Yöntem makalesi

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

DOI:

10.3791/63260

⸱

28 Aralık 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, bu protokolde, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila fototransdüksiyonu, bilinen en hızlı G proteinine bağlı sinyal yollarından biridir. Bu kaskadının özgüllüğünü ve verimliliğini sağlamak için, kalsiyum (Ca2+)-geçirgen katyon kanalı, geçici reseptör potansiyeli (TRP), iskele proteinine sıkıca bağlanır, inaktivasyon-sonrası-potansiyel D (INAD) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) ve fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ile büyük bir sinyal protein kompleksi oluşturur. Bununla birlikte, Drosophila TRP kanalının biyokimyasal özellikleri belirsizliğini korumaktadır. INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, endojen TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. İlk olarak, saflaştırılmış histidin (His) etiketli NORPA 863-1095 fragmanı Ni-boncuklara bağlandı ve endojen INAD protein kompleksini Drosophila kafa homojenatlarından aşağı çekmek için yem olarak kullanıldı. Daha sonra, TRP kanalı ile rekabet etmek için Ni-boncuklara aşırı saflaştırılmış glutatyon S-transferaz (GST) etiketli TRP 1261-1275 parçası eklendi. Son olarak, süpernatanttaki TRP kanalı, boyut dışlama kromatografisi ile aşırı TRP 1261-1275 peptidinden ayrıldı. Bu yöntem, Drosophila TRP kanalının geçit mekanizmasını hem biyokimyasal hem de yapısal açılardan incelemeyi mümkün kılar. Saflaştırılmış Drosophila TRP kanallarının elektrofizyoloji özellikleri gelecekte de ölçülebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fototransdüksiyon, emilen fotonların nöronların elektriksel kodlarına dönüştürüldüğü bir süreçtir. Sadece opsinleri ve aşağıdaki G proteinine bağlı sinyal kaskadını hem omurgalılarda hem de omurgasızlarda iletir. Drosophila'da, beş PDZ alanını kullanarak, iskele proteini inaktivasyonu-sonrası-sonrası-potansiyel D (INAD), geçici bir reseptör potansiyeli (TRP) kanalı, fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) 1'den oluşan bir supramoleküler sinyal kompleksi düzenler. Bu supramoleküler sinyal kompleksinin oluşumu, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin doğru hücre altı lokalizasyonunu, yüksek verimliliğini ve özgüllüğünü garanti eder. Bu komplekste, ışığa duyarlı TRP kanalları, NORPA'nın aşağı akış efektörleri olarak işlev görür ve kalsiyum akışına ve fotoreseptörlerin depolarizasyonuna aracılık eder. Önceki çalışmalar, Drosophila TRP kanalının açılmasına protonlar, yerel lipit ortamının bozulması veya mekanik kuvvet 2,3,4 aracılık ettiğini göstermiştir. Drosophila TRP kanalı ayrıca kalmodulin5 ile etkileşime girer ve kalsiyum tarafından hem pozitif hem de negatif geri besleme 6,7,8 ile modüle edilir.

Şimdiye kadar, Drosophila TRP ve TRP benzeri (TRPL) kanalların geçit mekanizması üzerine yapılan elektrofizyoloji çalışmaları, eksize edilmiş membran yamalarına, ayrışmış vahşi tip Drosophila fotoreseptörlerinden tüm hücre kayıtlarına ve S2, SF9 veya HEK hücrelerindehetero-eksprese kanallara dayanıyordu. Tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgileri de belirsizliğini koruyor. Saflaştırılmış proteinin elektrofizyolojik özelliklerini yeniden yapılandırılmış bir membran ortamında incelemek ve tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgisini elde etmek için, saflaştırılmış tam uzunlukta TRP kanallarının elde edilmesi, memeli TRP kanalı çalışmalarında kullanılan metodolojilere benzer şekilde gerekli ilk adımdır14,15,16,17.

