının sürekli düşük frekanslı optik stimülasyonu uzun süreli depresyona (LTD) neden olur. Kokain deneyimli sıçanlarda in vivo optogenetik olarak indüklenen LTD, ipucu güdümlü uyuşturucu arayışının daha sonra zayıflamasına neden oldu.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçanlarda Nöroplastisiteyi Tersine Çevirmek ve Kokain Arayışını Engellemek için Optogenetiği Kullanmak
Bu makalede
Özet
Özet
Bu protokol, sıçanda sonraki kokain arama davranışlarını azaltmak için talamo-amigdala devrelerinde kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için optogenetik araçları kullanmak için gereken adımları göstermektedir. Araştırmamızda, sıçanlar görsel-işitsel bir ipucu ile eşleştirilmiş intravenöz kokaini kendi kendine uyguladıklarında, talamusun (MGN) medial genikülat çekirdeğinden lateral amigdala'nın (LA) ana nöronlarına yapılan girdilerde oluşan sinapsların, ipucu-kokain ilişkisi öğrenildikçe güçlendiğini bulmuştuk. Bu sinapslarda kokain kaynaklı plastisitenin tersine çevrilmesinin, ipucu motivasyonlu kokain arama davranışını azaltacağını varsaydık. Bu tip nöromodülasyonu in vivo olarak gerçekleştirmek için, MGN-LA sinapslarının gücünü azaltan sinaptik uzun süreli depresyonu (LTD) indüklemek istedik. Bu amaçla, ışık kullanarak beyin devrelerinin nöromodülasyonuna izin veren optogenetiği kullandık. Uyarıcı opsin oChiEF, LA'daki presinaptik MGN terminallerinde, MGN'ye oChiEF içeren bir AAV infüze edilerek eksprese edildi. Optik fiberler daha sonra LA'ya implante edildi ve 473 nm lazer ışığı, LTD'yi indüklemek ve kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için 15 dakika boyunca 1 Hz frekansında darbelendi. Bu manipülasyon, kokain ile ilişkili ipuçlarının uyuşturucu arama eylemlerini tetikleme yeteneğinde uzun süreli bir azalma sağlar.
Giriş
Madde bağımlılığı, ABD'de ve dünya çapında çok ciddi bir halk sağlığı sorunudur. Onlarca yıllık yoğun araştırmalara rağmen, çok az sayıda etkili terapötik seçenek vardır 1,2. Tedavideki önemli bir gerileme, kronik uyuşturucu kullanımının çevresel ipuçları ile ilacın kendisi arasında uzun süreli ilişkisel anılar oluşturmasıdır. İlaçla ilgili ipuçlarına yeniden maruz kalmak, devam eden uyuşturucu kullanımını ve nüksetmeyi motive eden fizyolojik ve davranışsal tepkileri yönlendirir3. Yeni bir terapötik strateji, ilaç-ipucu ilişkilerinin düzenlenmesinde yer alan devreleri manipüle etmeyi am....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde açıklanan deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından ortaya konan kılavuzlarla tutarlıydı ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler, varışta 275-325 g ağırlığındaki yetişkin, naif Sprague-Dawley sıçanları kullanılarak gerçekleştirildi.
1. Optik Fiber İmplantların ve Patch Kabloların Yapımı
- Daha önce yayınlanmış protokolleri izleyerek optik fiber implantlar hazırlayın9. Bu protokolde açıklanan deneylerde 200 μm çekirdek fiber (0.5 NA) ve Ø1.25 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deneylerin sırasını özetleyen bir zaman çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir. Davranışsal deneyler boyunca, kokain infüzyonlarının sayısı ve aktif kolda verilen tepkilerin sayısı, kokain arama davranışının yoğunluğunun bir ölçüsü olarak hizmet eder. Kokainin kendi kendini yönetmesinin ilk günlerinde, ikinci hafta boyunca istikrara kavuşmadan önce, aktif yanıtların sayısı her edinim günü boyunca kademeli olarak artmalıdır. Tersine, inaktif kol yanıtları deneyin tamamı boyunca düşük kalmalıdır .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıda açıklandığı gibi, uygun deneysel sonuçlara ulaşmak için önemli olan birkaç kritik adım vardır. Protokol muhtemelen yalnızca kokainin kendi kendini yönetmesini uygun şekilde elde eden hayvanlarda etkili olacaktır ve bugüne kadar yalnızca yukarıda belirtilen parametreler kullanılarak test edilmiştir. Kokain dozu, takviye programı ve işaret parametrelerinin, davranışsal sonuçlar üzerinde muhtemelen çok az etkisi olacak şekilde değiştirilmesi mümkündür, ancak ikinci dereceden bir takviye programı, prosedürün etkinli.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak bir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar, USPHS'nin K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) ve Pennsylvania Sağlık Bakanlığı'nın desteğini kabul etmek istiyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %0.9 Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Uyarıcı İzolatör | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vektör Çekirdeği (Roger Tsien aracılığıyla) | #268 | Bkz. Lin ve diğerleri, 2009; Nabavi ve ark., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Kontrol) | Duke Viral Vektör Çekirdek Kontrolü | Bkz. Lin ve ark., 2009; Nabavi ve ark., 2014 | |
