Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Entomopatojenik Mantarların, Metarhizium robertsii ve Metarhizium pinghaense'nin Böcek Zararlılarına Karşı Ticari Uygulama İçin Seri Üretimi

9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63246

⸱

31 Mart 2022

 ,  , 
1Department of Conservation Ecology and Entomology, Faculty of AgriSciences, Private Bag X1

Bu makalede

Özet

Entomopatojenik mantarlar tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrol ajanları olarak önem kazanmıştır. Bu çalışmada, hem Metarhizium robertsii hem de M. pinghaense'nin Güney Afrika izolatlarının yeterli sayıda dirençli enfektif propagülünün böcek zararlılarına karşı ticari uygulama için seri üretimi, tarımsal tahıl ürünleri kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir.

Özet

Metarhizium anisopliae tür kompleksinin entomopatojenik mantarları, tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrol ajanları olarak önem kazanmıştır. Kimyasal böcek öldürücülere karşı haşere direncindeki artış, böcek öldürücülerin insan sağlığı üzerindeki olumsuz etkilerine ilişkin artan endişeler ve pestisitlerden kaynaklanan çevre kirliliği, bitki koruma ve haşere kontrolü için yeni sürdürülebilir stratejiler bulmak için küresel bir dürtüye yol açmıştır. Daha önce, Beauveria bassiana gibi entomopatojenik mantar (EPF) türlerini kitle kültürü girişimleri gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, böcek zararlılarına karşı kullanılmak üzere kitle kültürü Metarhizium robertsii ve M. pinghaense'ye sadece sınırlı girişimlerde bulunulmuştur. Bu çalışmada, M. robertsii ve M. pinghaense'nin Güney Afrika izolatlarının ticari uygulama için yeterli sayıda dirençli enfektif propagusunun seri olarak üretilmesi amaçlanmıştır. EPF katı fermantasyon substratları olarak üç tarımsal tahıl ürünü, pul pul yulaf, pul pul arpa ve pirinç kullanılmıştır. Katı substratları aşılamak için iki aşılama yöntemi, konidiyal süspansiyonlar ve blastosporların sıvı mantar kültürü kullanıldı. Konidiyal süspansiyonlar kullanılarak yapılan aşılamanın nispeten daha az etkili olduğu gözlenmiştir, çünkü blastospor aşılama yönteminin kullanılmasına göre katı substratlarda artan kontaminasyon seviyeleri gözlenmiştir. Pul yulafın hem M. robertsii hem de M. pinghaense için uygun bir büyüme substratı olmadığı bulunmuştur, çünkü substrattan kuru konidia toplanmamıştır. Çırpılmış arpanın M. robertsii conidia'nın üretimini M. pinghaense'ninkine tercih ettiği bulundu ve substrattan ortalama 1.83 g ± 1.47 g kuru M. robertsii conidia ve sıfır gram M. pinghaense conidia toplandı. Pirinç tanelerinin, hem M. pinghaense hem de M. robertsii izolatlarının konidiyal seri üretimini desteklediği, sırasıyla substrattan toplanan ortalama 8.2 g ± 4.38 g ve 6 g ± 2 g olduğu bulunmuştur.

Giriş

Entomopatojenik mantarlar (EPF), önemli tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrolünde bitki koruma ajanları olarak önem kazanmıştır 1,2. Toprakta doğal olarak bulunan entomopatojenler, çeşitli haşere türlerinin popülasyonlarında epizootiklere nedenolur 3. EPF türleri konakçıya özgüdür ve hedef olmayan türlere saldırma açısından nispeten az risk oluşturur ve çevre için toksik değildirler4. EPF, konakçılarını istila etmek ve yakın çevrelerinde yaymak ve kalıcı olmak için benzersiz bir mekanizmaya sahiptir1. Konağa esas olarak, konakçı hemokolunda istila etmek ve çoğalmak için konakçı kütikülüne bağlanan ve nüfuz eden aseksüel sporlar yoluyla saldırırlar. Konakçı sonunda hemolenf besin maddelerinin tükenmesi nedeniyle veya mantar tarafından salınan toksik metabolitlerin neden olduğu tokseminin bir sonucu olarak ölür. Ölümü takiben, ideal çevre koşullarında, mantar konakçı kadavranın dış yüzeyinde (açık mikoz)ortaya çıkar 5,6.