Son zamanlarda, INAD protein kompleksi18,19,20'nin montaj mekanizmasına dayanarak, TRP kanalını streptavidin boncukları5 ile Drosophila kafa homojenatlarından arındırmak için bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. Streptavidin boncuklarının düşük kapasitesi ve pahalı maliyeti göz önüne alındığında, burada His-etiketli yem proteinini ve buna karşılık gelen düşük maliyetli Ni-boncukları çok daha yüksek kapasiteye sahip kullanan gelişmiş bir saflaştırma protokolü tanıtılmıştır. Önerilen yöntem, TRP kanalının geçit mekanizmasını yapısal açılardan incelemeye ve TRP kanalının elektrofizyolojik özelliklerini saflaştırılmış proteinlerle ölçmeye yardımcı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. GST etiketli TRP ve Onun etiketli NORPA parçalarının saflaştırılması

  1. GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını saflaştır
    1. CaCl 2 ısı şoku dönüşüm yöntemi 21'i kullanarak pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plazmid10'u Escherichia coli (E. coli)BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniye 10 mL Luria Bertani (LB) ortamında aşılayın ve 37 ° C'de gece boyunca büyüyün. Daha sonra, 10 mL tohumlama kültürünü 37 ° C'de 1 L LB ortamında yükseltin.
    2. Hücrelerin optik yoğunluğu (OD600) 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 ° C'ye soğutun ve hedef proteinin aşırı ekspresyonunu indüklemek ve 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe etmek için 0.1 mM izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG; son konsantrasyon) ekleyin.
    3. Aşırı ekspresyondan sonra, 3.993 × g'de santrifüjleme ile 1 L kültürlenmiş hücreyi 20 dakika boyunca pelet ve 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda yeniden askıya alır.
    4. Yeniden askıya alınan hücreleri, 4 °C'de önceden soğutulmuş yüksek basınçlı bir homojenizatöre yükleyin. Homojenizatör basıncını yavaşça 800 bar'a yükseltin. Giriş musluğunu açın ve yeniden askıya alınan hücrelerin dairesel olarak çok dar yarıklara sahip bir valften geçmesine izin verin.
      NOT: Hücreler, büyük bir basınç düşüşü ve kavitasyonun neden olduğu yüksek kesme kuvvetleri ile homojenize edilir.
    5. Bir yerçekimi akış kolonuna 5 mL glutatyon boncuk yükleyin ve boncukları toplam üç kez 50 mL PBS tamponu ile yıkayın.
    6. Hücre lizatını yüksek basınçlı homojenizatörden 48.384 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlü hücre lizatının (40 mL) süpernatantını, yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş glutatyon boncuklarına ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Glutatyon boncuklarını her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
    7. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. Akış kesirini atın. Kalan glutatyon boncuklarını 50 mL PBS tamponu ile iki kez durulayın.
    8. Glutatyon boncuklarına 15 mL elüsyon tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
    9. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını 50 mL'lik bir konik tüp içinde boşaltın ve 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) tamponu kullanılarak dengelenen bir boyut hariç tutma sütununa (hazırlama sınıfı) yükleyin.
    10. Boyut hariç tutma sütununun elüsyon akış hızını 3 mL/dk'da tutun. Salınan proteinleri 5 mL/tüp oranında toplayın.
    11. UV absorpsiyon sinyallerini 280 nm'de analiz ederek boyut dışlama sütunundaki hedef proteinin zirvesini tanımlayın ve SDS-PAGE jel analizi ile doğrulayın (elektroforez parametreleri: istifleme jeli için 150 V; çözme jeli için 200 V). Jeli Coomassie mavisi R250 ile sabitleyin.
