Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Ökaryotlarda, mayoz cinsel üremede genom stabilitesi ve genetik çeşitlilik için gereklidir. Testislerdeki spermatositlerin deneysel analizleri, erkek mayotik bölünmesinde iğ montajı ve kromozom ayrışmasının araştırılması için kritik öneme sahiptir. Fare spermatositi, mekanik mayoz çalışmaları için ideal bir modeldir, ancak spermatositlerin analizi için etkili yöntemler eksiktir. Bu makalede, fare spermatositlerinde kinesin-7 CENP-E'nin in vivo inhibisyonu için pratik ve etkili bir yöntem bildirilmiştir. 3 haftalık farelerde karın ameliyatı yoluyla GSK923295 spesifik bir inhibitörün testiküler enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Ayrıca, burada doku toplama ve fiksasyon, hematoksilin-eozin boyama, immünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu için bir dizi protokol tanımlanmıştır. Burada, erkek mayozunu incelemek için güçlü bir teknik olabilecek abdominal cerrahi ve testis enjeksiyonu yoluyla in vivo inhibisyon modeli sunuyoruz. Ayrıca, CENP-E inhibisyonunun, mayoz I sırasında primer spermatositlerde kromozom yanlış hizalaması ve metafaz durması ile sonuçlandığını gösterdik. İn vivo inhibisyon yöntemimiz, mayozun mekanik çalışmalarını kolaylaştıracak, erkek germ hatlarının genetik modifikasyonları için yararlı bir yöntem olarak hizmet edecek ve gelecekteki klinik uygulamalara ışık tutacaktır.
Giriş
Mayoz, ökaryotik organizmalardaki en önemli, oldukça katı, evrimsel korunmuş olaylardan biridir ve gametogenez, cinsel üreme, genom bütünlüğü ve genetik çeşitlilik için gereklidir 1,2,3. Memelilerde, germ hücreleri, tek bir DNA replikasyonu turundan sonra mayoz I ve II olmak üzere iki ardışık hücre bölünmesine uğrar. Mitozdaki kardeş kromatitlerin aksine, kopyalanmış homolog kromozomlar mayoz I 4,5 sırasında eşleşir ve iki yavru hücreye ayrılır. Mayoz II'de, kardeş kromatitler DNA replikasyonu olmadan haploid gametler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, Fujian Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Protokol numarası SYXK 2016-0007). Tüm fare deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir (NIH yayınları sayı 8023, gözden geçirilmiş 1978).
1. GSK923295 aracılı CENP-E inhibisyon fare modellerinin yapımı
- Cerrahi aletleri 121 °C'de 30 dakika boyunca sterilize edin. Cerrahi ultra temiz tezgahı 2 saat boyunca ultraviyole-C (UVC) ile ışınlayın. Deneyler için kullanılan 3 haftalık erkek ICR (Kanser ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Karın cerrahisi ve GSK92329519'un testiküler enjeksiyonu yoluyla fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini başarıyla oluşturduk. Bu yöntemin temel teknik adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. 4 gün boyunca testiküler GSK923295 enjeksiyonundan sonra, testisler daha ileri analizler için toplandı. Kontrol grubunda seminifer tübüllerdeki spermatojenik dalga düzenli ve organize idi (Şekil 2A). Bununla birlikte, GSK923295 gru.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, karın cerrahisi ve GSK923295 mikroenjeksiyonu kullanılarak fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini oluşturduk. Bu çalışmada kullanılan abdominal cerrahi ve testis enjeksiyon yöntemi aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, farelerin yaşı ile sınırlı değildir. Deneyciler testis enjeksiyonunu erken bir aşamada, örneğin 3 haftalık veya daha genç farelerde gerçekleştirebilirler. İkincisi, GSK923295 CENP-E üzerinde spesifik ve mükemmel bir inhibitör etkiye sahiptir. Üçüncüsü, bu yöntemi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Fujian Tıp Üniversitesi Hücre İskelet Laboratuvarı'nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi'nden Jun-Jin Lin'e akış sitometrisindeki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi Elektron Mikroskobu Laboratuvarı'nda Ming-Xia Wu ve Lin-Ying Zhou'ya elektron mikroskobundaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi'nden Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke ve Jun Song'a destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe nu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 Tripsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Şırınga | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | Steril. | |
| 1.5 mL Santrifüj tüpü | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Santrifüj Tüpü | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri kabı | Corning | 430166 | |
| %95 Etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009164 | |
| tübülin tavşan poliklonal antikoru | Beyotime | AF0001 | İmmünofloresan tahlilleri için. 1:100'de kullanın. |
| tavşan anti-Histon H3 (fosfo S10) monoklonal antikor | Abcam | ab267372 | İmmünofloresan testleri için. 1:100'de kullanın. |
| tavşan anti-TUBA4A poliklonal antikoru | Sangon Biotech | D110022 | İmmünofloresan testleri için. 1:100'de kullanın. |
| Anti-SYCP3 tavşan monoklonal antikoru | Abcam | ab175191 | İmmünofloresan testleri için. 1:100'de kullanın. |
| Yapışma mikroskobu slaytları | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488 etiketli keçi anti-tavşan antikoru | Beyotime | A0423 | Sencodary antikor. 1:500'de kullanın. |
| Alüminyum potasyum sülfat | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Susuz etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı | Beyotime | P0131 | Floresan sinyallerin fotoblebasyonunu önleyin. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Sığır Serumu Albümini | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 69003435 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Kloral hidrat | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 80037516 | |
| Sitrik asit | Şangay Deney Reaktifi Co, Ltd | 122670 | |
| Kollajenaz | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Lamel | CITOTEST | 10212020C | 20 & kez; 20 mm. Kalınlık 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Boya kdv'si | |||
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoksilen, susuz | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 71020784 | |
| ICR fare | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J yazılımı | Ulusal Sağlık Enstitüleri | https://imagej.nih.gov/ij/ | Floresan görüntü analizi. |
| Leica ultramikrotom | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramikrotom | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Yazılım Evi | Akış sitometrisi sonuçlarının analizi için. | |
| Oje | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | ||
| Nötr sakız | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, | ||
| Nikon Ti-S2 mikroskobu | Nikon | Ti-S2 | |
| Pikrik asit | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | , F519160-0001 | 10 &; l reodyne |
| Dilimlenmiş parafin | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 69019461 | |
| Sodyum iyodat | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 80117214 | |
| Cerrahi aletler | çeşitli ticari markalar mevcuttur | . 121 ° C'de sterilize edin; C, 20 dk. | |
| Transmisyon elektron mikroskobu | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodyum sitrat dihidrat | Şangay Deney Reaktifi Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd | 30188928 | 0.25'lik bir çalışma çözeltisi yapmak için steril PBS'de seyreltin. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30189328 | % 0.1'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için steril PBS'de seyreltin. |
| Paraformaldehit | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 80096618 | |
| Ksilen | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 10023418 |
Kaynaklar
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
- Brandeis, M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