Kimyasal kalıntıların insan sağlığı, çevre kirliliği ve haşere direncinin gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerine ilişkin artan endişeler, kimyasal bazlı böcek öldürücülerin girdilerini azaltma ve mahsul koruma ve haşere kontrolü için alternatif, yeni ve sürdürülebilir stratejiler bulma yönündeki küresel dürtüye yol açmıştır 6,7,8 . Bu, geleneksel kimyasal kontrolden daha ekolojik olarak elverişli stratejiler olan Entegre Haşere Yönetimi (IPM) programlarında kullanılmak üzere mikrobiyal bazlı insektisitler geliştirme fırsatları sağlamıştır 3,8.

Bir tarımsal haşere için başarılı bir mikrobiyal kontrol ajanı geliştirmek için, önce uygun bir organizma izole edilmeli, karakterize edilmeli, tanımlanmalı ve hedef haşere için patojenitesi doğrulanmalıdır. Bununla birlikte, biyolojik kontrol programlarında kullanılmak üzere uygun bir ürün üretmek için mikrobiyal maddenin büyük ölçekli üretimi için kolay, uygun maliyetli bir yöntem gereklidir 9,10,11,12,13. Önemli miktarlarda kaliteli entomopatojenlerin seri üretimi, mikrobiyal suşa, çevreye, hedef zararlıya, formülasyona, pazara, uygulama stratejisine ve istenen son ürüne bağlıdır14,15,16. EPF, blastosporlar üretmek için sıvı substrat fermantasyonu veya hava konidia 6,17,18 üretmek için katı substrat fermantasyon işlemi kullanılarak seri olarak üretilebilir. Bununla birlikte, entomopatojenlerin seri üretim ve formülasyon süreci, nihai ürünün virülansı, maliyeti, raf ömrünü ve saha etkinliğini doğrudan etkiler. IPM'de başarılı bir şekilde kullanılması için, entomopatojenlerin üretim sürecinin çalıştırılması kolay olmalı, minimum emek gerektirmeli, yüksek verimli virülan, canlı ve kalıcı propagules konsantrasyonu üretmeli ve düşük maliyetliolmalıdır 4,13,14,16.

Entomopatojenlerin beslenme gereksinimlerinin anlaşılması, tüm kültürleme yöntemleriyle kitle ekimi için önemlidir 4,12. Üretim ortamının besin bileşenleri, biyokontrol etkinliği, verim, kuruma toleransı ve kalıcılık 8,19,20,21 dahil olmak üzere ortaya çıkan propagüllerin özellikleri üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Üretim prosedürlerinin optimizasyonu bu faktörleri ele almak için tasarlanmıştır22. EPF için, iyi büyüme, sporülasyon ve mantar konidiasının seri üretimi için temel gereksinimler yeterli nem, optimum büyüme sıcaklığı, pH, CO2 ve O2'nin gaz değişimi ve iyi fosfor, karbonhidrat, karbon ve azot kaynakları dahil olmak üzere beslenmedir18.

Jaronski ve Jackson18, katı substrat fermantasyon yöntemini, sıvı substrat fermantasyon yöntemine göre EPF üretimi için doğal prosese en verimli ve en yakın yaklaşım yöntemi olarak tanımlamaktadır, çünkü doğal koşullar altında, mantar konidiyumu, böcek kadavralarının yüzeyi gibi katı dik yapılar üzerinde doğar. Tarımsal ürünler ve nişasta içeren yan ürünler çoğunlukla hipokrealli mantarların seri üretimi için kullanılır, çünkü mantarlar nişastayı hifal uçlarından yüksek konsantrasyonlu hidrolitik enzimlerin salgılanması, katı maddeye nüfuz etmesi ve maddede bulunan besin maddelerine erişmesi yoluyla kolayca ayrışırlar11,17,18,23 . Tahıl ürünleri aynı zamanda sağlıklı biyokütle üretimi için gereksinimleri de sağlar, çünkü hidratlandıklarında ve sterilize edildiklerinde, substratlar herhangi bir sıvı ortamdan daha fazla besin maddesini emebilir16,18,24.