    12. Saflaştırılmış GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını, masa üstü soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüj edilmiş 15 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak boyut hariç tutma sütunundan 1 mL'ye yoğunlaştırın.
    13. Bira-Lambert Yasasını kullanarak konsantre protein konsantrasyonunu belirleyin. GST etiketli TRP 1261-1275 parçasının UV emilimini bir spektrofotometre kullanarak 280 nm'de ölçün.
    14. Protein dizilerini Protparam programına (https://web.expasy.org/protparam/) aktararak 280 nm'de yok olma katsayısını elde edin. Tipik olarak, GST etiketli TRP 1261-1275'in 1 L kültürü, 1 mL 600 μM protein (6 x 10-7 mol) verir. Gerekli malzemeler için Tablo 1'e bakınız.
  2. Onun etiketli NORPA 863-1095 parçasının saflaştırılması
    1. CaCl 2 ısı şoku dönüşüm yöntemi 21'i kullanarak pETM.3C NORPA 863-1095 plazmid20'yi E. coli BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniyi 10 mL LB ortamında aşılayın ve 37 ° C'de gece boyunca büyüyün. Daha sonra, 10 mL tohumlama kültürünü 37 ° C'de 1 L LB ortamında yükseltin.
    2. Hücrelerin OD600'ü 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 ° C'ye soğutun ve hedef proteinin aşırı ekspresyonunu indüklemek ve 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe etmek için 0.1 mM IPTG (son konsantrasyon) ekleyin.
    3. Aşırı ekspresyondan sonra, 20 dakika boyunca 3.993 x g'de santrifüjleme ile 1 L kültürlenmiş hücreyi toplayın ve 40 mL bağlanma tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, yeniden askıya alınmış hücreleri, adım 1.1.4'te açıklandığı gibi 4 ° C'de yüksek basınçlı bir homojenizatörde lize edin.
    4. Bir yerçekimi akış kolonuna 5 mL Ni-boncuk yükleyin ve 50 mL bağlayıcı tamponla üç kez yıkayın.
    5. Hücre lizatını yüksek basınçlı homojenizatörden 48.384 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlü hücre lizatının süpernatantını, yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş Ni-boncuklarına ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ni-boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
    6. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. Akış fraksiyonunu atın ve kalan Ni-boncukları 50 mL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
    7. Ni-boncuklara 15 mL elüsyon tamponu ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ni-boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
    8. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, salınımlı His-etiketli NORPA 863-1095 parçasını 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) kullanılarak dengelenen bir boyut hariç tutma sütununa (hazırlama sınıfı) yükleyin.
    9. Boyut hariç tutma sütununun elüsyon akış hızını 3 mL/dk'da tutun. Salınan proteini 5 mL / tüp oranında toplayın.
    10. UV absorpsiyon sinyallerini 280 nm'de analiz ederek boyut dışlama sütunundaki hedef proteinin zirvesini tanımlayın ve SDS-PAGE jel analizi ile doğrulayın (elektroforez parametreleri: istifleme jeli için 150 V; çözme jeli için 200 V). Coomassie mavi R250 kullanarak jeli lekeleyin.
    11. Saflaştırılmış His etiketli NORPA 863-1095 parçasını, masa üstü soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüj edilmiş 15 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak boyut hariç tutma sütunundan 1 mL'ye konsantre edin.
    12. Bira-Lambert Yasasını kullanarak konsantre protein konsantrasyonunu belirleyin. Bir spektrofotometre kullanarak His-etiketli NORPA 863-1095 parçasının UV emilimini 280 nm'de ölçün.
    13. Protein dizilerini Protparam programına (https://web.expasy.org/protparam/) aktararak 280 nm'de yok olma katsayısını elde edin. Tipik olarak, His-etiketli NORPA 863-1095 fragmanının 1 L kültürü, 1 mL 600 μM protein (6 x 10-7 mol) verir. Gerekli malzemeler için Tablo 2'ye bakınız.