| Yapay Gözyaşları (Oftalmik Merhem) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnezyum Tuzu | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Kalsiyum klorür | Fisher Scientific | C1016 | |
| Sezyum klorür | Fisher Scientific | 289329 | |
| Sezyum hidroksit | Fisher Scientific | 516988 | |
| Sezyum metansülfonat | Fisher Scientific | C1426 | |
| Kokain HCl | NIDA İlaç Tedarik Merkezi | 9041-001 | |
| Kriyostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glikoz | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Çift Kanallı Sıcaklık Kontrol Cihazı | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Etanol | Pittsburgh Üniversitesi Kimya Deposu | 200C5000 | |
| Yüksük Toz | Kapakları Thor Labs | CAPL | 1.25 mm Yüksükler için beyaz plastik toz kapakları |
| Yüksük Çiftleşme Kılıfları | Dorik Lensler | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronz, 1.25 mm İç |
| Çap Yüksükler | Hassas Fiber Ürünler | MM-FER2007C-2300 | & 1,25 mm Çok Modlu LC/PC Seramik yüksük, & 230 μ m delik boyutu |
| Fiber Optik | Thor Labs | FP200URT | 200 &; m çekirdek çok modlu fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optik Döner Eklem | Prizmatix | (Amazon'dan sipariş edildi) | 18 mm çap, fiber Fiber |
| Sıyırma Aleti | Thor Labs | T12S21 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodyum Tuzu | Fisher Scientific | ile FluoroshieldG8877 | |
| Hamilton şırınga | Hamilton | 80085 | 10 μ L hacim, 26 gauge, 2 inç, nokta stili 3 |
| Isı Tabancası | Müttefik Elektronik | 972-6966 | 250 V, 750-800 & derece; F |
| Isıl Kürlenebilir Epoksi Hassas | Elyaf Ürünler | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hidroklorik Asit | Fisher Scientific | 219405490 | |
| İzofluran | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamin HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamin kontrollü bir maddedir ve kurumsal yönergelere göre ele alınmalıdır |
| s | Henry Schein | 9846 | |
| Lazer, sürücü ve lazerden fibere bağlayıcı | OEM Lazer Sistemleri | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473 nm, diyot pompalı katı hal lazeri (Bir seçenek) |
| L-glutatyon | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidokain | Butler Schein | 14583 | |
| Işık Sensörü | Thor Labs | PM100D | Dijital ekranlı kompakt enerji ölçer konsolu |
| Loctite anında yapıştırıcı | Grainger | 5E207 | |
| Magnezyum sülfat | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Mikroelektrot Amplifikatörü/Veri Toplama | Moleküler Cihazlar | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Mikroenjektör pompası | Harvard Aparatı | 70-4501 | Çift şırınga |
| Mikromanipülatör | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Mikroskop | Olympus | BX51WI | Elektrofizyoloji için dik mikroskop |
| Mikroskop | Olympus | BX61VS | Epifloresan slayt tarama mikroskobu |
| N-metil-D-glukamin | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Ortojet diş çimentosu, sıvı | Lang Dental | 1504BLK | siyah |
| Orthojet diş çimentosu, toz | Lang Dental | 1530BLK | Çağdaş toz, siyah |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Yama Kabloları | Thor Labs | FP200ERT | Çok Modlu, FT030 Boru |
| Pikrotoksin | Fisher Bilimsel | AC131210010 | |
| Parlatma Diski | Thor Labs | D50FC | |
| Parlatma Pedi | Thor Labs | NRS913 | 9 "x 13" |
| Parlatma Kağıdı | Thor Labs | LFG5P | 5 & mu; m grit |
| Parlatma Kağıdı | Thor Labs | LFG3P | 3 & mu; m kumlu |
| Parlatma Kağıdı | Thor Labs | LFG1P | 1 & mu; m kumlu |
| Parlatma Kağıdı | Thor Labs | LFG03P | 0.3 & mu; m kum |
| Potasyum klorür | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potasyum hidroksit | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potasyum metansülfonat | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Kendi Kendine Yönetim Odalar / Yazılım | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodyum Hidroksit | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodyum L-Askorbat | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodyum Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodyum fosfat | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodyum fosfokreatin | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodyum piruvat | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Paslanmaz çelik makine vidaları | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Makine Vidası, Pan, Phillips, A2 Paslanmaz Çelik, Düz, 3 mm Uzunluk |
| Yüksükler için stereotaksik adaptör | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaksik Çerçeve | Çalmak | 51603 | |
| Sükroz | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Sütür İpliği | Güzel Bilim Araçları | 18020-50 | İpek iplik; Boyut: 5/0, Çap: 0,12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Doku Yapıştırıcı | Covetrus | 001505 | |
| Vibratom | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
Kaynaklar
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