Daha önce, birkaç çalışma Beauveria bassiana (Bals.) gibi EPF türlerini kitle kültürüne çalıştı. Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas ve Metarhizium anisopliae'nin bir kısmı (Metschn.) Sorokin türleri kompleksi çeşitli substratlar üzerinde izolatlar 16,23,24. Bu tür seri üretilen ve ticari olarak geliştirilen izolatlar arasında M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 suşu ICIPE69) ve M. anisopliae'den geliştirilen Real Metarhizium 69 (L9281) ve B. bassiana25,26'dan geliştirilen Broadband® (suş PPRI 5339) ve Eco-Bb'den geliştirilen Yeşil Kas® (suş IMI 330189) ve Eco-Bb® bulunmaktadır. . Bununla birlikte, kitle kültürü Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber ve Metarhizium pinghaense Chen & Guo'ya sınırlı girişimlerde bulunulmuştur. Bu iki izolat, önceki bir çalışmada, mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27'nin kontrolünde en etkili olarak seçilmiştir. Bu nedenle, bu çalışma, böcek zararlılarına karşı ticari uygulama için M. robertsii ve M. pinghaense'nin yerel izolatlarının yeterli sayıda esnek enfektif propagülünün formüle edilmesini ve seri olarak üretilmesini amaçlamıştır. Katı substrat fermantasyon yöntemi, her iki EPF izolatı için mantar konidiasını seri üretmek için kullanıldı. Katı substratları aşılamak için konidiyal süspansiyonlar ve blastosporların sıvı mantar kültürü kullanılarak iki EPF aşılama yöntemi kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Mantar suşlarının kaynağı

  1. Güney Afrika'nın Western Cape eyaletindeki elma bahçelerinden toplanan M. pinghaense 5 HEID (GenBank Katılım numarası: MT367414/MT895630) ve M. robertsii 6EIKEN'in (MT378171/MT380849) Güney Afrika izole mantar suşlarını kullanın.
  2. Her EPF'nin kültürlerini, 1 g maya ekstresi (SDAY) ve 10 μL Streptomisin ile desteklenmiş 60 g Sabouraud dekstroz agar ortamı üzerinde izole edin.
    NOT: EPF kültürlerini karanlıkta ± 25 °C kontrollü bir sıcaklıkta inkübe edin.

2. Metarhizium pinghaense  ve M. robertsii konidiyal süspansiyon aşılama

  1. Katı substratların hazırlanması
    1. İki EPF izolatı için büyüme ortamı olarak pullanmış yulaf ve pul pul arpa olmak üzere iki tarım ürünü ve fermantasyon torbaları olarak otoklav torbaları (305 mm × 660 mm) kullanın.
    2. Otoklav torbasının açık ucundaki fermantasyon torbası için bir boyun oluşturmak üzere küçük bir polivinilklorür atık borusu (1000 mm × 50 mm) kullanın ve boruyu torbaya sabitlemek için otoklav bant kullanın.
    3. Fermantasyon sırasında yeterli gaz değişimine izin vermek için boruyu steril bir pamuk yünü tapası ile kapatın.
    4. Hem pullanmış yulafın hem de pullanmış arpanın kuru tanelerini (200 g) tartın ve fermantasyon torbalarına yerleştirin ve her torbaya 100 mL damıtılmış su ekleyin ve torbaların içeriğini iyice karıştırın.
    5. Otoklavlama ve sterilizasyondan önce nemi emmek için ıslak taneleri 15-30 dakika dinlendirin. Her tahıl tipi için altı torba hazırlayın ve kontaminasyonu önlemek için torbaları diğer otoklav torbalarına yerleştirin ve alt tabakaları 55 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın.
  2. Konidiyal süspansiyon inokulumunun hazırlanması
    1. Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin mantar kültürlerinden 2-3 haftalık mantar konidiasını steril bir cerrahi bıçak kullanarak kazıyarak hasat edin.
    2. Toplanan mantar konidiasını 20 mL steril damıtılmış suda askıya alın,% 0.05 Tween 20 ile desteklenmiş ve konidiyal süspansiyonları 2 dakika boyunca vorteks ile karıştırın.
    3. 1 × 107 konidia / mL konsantrasyonda 20 mL konidiyal süspansiyon hazırlayın ve sırasıyla pul pul yulaf ve pul pul arpa katı substratlarını aşılayın.
      NOT: Konidiyal konsantrasyonları belirlemek için bir hemositometre kullanın.
  3. Katı substratların aşılanması
    1. Pamuk yünü boyun tapalarını çıkararak her torbayı açın ve hazırlanan 20 mL konidiyal süspansiyonu soğutulmuş otoklavlanmış alt tabakaya ekleyin.
    2. Boyun tıkaçlarını kullanarak torbaları tekrar kapatın ve mantar inokulumun tahıl substratı ile eşit şekilde karışmasını sağlamak için torbanın içeriğine masaj yapın.
    3. Fermantasyon torbalarını ± 25 ° C'lik kontrollü bir sıcaklıkta inkübe edin ve kültür ile çevre arasında yeterli gaz alışverişini sağlayın.
      NOT: Bu prosedür laminer bir akış kabini altında yapılmalıdır.
  4. Fermantasyon aşaması
    1. Aşılama ve inkübasyondan 2 gün sonra, görünür misel büyümesi meydana geldiğinde ve substrat büyüyen mantar tarafından kümelenmeye başladığında, fermantasyon torbalarındaki tahıl substratlarına manuel olarak masaj yapın.
      NOT: Bu, mantarların vejetatif büyümesinin ilk erken aşamalarında misel dallanmasının gerçekleşmesine izin vermek için aşılanmış granülleri karıştırmak için yapılır.
    2. Tahıl substrat yataklarının fiziksel heterojenliğinden ve substrat kütlesinin yatak kalınlığından kaçınmak için substrat yatağını manipüle etmek için bir mutfak oklavası kullanın.
      NOT: İşlem, mantar sporu üretimini optimize eden ve yüzey alanını en üst düzeye çıkararak konidiyal verimi teşvik eden mantar metabolizmasını teşvik eder18.
    3. Fermantasyon işlemini 4-5 haftaya kadar devam edecek şekilde bırakın ve fermantasyon işlemi sırasında gelişebilecek ve mantar konidia verimini büyük ölçüde etkileyebilecek herhangi bir beyaz vejetatif aşırı büyümenin varlığı için fermantasyon torbalarını her 2 günde bir kontrol edin.
      NOT: Beyaz vejetatif aşırı büyüme içeren fermantasyon torbalarındaki fermantasyonu derhal sonlandırın ve mantar kültürlerini kurutun18.