2. Drosophila kafalarının hazırlanması

  1. CO 2 anestezi yöntemi22,23'ü kullanarak yetişkin sinekleri 50 mL konik santrifüjleme tüplerinde toplayın; hemen sıvı azotta 10 dakika dondurun ve -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
  2. Yeterli sayıda sinek topladıktan sonra, sineklerin bacaklarını, kafalarını, kanatlarını ve vücutlarını ayırmak için donmuş 50 mL konik tüpleri elle kuvvetlice sallayın. Karışımı sıralı olarak istiflenmiş üç adet önceden soğutulmuş paslanmaz çelik eleğe (sırasıyla 20/30/40 ağ boyutu) aktarın ve elekleri sallayın.
  3. Daha sonra, kafalar 40 örgülü elek içinden geçemediğinden, sinek kafalarını 40 örgülü elek dışına süpürmek, 50 mL konik tüplere aktarmak ve -80 ° C'de saklamak için bir fırça kullanın.
  4. Sinekleri ve kafalarını sürekli olarak toplayın ve deney için gerekli miktara (0,5 g) ulaşana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın. Tipik olarak, 0.5 g kafa toplamak için, 50 mL'lik bir konik tüpte 35 mL sinek gerekir. Gerekli malzemeler için Tablo 3'e bakınız.

