Yöntem makalesi

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/63271

⸱

28 Aralık 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotlarda, mayoz cinsel üremede genom stabilitesi ve genetik çeşitlilik için gereklidir. Testislerdeki spermatositlerin deneysel analizleri, erkek mayotik bölünmesinde iğ montajı ve kromozom ayrışmasının araştırılması için kritik öneme sahiptir. Fare spermatositi, mekanik mayoz çalışmaları için ideal bir modeldir, ancak spermatositlerin analizi için etkili yöntemler eksiktir. Bu makalede, fare spermatositlerinde kinesin-7 CENP-E'nin in vivo inhibisyonu için pratik ve etkili bir yöntem bildirilmiştir. 3 haftalık farelerde karın ameliyatı yoluyla GSK923295 spesifik bir inhibitörün testiküler enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Ayrıca, burada doku toplama ve fiksasyon, hematoksilin-eozin boyama, immünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu için bir dizi protokol tanımlanmıştır. Burada, erkek mayozunu incelemek için güçlü bir teknik olabilecek abdominal cerrahi ve testis enjeksiyonu yoluyla in vivo inhibisyon modeli sunuyoruz. Ayrıca, CENP-E inhibisyonunun, mayoz I sırasında primer spermatositlerde kromozom yanlış hizalaması ve metafaz durması ile sonuçlandığını gösterdik. İn vivo inhibisyon yöntemimiz, mayozun mekanik çalışmalarını kolaylaştıracak, erkek germ hatlarının genetik modifikasyonları için yararlı bir yöntem olarak hizmet edecek ve gelecekteki klinik uygulamalara ışık tutacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mayoz, ökaryotik organizmalardaki en önemli, oldukça katı, evrimsel korunmuş olaylardan biridir ve gametogenez, cinsel üreme, genom bütünlüğü ve genetik çeşitlilik için gereklidir 1,2,3. Memelilerde, germ hücreleri, tek bir DNA replikasyonu turundan sonra mayoz I ve II olmak üzere iki ardışık hücre bölünmesine uğrar. Mitozdaki kardeş kromatitlerin aksine, kopyalanmış homolog kromozomlar mayoz I 4,5 sırasında eşleşir ve iki yavru hücreye ayrılır. Mayoz II'de, kardeş kromatitler DNA replikasyonu olmadan haploid gametler oluşturmak için ayrılırve ayrılır 6. İş mili montaj kusurları ve kromozom yanlış ayrışması da dahil olmak üzere iki mayotik bölümden herhangi birindeki hatalar, gametlerin kaybına, kısırlığa veya anöploidi sendromlarına neden olabilir 7,8,9.

Biriken çalışmalar, kinesin ailesi motorlarının hem mitotik hem de mayotik hücrelerde kromozom hizalaması ve ayrışması, iğ montajı, sitokinez ve hücre döngüsü ilerlemesinin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Sentomer proteini E), kromozom kongresi, kromozom taşınması ve hizalanması ve mitoz 13,14,15,16,17,18'de iğ montaj kontrol noktasının düzenlenmesi için gerekli olan artı uçlu yönlendirilmiş bir kinetochore motorudur. Mayoz sırasında, spesifik inhibitör tarafından CENP-E inhibisyonu GSK923295 spermatojenik hücrelerde hücre döngüsü durması, kromozom yanlış hizalaması, iğ düzensizliği ve genom instabilitesine yol açar19. CENP-E'nin bölünen spermatositlerin sentromerlerindeki lokalizasyon paternleri ve dinamikleri, CENP-E'nin mayoz I20,21 sırasında sentromerlerin sıralı montajı için kinetochore proteinleri ile etkileşime girdiğini göstermektedir. Oositlerde, kromozom hizalaması ve mayoz I 13,22,23'ün tamamlanması için CENP-E gereklidir. CENP-E'nin antikorları veya morfolino enjeksiyonu, hem fare hem de Drosophila oositlerinde yanlış hizalanmış kromozomlar, anormal kinetochore oryantasyonu ve mayoz I tutuklaması ile sonuçlanır23. CENP-E'nin mitozdaki temel rolleri ile karşılaştırıldığında, CENP-E'nin mayozdaki fonksiyonları ve mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. CENP-E'nin kromozom kongresindeki ayrıntılı mekanizmaları ve erkek mayotik hücrelerde genom stabilitesi hala aydınlatılmamıştır.