3. Blastospor aşılama

  1. Blastospor üretimi ve aşılama
    1. Hem M. pinghaense hem de M. robertsii için 1 L damıtılmış su, 30 g glikoz, 20 g maya ekstresi, 4 g potasyum fosfat diabazik (K2HPO4), 15 mL mısır dik likörü ve 10 μg / mL antibiyotik Streptomisin içeren bir sıvı kültür ortamı hazırlayın.
    2. İlk önce, damıtılmış suyu ısıtın, kaynama noktasına ulaşmadan önce kapatın ve Streptomisin hariç bileşenlerin her birini tenceredeki sıcak suya ekleyin. Ortamı 3-4 dakika boyunca hafifçe kaynatın ve malzemelerin uygun şekilde karıştırılmasına izin vermek ve bazı bileşenlerin tencerenin dibine yerleşmesini önlemek için ortamı sürekli karıştırın.
    3. Ortamın toplam 100 mL'sini dokuz farklı 250-mL şişeye dökün ve her şişeye bir pamuk yünü tapası yerleştirin ve pamuk yününü bir tıpa olarak alüminyum folyo ile örtün (Şekil 1A).
    4. Şişelerdeki ortamı 121 ° C'de 55 dakika otoklav yapın. Otoklavlamayı takiben, şişelerdeki ortamın soğumasını bekleyin ve her şişedeki ortama 10 mg / mL Streptomisin ekleyin (Şekil 1B).
    5. Hem EPF izolatları, M. pinghaense hem de M. robertsii için 2-3 haftalık mantar kültürü plakalarından iki ila üç bakteriyel mantar konidia döngüsü toplayın ve steril koşullar altında 250 mL şişelerdeki her 100 mL sıvı ortama aktarın ve şişeleri kapatın.
    6. Sıvı kültür şişelerini ± 25 ° C'de, 3 gün boyunca 140 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda inkübe edin ve kültürler mantar blastospor büyümesi ile yüksek bulanıklık belirtileri gösterdiğinde inkübasyonu durdurun (Şekil 1C).
    7. Kültürlerden kaynaklanan olası herhangi bir bakteriyel kontaminasyonu tespit etmek için, inkübasyon sırasında 24 saat sonra her sıvı kültür şişesinden 100 μL'lik bir numune alın ve izole başına üç SDA plakasına plaka koyun. Plakaları 48 saat boyunca, ± 25 ° C'lik kontrollü bir sıcaklıkta inkübe edin.
  2. Katı substratın hazırlanması
    1. Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin blastosporları için katı bir substrat ortamı olarak kaynatılmış uzun taneli beyaz pirinç kullanın (Jaronski ve Jackson18'den uyarlanmıştır).
    2. Fermantasyon torbalarını yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, 2.1.1-2.1.3 adımlarında hazırlayın ve her torba için 1 kg pirinç ve 300 mL steril damıtılmış su ekleyin.
    3. Fermantasyon torbalarının içeriğini yavaşça karıştırın ve dış otoklav torbalarına dik konumda yerleştirin ve otoklav 55 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın. Otoklavlamayı takiben, substratların steril koşullar altında 45 dakika ± soğumasını bekleyin.
  3. Aşılama ve fermantasyon
    1. Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin sıvı kültür şişelerinin her birinin kapağını laminer bir akış altında çıkarın ve her şişenin kenarını 10 sn boyunca alevlendirin.
    2. 100-mL sıvı kültürleri, pamuk yünü tapalarını boyunlarından çıkararak fermantasyon torbalarına dökün (Şekil 2). Pamuklu tapaları tekrar takın ve torbanın boynunun üst kısmını lastik bir bantla sabitlenmiş cerrahi kağıtla örtün.
      NOT: Bir hemositometre kullanarak her şişe için blastospor konsantrasyonunu belirleyin ve substratları28 noküle etmek için 1 × 107 - 5 × 108 blastospor / mL blastospor konsantrasyonlarını kullanın.
    3. Torbanın üst kısmını bükün ve substratın masaj yoluyla sallanarak ve hafif manipülasyonunu yaparak torbanın içeriğini karıştırın ve kalın yatak oluşumunu önlemek için substratı torbalarda düzleştirerek torbaları ± 25 ° C'de inkübe edin18.
    4. Substratı, torbaların içeriğine masaj yaparak, aşılama ve inkübasyondan 2-3 gün sonra, görünür misel büyümesi ve substratın mantar tarafından bağlanması meydana geldiğinde (Jaronski ve Jackson18'in tekniğinden uyarlanmıştır) fermantasyon torbalarında kırın.
      NOT: Fermantasyonun 4 hafta boyunca devam etmesine izin verin.