3. Drosophila TRP kanal saflaştırma

  1. Toplam 0,5 g kafa tartın ve önceden soğutulmuş bir harç havanesi kullanarak sıvı azotta tamamen homojenize edin. Homojenize edilmiş kafaları 10x v/w lizis tamponunda (5 mL) çözün, 20 dakika boyunca 4 °C'de bir çalkalayıcıda inkübe edin ve ardından 4 °C'de 20 dakika boyunca 20.817 x g'de santrifüj yapın.
  2. Spin-down süpernatantını ("20817 g S", Şekil 4) toplayın ve 4 ° C'de 60 dakika boyunca 100.000 x g'de santrifüj yapın. Aşağıdaki aşağı çekme testi için spin-down süpernatantını ("100.000 g S", Şekil 4) kullanın.
  3. Yerçekimi akış sütununa 1 mL Ni-boncuk ekleyin ve boncukları 4 ° C'de 10 mL çift damıtılmış H2O (ddH2O) ile toplam üç kez yıkayın. Boncukları, 4 ° C'de üç kez 10 sütun hacimli lizis tamponu ile dengeleyin.
  4. Ni-kolonuna 500 μL 600 μM saflaştırılmış His-etiketli NORPA 863-1095 proteini (3 x 10-7 mol) ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
  5. Boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. SDS-PAGE analizi için akış kesirini alın (NORPA F, Şekil 4). Bu bölümde, yem proteinleri Ni-boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilir.
  6. Ni-boncukları 4 °C'de 10 kolon hacimli lizis tamponu (10 mL) ile yıkayın ve SDS-PAGE analizi için yıkama fraksiyonunu saklayın (Yıkama 1, Şekil 4A). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve SDS-PAGE analizi için numuneyi saklayın (Yıkama 2, Şekil 4A). Bu bölümde, Ni-boncuklar üzerindeki aşırı yem proteinleri uzaklaştırılır.
  7. 100.000 x g santrifüjlemeden sonra Drosophila kafa homojenatının süpernatantını, 4 ° C'de Ni-sütununa ekleyin, burada His etiketli NORPA 863-1095 parçası hareketsiz hale getirilmiştir.
  8. Süpernatantı Ni-boncuklarla 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın. Ardından, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın.
  9. SDS-PAGE analizi için süpernatantı toplayın (Dro kafa lizisi F, Şekil 4A). Bu bölümde, kafa homojenatlarındaki INAD protein kompleksleri (INAD / TRP / ePKC), Ni-boncuklar üzerindeki hareketsiz NORPA 863-1095 parçaları tarafından yakalanır.
  10. Ni-boncukları 4 °C'de 10 sütun hacimli lizis tamponu (10 mL) ile yıkayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatantı yerçekimi çökelmesinden uzak tutun (Yıkama 3, Şekil 4A). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatantı toplayın (Yıkama 4, Şekil 4A). Bu bölümde, Ni-boncuklar üzerindeki bağlanmamış proteinler uzaklaştırılır.
  11. Ni-boncuklara 500 μL 600 μM GST etiketli TRP 1261-1275 protein (3 x 10-7 mol) ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
  12. Endojen Drosophila TRP kanalını içeren yerçekimi sütunundan (TRP E1, Şekil 4B) salınan fraksiyonu toplayın. Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve elüsyon fraksiyonunu toplayın (TRP E2, Şekil 4B). Bu adımda, GST etiketli TRP 1261-1275 parçalarını rakip olarak kullanarak, TRP kanalları Ni-boncuklar üzerindeki yakalanan INAD protein komplekslerinden (INAD / TRP / ePKC) salınır.
  13. Ni-boncukları 10 sütun hacimli bağlayıcı tamponla (10 mL; Tablo 1) 4 °C'de ve SDS-PAGE analizi için yıkama fraksiyonunu toplayın (Yıkama 5, Şekil 4B).
  14. Ni-boncuklara 500 μL elüsyon tamponu (Tablo 1) ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Yerçekimi akış kolonundan elüsyon fraksiyonunu toplayın (NORPA E1, Şekil 4B). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve elüsyon fraksiyonunu toplayın (NORPA E2, Şekil 4B).
  15. Elüsyon tamponunu kullanarak, INAD / ePKC protein kompleksleri ile birlikte His-etiketli NORPA 863-1095 fragmanını etkisiz hale getirin. Ardından, Ni-boncukları 500 μL bağlayıcı tamponda yeniden askıya alın.
  16. Elüsyonun verimliliğini analiz etmek ve elute tamponun çalışıp çalışmadığını değerlendirmek için SDS-PAGE'i (Coomassie mavisi R250 ile boyanmış) çalıştırmak için yeniden askıya alınmış Ni-boncukları alın (boncuklar, Şekil 4B). Gerekli malzemeler için Tablo 4'e bakınız.

