Method Article

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

DOI:

10.3791/63186

⸱

March 8th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastaz, hücrelerin in vitro tahlillerle sadece eksik modellenen engellerin üstesinden gelmelerini gerektiren karmaşık bir süreçtir. Melanom metastazındaki yeni oyuncuları tanımlamak için sağlam, tekrarlanabilir in vivo modeller ve standartlaştırılmış yöntemler kullanılarak sistematik bir iş akışı oluşturulmuştur. Bu yaklaşım, bir genin metastazdaki rolünü tam olarak karakterize etmek için belirli deneysel aşamalarda veri çıkarımına izin verir. Modeller, genetiği değiştirilmiş melanom hücrelerinin intrakardiyak, intradermal veya subkutan enjeksiyonlar yoluyla farelere sokulması ve ardından seri in vivo görüntüleme ile izlenmesiyle oluşturulur. Önceden belirlenmiş son noktalara ulaşıldıktan sonra, primer tümörler ve / veya metastaz taşıyan organlar toplanır ve çeşitli analizler için işlenir. Tümör hücreleri, tek hücreli RNA dizilimi de dahil olmak üzere çeşitli 'omik' platformlardan herhangi birine sıralanabilir ve tabi tutulabilir. Organlar, metastazların genel yükünü ölçmek ve spesifik anatomik konumlarını haritalamak için görüntüleme ve immünohistopatolojik analizlere tabi tutulur. Engraftma, izleme, doku hasadı, işleme ve analiz için standartlaştırılmış protokoller de dahil olmak üzere bu optimize edilmiş boru hattı, hasta tarafından türetilmiş, kısa vadeli kültürler ve çeşitli katı kanser türlerinin insan ve murin hücre hatları için benimsenebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastatik melanom ile ilişkili yüksek mortalite, dünya çapında melanom insidansının artmasıyla birleştiğinde1 (2025 yılına kadar tahminen% 7.86'lık bir artış) yeni tedavi yaklaşımları gerektirmektedir. Hedef keşfindeki ilerlemeler, oldukça karmaşık bir süreç olan tekrarlanabilir metastaz modellerine dayanmaktadır. Metastatik kaskadın adımları boyunca, melanom hücreleri bağışıklık sisteminden kaçmak ve uzak dokuların kolonizasyonunu sağlamak için sayısız engelin üstesinden gelmelidir2. Melanom hücrelerinin esnekliği ve uyarlanabilirliği, yüksek genetik mutasyon yükü 3 ve nöral tepe kökeni de dahil olmak üzere çok sayıda ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Aşağıdaki protokolde yer alan hayvan prosedürleri, New York Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm prosedürler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından onaylanan tesislerde yürütülmektedir. Şekil 1, genel deneysel yaklaşımı göstermektedir.

1. Hasta kaynaklı melanom kısa süreli kültürler (STC'ler)

  1. Dokuyu 1 mL tam RPMI (% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 1x MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi ve penisilin (100 IU / mL) / stre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki rakamlar, melanom metastazının yeni sürücülerinin tanımlanması için açıklanan iş akışının nasıl uygulandığını göstermektedir. Şekil 2 , fukoziltransferaz FUT8'in in vivo melanom metastazının susturulmasının etkilerinin incelendiği yayınlanmış bir çalışmanın sonuçlarını özetlemektedir26. Kısaca, insan hasta glikomik verilerinin analizi (lektin dizileri ile elde edilen) ve transkriptomik profilleme, karşılık gelen fukoziltransferazdaki (FUT8) artışla .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu teknik raporun amacı, melanom metastazındaki potansiyel aktörlerin araştırılması için standartlaştırılmış, yukarıdan aşağıya bir iş akışı sunmaktır. İn vivo deneyler maliyetli ve zaman alıcı olabileceğinden, verimliliği en üst düzeye çıkarma ve elde edilen bilgilerin değerini artırma stratejileri çok önemlidir.