figure-protocol-1
Resim 1: 250-mL şişelerde sıvı kültür ortamı . (A) Otoklavlamadan önce. (B) EPF sporları ile otoklavlama ve aşılamadan sonra. (C) Mantar blastosporları içeren bulanık ortam. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Resim 2: Hazırlanmış blastospor sıvı kültür ortamı. (A) Metarhizium robertsii ve (B) Pirincin katı bir substrat olarak aşılanmasından önce Metarhizium pinghaense. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Mantar kültürlerinin kurutulması

  1. Mantar kültürlerini, fermantasyondan sonraki 10-12 gün boyunca, denemelerde kullanılmadan önce, sporlandırılmış kültürleri 26-30 kg (30 x 43 x 15250cm3) kahverengi kağıt torbalara aktararak kurutun.
  2. Kağıt torbaların çekme dayanımını artırmak için, her torbanın üst kısmının üçte birini yatay olarak kesin ve torbanın alt kısmını hizalayın (Şekil 3A, B).

figure-protocol-3
Şekil 3: Kağıt torbaların hazırlanması, kültürlerin kurutma işlemi ve paketleme. (A,B) Kahverengi kese kağıtların hazırlanması. (C,E) kaynatılmış pirinç ve (D,F) pul pul arpa üzerinde yetiştirilen Metarhizium türü kültürlerinin kurutma işlemi. (G) Üçgen bir çadır yapısı oluşturmak için zımbalarla kapatılmış kağıt torbalar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Her fermantasyon torbasındaki substratı yavaşça parçalayın, her torbanın köşesini kesin ve tüm kültürü, kesme köşesinin bıraktığı boşluktan kağıt torbalara aktarın (Şekil 3C-F). Mantar sporlarının havaya aşırı kaçmasını önlemek için, bu işlemi yavaşça gerçekleştirin.
    NOT: Kontaminasyonu önlemek için bu işlemi steril koşullar altında, laminer akış kullanarak gerçekleştirin.
  2. Her bir kağıt torbayı etiketleyin ve her torbanın üst ucuna iki kez katlayın ve üçgen bir çadır yapısı oluşturmak için zımbalarla kapatın ve torbaları, 25 ° C'± kontrollü bir sıcaklıkta ve% 30-40'lık düşük nemde düzgün, hatta kurumaya izin vermek için tel kurutma raflarına yerleştirin.
  3. Kültürlerin eşit kurumasına izin vermek ve hasat edilebilir mantar sporlarının verimini düşürecek herhangi bir vejetatif yeniden büyümeden kaçınmak için torbaları günlük olarak çevirin.
  4. Kurutma işlemi sırasında her bir kurutma torbasını her 2 günde bir tartın ve birbirini izleyen günler arasında torbaların kütlesinde çok az değişiklik gözlenene kadar veya hiç değişiklik gözlenmeyene kadar her torba için kurutma işlemine devam edin.