4. Drosophila TRP kanalının boyut hariç tutma kolon saflaştırılması

  1. Protein saflaştırma sistemine bir boyut hariç tutma sütunu (analitik sınıf) takın. Kolonu 0,45 μm filtre ile filtrelenen sütun tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM) ile dengeleyin.
  2. TRP E1 ve E2 fraksiyonunu 3.14. adımdan itibaren, soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüjlenmiş 4 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak konsantre edin.
  3. Numune döngüsünü kolon tamponuyla durulayın ve numuneyi numune döngüsüne yükleyin. Numuneyi boyut hariç tutma kolonuna enjekte edin ve proteinleri uygun bir akış hızıyla (0,5 mL / dak) süzün.
  4. Hedef proteinin zirvesini 280 nm'de absorpsiyonla tanımlayın ve saflaştırılmış endojen Drosophila TRP kanalını tespit etmek için bir SDS-PAGE jeli çalıştırın (Şekil 5). Gerekli malzemeler için Tablo 5'e bakınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için bir protein saflaştırma yöntemi gösterilmiştir (Şekil 1).

İlk olarak, yem ve rakip proteinleri elde etmek için rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma uygulanır. Daha sonra, GST etiketli bir TRP 1261-1275 fragmanı, LB ortamındaki E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilir ve glutatyon boncukları ve bir boyut hariç tutma sütunu kullanılarak saflaştırılır (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beş PDZ alanı içeren INAD, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin temel organizatörüdür. Önceki çalışmalar, INAD PDZ3'ün TRP kanalı C-terminal kuyruğuna zarif bir özgüllükle bağlandığını göstermiştir (KD = 0.3 μM)18. INAD PDZ45 tandem, NORPA 863-1095 fragmanı ile son derece yüksek bir bağlanma afinitesi ile etkileşime girer (KD = 30 nM). Bu bulgular, NORPA CC-PBM parçasının aşağı çekme yemi olarak kullanılmasını sağlayan afinite saflaştırma artı rekabet stratejis...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31870746), Shenzhen Temel Araştırma Hibeleri (JCYJ20200109140414636) ve Guangdong Eyaleti, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2021A1515010796) tarafından W. L. L. tarafından desteklenmiştir. LetPub'a (www.letpub.com) bu makalenin hazırlanması sırasındaki dilbilimsel yardımları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bakteri suşları
BL21(DE3) Yetkin HücrelerNovagen69450Protein aşırı ekspresyonu
Deney modelleri
D.melanogaster: W1118 suşuBloomington Drosophila Stok MerkeziBDSC:3605Drosophila < / em > kafa hazırlığı
< güçlü > Malzeme< / güçlü >
20/30/40 örgü paslanmaz çelik eleklerJiufeng metal örgü şirketiGB / T6003.1< em > Drosophila < / em > kafa hazırlığı
% 30 Akrilamid-N, N ve asal;-Metilenbisakrilamid (29: 1)LableadA3291SDS-PAGE jel hazırlama
Amonyum PersülfatInvitrogenHC2005SDS-PAGE jel hazırlama
Kokteyl proteaz inhibitörüRoche05892953001Proteaz inhibitörü
Coomassie parlak mavi R-250Sangon BiotechA100472-0025SDS-PAGE jel boyama
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100Boyut dışlama sütunu tampon hazırlama
Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA)Sangon BiotechA500838-0500Boyut dışlama sütunu tampon hazırlama
GlisinSangon BiotechA610235-0005SDS-PAGE tampon hazırlama
Glutatyon Sefaroz 4 Hızlı Akışlı boncuklarCytiva17513202Afinite kromatografisi
İmidazolSangon BiotechA500529-0001Elüsyon tamponu Ni sütunu
İzopropil-beta-D-tiyokalaktopiranosit (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025Protein aşırı ekspresyonunun indüksiyonu
LB Suyu TozuSangon BiotechA507002-0250<em>E.coli. hücre kültürü
L-Glutatyon indirgenmiş (GSH)Sigma-aldrichG4251-100GGlutatyon boncukları
için elüsyon tamponu hazırlığıNi-Sefaroz excel boncuklarıCytiva17371202Afinite kromatografisi
N-Dodesil beta-D-maltosit (DDM)Sangon BiotechA610424-001Protein saflaştırması için deterjan
N, N, N ', N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE jel hazırlama
PBSSangon BiotechE607008-0500E.coli. hücresi için homojenizasyon tamponu
PMSFLableadP0754-25GProteaz inhibitörü
Önceden boyanmış protein işaretleyiciThermo Scientific26619/26616Önceden boyanmış protein merdiveni
Boyut dışlama sütunu (hazırlık sınıfı)Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 PG sütunu
Boyut dışlama sütunu (analitik sınıf)Cytiva29091596Superose 6 10/300 GL sütununu artırın
Sodyum klorürSangon BiotechA501218-0001Protein saflaştırma tamponu hazırlığı
Sodyum dodesil sülfat (SDS)Sangon BiotechA500228-0001SDS-PAGE jel/tampon hazırlama
Tris tabanıSigma-aldrichT1503-10KGProtein saflaştırma tamponu hazırlama
Ultrafiltrasyon dönüşü sütunMilliporeUFC901096/801096Protein konsantrasyonu
Ekipman
Analitik TeraziDENVERAPX-60Drosophila Metagesi kafa
15 mL ve 50 mL konik santrifüj tüpleri için masa üstü yüksek hızlı soğutmalı santrifüjEppendorf5810RProtein konsantrasyonu
Masa üstü yüksek hızlı soğutmalı santrifüj 1.5 mL santrifüj tüpleriEppendorf5417RHomojenizasyondan sonra Drosophila< / em> kafa lizatının santrifüjlenmesi
Boş yerçekimi akış sütunu (İç Çap = 1.0cm)Bio-Rad738-0015TRP protein saflaştırması
Boş yerçekimi akış sütunu (İç Çap = 2,5 cm)Bio-Rad738-0017E.coli.Gel Dokümantasyon Sisteminden yem ve rakip protein saflaştırması
Bio-RadUniversal Hood II Jel Doc XR SistemiSDS-PAGE görüntüleme
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjBeckman coulterAvanti J-26 XPE.coli. hücrelerinin/hücre lizatının santrifüjlenmesi
Yüksek basınçlı homojenizatörUNION-BIOTECHUH-05E.coli. hücrelerinin homojenizasyonu
Sıvı nitrojen tankıTaylor-WhartonCX-100Drosophila kafa hazırlığı
Protein arıtma sistemiCytivaAKTA temizleyiciProtein arıtma
Buzdolabı (-80 derece; C)Thermo900GPem > Drosophila < / em > kafa hazırlığı
SpektrofotometreMAPADAUV-1200OD600 E.coli. hücrelerinin ölçümü
SpektrofotometreThermo ScientificNanoDrop 2000cProtein konsantrasyonunun belirlenmesi
UltrasantrifüjBeckman sürgümakinesi Optima XPN-100 UltrasantrifüjUltrasantrifüj
için hazırlık <

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075(2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191(2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila TRP KanallarProtein Kompleksi Safla t rmaAfinite Safla t rmaBoyut D lama KromatografisiNikel BoncuklarGlutatyon BoncuklarINAD Protein KompleksiFototransd ksiyon YolaKriyo EM Teknikleri

İlgili makaleler