Aynı deneydeki bulguları çapraz doğrulamak için tamamlayıcı yaklaşımların kullanılması zorunludur. Örneğin, hem NuMA immünohistokimyasal boyama hem de BLI, metastatik yükü ö.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NYU Langone Health'teki İleri Araştırma Teknolojileri Bölümü'ne (DART) ve özellikle Perlmutter Kanser Merkezi Destek Hibe / NCI 5P30CA016087 tarafından kısmen desteklenen Deneysel Patoloji Araştırma Laboratuvarı, Genom Teknoloji Merkezi, Sitometri ve Hücre Sıralama Laboratuvarı, Klinik Öncesi Görüntüleme Çekirdeği'ne teşekkür ederiz. NYU Disiplinlerarası Melanom İşbirliği Grubu'na (PI: Dr. Iman Osman), IRB onaylı protokoller (Universal Consent study #s16-00122 ve Interdisciplinary Melanom Cooperative Group study #10362) aracılığıyla elde edilen hasta kaynaklı melanom kısa süreli kültürlerine+ (10-230BM ve 12-273BM) erişim sağladığı için teşekkür ederiz. 113....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#15 Günah Bıçağı Cerrahi prosedürler içinWPI500242
# 3 Scapel KoluWPI500236Cerrahi prosedürler için
1 mL Tüberkülin şırıngası, kayma ucu BD309626Enjeksiyonları
10 mL şırınga, kayma ucu BD301029Perfüzyon
%10 Formalin Sodyum TamponluEK Industries4499-20LPerfüzyon/doku fiksatifi
için 15 mL KonikCorning 430052Hücre kültürü
15 mL Konik Polipropilen Santrifüj TüpleriFalcon352196Hücre kültürü
200 Kanıt EtanolDeacon Labs04-355-223Histoloji
22G – 22mm iğneBD305156Perfüzyon
4-0 VicrylSütür EthiconJ464GSütür
%4 Carson fosfat tamponlu Paraformaldehit EMS15733-10Perfüzyon / doku fiksatif
40 ve mikro için; mCorning431750Doku işleme
5-0 Emilebilir Sütür Ethicon6542000Kapatma
50 mL Konik Corning 430828Hücre kültürü
50mL Konik Polipropilen Santrifüj TüpleriFalcon352070Hücre kültürü
7-0 İpek sütür FST18020-70Ligatür
70 ve mikro; mCorning431751Doku işleme
Solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı   Vector LabsH-1000-10İmmünofloresan
Yaklaşımı, 10cm WPI14189Mikrocerrahi prosedürler için
AvanceBruker3 HDNMR Konsolu 
Biospec 7030 Bruker7030Mikro MRI
BSABioregA941NuMA Boyama
Castroviejo dikiş forsepsleri, düz uçlar 5.5mm bağlama platformu, 11cm WPIWP5025501Mikrocerrahi prosedürler için
Coplin Boyama KavanozuBel-Art F44208-1000Histoloji
DAPISigma-AldrichD9542-1MGİmmünofloresan
dCas9-KRABAddgene110820Genetik manipülasyon
DNase INEBM0303LDoku işleme
DPBSCorning21-030-CMDoku işleme
Ekstra Keskin Kaplamasız Tek Kenar BıçağıGEM62-0167Doku işleme
Hücre Dışı Matriks Substratı Corning354234Azaltılmış Büyüme Faktörünü Düşünün (alternatif olarak 
FBSCytivaSH30910.03Hücre kültürü Fiji
Image JFiji Image JSoftwareImmunofluorescence
Keçi anti-tavşan HRP konjuge multimer Thermo FisherA16104NuMA Boyama Keçi
SerumuGibcoPCN5000İmmünofloresan
HBSSCorning21-020-CVDoku işleme
Hematoksilen ve nbsp;Richard-Allan Bilimsel 7231Histoloji
Illumina III PerkinElmerCLS136334BLI Enstrüman
İnsülin şırınga 28G - 8mm iğneBD329424Enjeksiyonları