5. Mantar konidia hasadı

  1. Bir toplama tavasına monte edilmiş ETS örgü no. 100 (150-μm diyafram açıklığıyla) üzerine yuvalanmış üç iç içe geçmiş elek (500-μm diyafram açıklığında), bir test eleği (500-μm diyafram açıklığında), bir test eleği (500-μm diyafram açıklığında) kullanarak mantar konidiasını kültürlerden mekanik olarak hasat edin.
  2. Kuru kültür numunesini ETS ağ no. 35 elek üzerine yavaşça yükleyin ve mantar konidiasının havaya salınmasını önlemek için elek üzerine bir kapak yerleştirin.
  3. Mantar konidiasının ağ ekranlarından geçişine yardımcı olmak için eleklere 10-12 cam mermer ekleyin ve konidianın elek içinde tutulmasını önleyin, bu da spor iyileşmesinin azalmasına neden olabilir.
  4. Konidiyal tozun kaçmasını önlemek için elek bağlantılarını elektrik bandı kullanarak bantlayın ve kapatın.
  5. Elekleri yapışkan bir ped ile donatılmış titreşimli bir çalkalayıcıya yerleştirin, toplama tavasını ve elekleri 20-25 dakika boyunca, dakikada 560-640 titreşimlik bir hareketle sabitlemek için (Şekil 4).
    NOT: Jaronski ve Jackson18'den uyarlanmış teknik.

figure-protocol-4
Şekil 4: Kurutulmuş Metarhizium robertsii kültürlerinden mantar sporlarının pirinç ve pul pul arpa üzerinde toplanması. (A) Mantar konidiasının ağ ekranlarından geçişine yardımcı olmak için eleklere 10-12 cam mermer eklenir. M. robertsii conidia (B) pirinç üzerine kültürlerden hasat edildi ve (C) zar zor pul pul döküldü. (D) Titreşimli çalkalayıcıda elenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Test eleklerini toplama tavasından çıkarın, konidia toplayın ve toplanan konidiayı uzun süreli depolama için (3-6 ay) hava geçirmez ve su geçirimsiz fermuar kilidi torbalarında saklayın.

6. Üretilen mantar konidiasının nicelleştirilmesi

  1. Her bir substrattan mantar konidiasının toplanmasından önce her bir tahıl substratının kütlesini ölçün ve kaydedin.
  2. Toplanan sporların kütlesini katı substratın kütlesinden çıkararak toplanan konidianın toplam ağırlığını ölçün.
    NOT: Toplam konidia verimi sadece hasat edilen konidiayı değil, aynı zamanda katı substrat üzerinde kalan fungal konidiayı da içerir.
  3. Substratı tartın ve tartılan substrattan 10 g çıkarın. Substratın 10 gramını% 0.05 Aralık 20'de askıya alın ve 10 mL steril damıtılmış suda seyreltin.
  4. Vorteks-süspansiyonu 2 dakika boyunca karıştırın ve substrattan yıkanan konidia sayısını belirlemek için spor sayımını yapmak için bir hemositometre kullanın.
  5. 10 mL seyreltme süspansiyonu oluşturmak için 10 mL yıkanmış konidiyal süspansiyonun 1000 μL'sini 9 mL steril damıtılmış suya aktararak daha fazla seyreltme yapın.
  6. Konidiyal süspansiyonları 2 dakika boyunca vorteks-karıştırın ve konidiyal konsantrasyonları belirleyin.
    NOT: Süspansiyonların konidiyal konsantrasyonunu belirlemek için Inglis, Enkerli ve Goettel30 tarafından açıklanan prosedürü ve formülü izleyin.
  7. Her kültürden toplanan konidiyal tozun toplam 0.1 g'ını,% 0.05 Ara 20 ile desteklenmiş 10 mL steril damıtılmış suda toplayın ve askıya alın ve konidiyal süspansiyonu 2 dakika boyunca vorteks-karıştırın ve bir hemositometre kullanarak konidiyal konsantrasyonu belirleyin.
  8. 10 mL konidiyal süspansiyonun 1000 μL'sini, 10 mL süspansiyon seyreltmelerini oluşturmak için 9 mL steril damıtılmış suya aktararak daha fazla seyreltme yapın.
  9. Konidiyal süspansiyonları 2 dakika boyunca vorteks-karıştırın, konidiyal konsantrasyonları hesaplayın ve gram başına konidia sayısını belirleyin.
  10. Hasat edilen tozun gramı başına konidia sayısını, hasat edilen konidiyal tozun başlangıç kütlesi ile çarpın. Substrattan yıkanan konidia sayısını, harcanan substratın toplam ağırlığı ile çarpın, konidianın hasat edildiği substrattır.
  11. Verilen iki değeri bir araya getirin ve18 numaralı substratın kg veya g başına konidia sayısını hesaplamak için substratın ilk kuru ağırlığına bölün.
    NOT: Hesaplamalar esas olarak pirinç substratı için yapılmıştır. Çimlenme veya konidiyal canlılık testi, üretilen konidianın yaşayabilirliğini belirlemek için hem M . pinghaense hem de M. robertsii izolatları için yapıldı.

7. Veri analizi

  1. Elde edilen sonuçların istatistiksel analizini yapmak için uygun bir bilgisayar yazılımı programı kullanın.
    NOT: Verilerin istatistiksel analizi STATISTICA sürüm 13.5.0.17 kullanılarak yapılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hem M. pinghaense hem de M. robertsii için pirinç üzerindeki kültürlerin içerik kütlesinde bir düşüş, mantar kültürlerinin kuruma aşamasında zamanla gözlenmiş, kültürler kuruduktan sonra kütlede hiç veya çok az değişiklik gözlenmiştir (Şekil 5). Hem M. pinghaense hem de M. robertsii'nin hasat edilmiş kuru fungal conidia tozu Şekil 6'da gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önemli tarımsal böcek zararlılarının biyolojik kontrolü için mikrobiyal ajanların bir agroekosisteme başarılı bir şekilde entegre edilmesi, laboratuvar koşullarında ilk adım olarak entomopatojenlerin hem başarısına hem de seri üretiminin kolaylığına bağlıdır. EPF'nin seri üretimi, biyolojik kontrol 9,10,11,12,13 kullanan IPM programları için EPF ürünlerinin büyük ölçekli uygulaması ve kullanılabilirliği iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, projeyi finanse ettikleri için Hort Pome, Hort Stone ve Endüstri için Teknoloji ve İnsan Kaynakları Programı'na (THRIP: TP14062571871) teşekkür eder.