İnsülin şırınga 31G - 6mm iğne ve nbsp;BD326730Enjeksiyonlar
İris Forseps, 10.2cm, Tam Eğri, tırtıklıWPI504478Perfüzyon ve cerrahi prosedürler için
İzofluran USPCovetrus11695067772Anestezi
Kuyumcular #7 Forseps Titanyum 11 cm 0.07 x 0.01 mm UçWPI WP6570Mikrocerrahi prosedürler için
Ketamin HCl 100mg/mLMylan Ind.1049007Anestezi
lentiCRISPRv2Addgene98290Genetik manipülasyon
Lycopersicon Esculentum (Domates) Lektin, DyLight 649InvitrogenL32472Vasküler endotel hücreleri marker
MEM esansiyel olmayan amino asitler X 100Corning25-025-CIHücre kültürü
Metzenbaum MakasWPI503269Cerrahi için prosedürler
Mikroenjeksiyon ÜnitesiKOPF5000İntrakardiyak enjeksiyonlar
NaClFisherS25877 NuMA Boyama
İğne 30G x 25mmBD305128İntrakardiyak Enjeksiyon
İğnesi 33G x 15mmHamilton7747-01İntrakarotis Enjeksiyon
İğnesi tutucusu, Castroviejo, 14cm, kilitli, 1.2mm Tırtıklı ÇenelerWPI14137-GMikrocerrahi prosedürler için
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ farelerJackson Laboratuvarı005557Murine modeli
NU/J fareleriJackson Laboratuvarı002019Murine modeli
Nükleer Mitotik Cihaz Protein poliklonal tavşan anti-insan Abcam97585NuMA Boyama
Penisilin-Streptomisin 10000U/mLGibco15140122Hücre kültürü
PercollGE0891-01yoğunluk ayırma çözeltisi  
PI Klasik Cerrahi EldivenlerKardinal Sağlık2D72PT75XCerrahi
pLKO Tet-OnAddgene21915Genetik manipülasyon
Povidon-İyot% 10 ÇözeltiMedlineMDS093943Cerrahisi
Proparakain Damlaları% 0.5Akorn PharmaAX0501Oftalmik lokal anestezik
Puralube Petrolatum Oftalmik MerhemDechra83592Anestezi
Tıraş Bıçağı Çift Kenarlı Bıçaklar EMS72000Tıraş ve Vibrotomlu Beyin Dilimleme 
Refleks 9mm EZ Klips Beyin AğacıEZC-  KITYara kapatma
RPMI 1640 Corning10-040-CMHücre kültürü
Makası, Bahar 10.5cm Str, 8mm BıçaklarWPI501235Mikrocerrahi prosedürler için
Yarı Otomatik Titreşimli Bıçak MikrotomLeicaVT1200Beyin Dilimi İmmünofloresan
Tek Kanallı Anestezi Buharlaştırıcı SistemiKent ScientificVetFlo-1210S Anestezi
Smartbox Masaüstü Oda Sistemi ve Egzoz BlowerEZ SistemleriTT4000CO2 Ötenazi
Steril Fenestre Tek Kullanımlık ÖrtüMedlineNON21002Cerrahisi
Set-In Kollu Steril Takviyesiz Aurora Cerrahi ÖnlüklerMedlineDYNJP2715Cerrahisi
T25 ŞişesiCorning 430639Hücre kültürü
TrisCorning46-031-CMNuMA Boyama
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500MLİmmünofloresan
Troutman bağlama forsepsleri, 10cm, Kavisli G deseni, bağlama platformlu 0,52 mm uçWPIWP505210Mikrocerrahi prosedürler için
Damar klipsleri 10G Basınç 5x 0.8mm Çeneler, 5 / paketWPI15911İçin mikrocerrahi prosedürler
VisiopharmVisiopharm VisiopharmNuMA Boyama Kantitasyon Yazılımı
Ksilazin 100mg/mLAkorn Pharma59399-111-50Anestezi
KsilenFisherX3P-1GALHistoloji
Forseps uygulayan

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Melanoma MetastasisIn Vivo ModelsIntracardiac InjectionIntradermal InjectionSubcutaneous InjectionBioluminescence ImagingTumor Cell SortingSingle Cell RNA SequencingImmunohistopathologyMetastasis Suppressor

Related Articles