ORCID:
Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578

Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312

Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,05 Tween 20LasecMantar sporlarının suyla karışmasına izin vermek için konidiyal süspansiyonlara eklenir
20 mL McCartney şişeleriLasecKonidiyal süspansiyonlar yapmak için kullanılır
Alüminyum folyo250 mL'lik şişe üzerinde pamuk yünü tapalarının kapağı olarak kullanılır
OtoklavConidia üretimi için kullanılan malzemeleri ve malzemeleri sterilize etmek için kullanılır işlem
Otoklav torbalarıLasecFermantasyon torbaları veya katı substrat kapları
Otoklav bandıLasecPVC boruları fermantasyon torbalarına sabitlemek için
Kahverengi Kraft kağıt torbalarTarımsal tahıllarda conidia kültürlerini kurutmak için kullanılır
Bunsen burnnerLabnet (Labnet International, Inc.)Ekipmanı alevlendirmek için kullanılır (cerrahi bıçaklar, ilmekleri ve şişelerin kenarlarını aşılamak)
Şeffaf kenar test eleğiMantar conidia'yı tarımsal tahıl substratlarından ayırmak için kullanılır
Mısır dik likörüSIGMA66071-94-1Blastospor sıvı ortamının bileşeni
Pamuk YünüLasecFermantasyon torbaları için boynun fişi olarak kullanılır
Duran laboratuvarı şişelerNeolabSDA ortamını ve damıtılmış suyu otoklavlamak için kullanılır
Elektrik bandıKonidiyal tozun kaçmasını önlemek için elek bağlantılarını bantlamak ve sızdırmaz hale getirmek için kullanılır
ENDECOTTS test eleğiMantar conidia'yı tarımsal tahıl substratlarından ayırmak için kullanılır
Erlenmeyer Şişeleri, Dar boyunlu, 250 mL şişeLasecBlastospor sıvı ortamının taşıyıcısı
Etanol (%99)LasecCerrahi bıçakları ve aşılama halkalarını sterilize etmek için kullanılır
Flaked arpaSağlık Bağlantısı WholefoodsHem M. pinghaense hem de M. robertsii
pul yulafTiger markalarıiçin katı substrat büyüme ortamı olarak kullanılırHem M. pinghaenseM. robertsii>Glukoz Merck konidia için katı substrat büyüme ortamı olarak kullanılan tarımsal tahıl
Blastospor sıvı ortamının
Aşılama halkalarıLasecBlastosporların büyümesi için sıvı ortamı innoküle etmek için sporları hasat etmek için
Mutfak oklavasıKatı tanecik alt tabaka yatağını manipüle etmek için kullanılır
Laminer akış KabiniESCO Laminer Akış KabiniSubstrat aşılaması sırasında steril ortam sağlayın
Metarhizium pinghaense conidiaStellenbosch <em>Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia conidia'sınıStellenbosch Üniversitesi6EIKENMetarhizium robertsii
MikroskopZEIZZ (Kapsam. A1)Konidiyal konsantrasyonları ve konidiyal canlılığı belirlemek için kullanılır
Orbital çalkalayıcıIncoShake- LABOTECBlastospor üretim prosesi için kullanılır
Yarı haşlanmış pirinçSpekkoTarımsal tahıl, hem M. pinghaense hem de M. robertsiiPenisilin-Streptomisin SIGMA'nın conidia için katı bir substrat büyüme ortamı olarak kullanılır
Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için SDA ortamına eklenir
Petri kaplarıSDA ortamı içinLasec
kapları Pipetler ve pipet uçlarıLabnet (BioPette PLUS)Sıvıların içindekileri ölçmek için kullanılır
Polivinilklorür Marley atık borusuFermantasyon torbası için bir boyun oluşturmak için kullanılır
Potasyum fosfat dibazik (K2HPO4)SIGMA-ALDRICHBlastospor sıvı ortamının bileşeni
Lastik bantCerrahi kağıdı fermantasyon torbası üzerine sabitlemek için kullanılır PVC boru boyunları
Sabaroud dekstroz agar (SDA)NEOGEN Kültür OrtamıMetarhizium pinghaense>Metarhizium robertsii
Steril damıtılmış susporlarını kültürlemek için kullanılırTarımsal tahılları nemlendirmek, konidiyal süspansiyonlar yapmak
için Yapışkan pedTitreşimli çalkalayıcıdaki seiveleri sabitlemek için kullanılır
Cerrahi bıçakLasecMantar kültürlerinden sporları sıyırmak için kullanılır
Cerrahi kağıtLasecFermantasyon torbasının PVC boyunlarını ve pamuk yünü tapalarını kapatmak için kullanılır
Titreşimli çalkalayıcıTarımsal tahıl substratlarından conidia'yı silkelemek için kullanılır
Vorteks karıştırıcıLabnet (Labnet International, Inc.)Mc Cartney şişelerinde konidiyal süspansiyonları karıştırmak için kullanılır
Maya özüBiolabSpor çimlenmesini ve büyümesini iyileştirmek için SDA ortamına eklenir
Fermuarlı kilitli çantalarGLADHasat edilmiş mantar conidia'yı depolamak için kullanılır
pul içeriği Büyüme Odası / inkübatörler Mantar conidia kültürü yetiştirmek için Hemositometre Konidiyal konsantrasyonları belirlemek için kullanılır kitle kültürü yapmak için kullanılan Üniversite 5HEID Kültürleri Hem

Kaynaklar

  1. Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
  2. Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
  3. Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
  4. Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
  5. Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).
  6. Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
  7. Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).
  8. Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
  9. Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
  10. Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
  11. Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
  12. Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
  13. Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
  14. Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
  15. Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
  16. Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
  17. Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
  18. Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).
  19. Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
  20. El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
  21. Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
  22. Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
  23. Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
  24. Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
  25. Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
  26. Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
  27. Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
  28. Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).
  29. Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
  30. Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Biyolojik MücadeleBöcek Zararlısı YönetimiKatı Faz FermantasyonuKonidyal SüspansiyonBlastospor İnokülasyonuPirinç Substratı
Entomopatojenik Mantarların, Metarhizium robertsii ve Metarhizium pinghaense'nin Böcek Zararlılarına Karşı Ticari Uygulama İçin Seri Üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.