Spermatogenez, ardışık spermatogonia proliferasyonu, mayoz ve spermiogenezi içeren karmaşık ve uzun süreli bir fizyoloji sürecidir. Bu nedenle, tüm sürecin memelilerde ve diğer türlerde in vitro olarak çoğaltılması olağanüstü zordur24,25. Pakiten evresinden sonra spermatositlerin diferansiyasyonunu in vitro olarak indüklemek imkansızdır. Erkek mayotik bölünmeleri üzerine yapılan çalışmalar genellikle erken mayotik profaz25,26'nın deneysel analizleri ile sınırlı kalmıştır. Kısa süreli spermatosit kültürü 27,28 ve organ kültürü yöntemleri25 dahil olmak üzere birçok teknolojik çabaya rağmen, erkek mayotik bölünmesini incelemek için çok az etkili yöntem vardır. Ayrıca, esansiyel genlerin genetik olarak silinmesi genellikle gelişimsel arrest ve embriyonik ölümcüllük ile sonuçlanır. Örneğin, CENP-E'den yoksun fare embriyoları implante edilemez ve mayozda CENP-E'nin mekanik çalışmalarında bir engel olan geçmiş implantasyon29'u geliştiremez. Birlikte ele alındığında, erkek mayotik bölünmesini incelemek için pratik ve uygulanabilir bir sistem kurmak, mayoz araştırma alanını büyük ölçüde destekleyebilir.

Küçük hücre geçirgen inhibitörü, hücre bölünmesi ve gelişimsel süreçlerde kinesin motorlarını incelemek için güçlü bir araçtır. GSK923295 allosterik inhibitör, özellikle CENP-E motor alanına bağlanır, ADP'nin (adenosin difosfat) salınımını bloke eder ve son olarak CENP-E ile mikrotübüller arasındaki etkileşimleri stabilize eder30. Bu çalışmada, karın cerrahisi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla in vivo inhibisyonlu fare modeli sunulmuştur. CENP-E inhibisyonu, primer spermatositlerin metafaz I'inde kromozomun yanlış hizalanmasına neden olur. Ayrıca, CENP-E inhibisyonu spermatositlerin mayotik arrestine ve spermatogenezin bozulmasına yol açar. Spermatositlerin analizi için bir dizi protokol tanımlanmıştır ve spermatositlerdeki mayotik iğ mikrotübüllerini, homolog kromozomları ve hücre altı organelleri gözlemlemek için uygulanabilir. İn vivo inhibisyon yöntemimiz mayotik bölünme ve spermatogenez çalışmaları için etkili bir yöntemdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Fujian Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Protokol numarası SYXK 2016-0007). Tüm fare deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir (NIH yayınları sayı 8023, gözden geçirilmiş 1978).

1. GSK923295 aracılı CENP-E inhibisyon fare modellerinin yapımı

  1. Cerrahi aletleri 121 °C'de 30 dakika boyunca sterilize edin. Cerrahi ultra temiz tezgahı 2 saat boyunca ultraviyole-C (UVC) ile ışınlayın. Deneyler için kullanılan 3 haftalık erkek ICR (Kanser Araştırmaları Enstitüsü) farelerini tartın ve gerekli anestezik dozlarını hesaplayın.
  2. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) kombinasyonu uygulayarak fareleri uyuşturun. Fare kornea refleksi, nosiseptif refleks, solunum ve kas tonusunun bir kombinasyonu ile farelerin anestezi derinliğini kontrol edin. Farelerin derin anestezi uygulandığını onaylayın.
    NOT: Ameliyat sırasında termal destek sağlamak için hayvanı bir ısıtma yastığına yerleştirin.
  3. Fare uzuvlarını bağlayın ve balmumu tepsisine sabitleyin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için fare gözlerine bir damla veteriner merhemi yerleştirin. Farenin karın kıllarını alt karın bölgesinden skrotuma deneysel bir hayvan tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin. Ameliyat bölgesini steril bir örtü ile sabitleyin.
  4. Ventral karnı bir Betadine ovma ile dezenfekte edin, ardından% 75 etanol üç kez. Steril bir neşter kullanarak karın boşluğunu açın ve <5 mm'lik bir açıklık açın.
  5. Cildi steril cerrahi kelepçelerle sıkıştırın ve steril bir cımbız kullanarak testisleri bulmak için epididim yağ yastığını steril diseksiyon forsepslerle çekin. Testisi stereoskop altında steril forseps ile sabitleyin ve 10 μL reodyne 30 kullanarak 10 μM'lik son konsantrasyonda seminifer tübüllere yavaşça10 μL GSK923295 enjekte edin. Kontrol grubunun yapımı için, 10 μL% 1 DMSO (dimetil sülfoksit) / PBS (fosfat tamponlu salin) çözeltisi enjekte edin.
    NOT: GSK923295 çözeltisini -80 °C'de 10 mM konsantrasyonda saklayın. 10 μM GSK923295 çözeltisini hazırlamak için 10 μM GSK923295 0,1 μL PBS çözeltisi içinde çözün.
  6. Testisleri steril cerrahi forseps ile yavaşça karın boşluğuna geri itin. Peritonu ve cildi ayrı ayrı iki ila dört dikişle dikiş atarak, 0.1 mm çapındaki dikiş çizgisini kullanarak dikin.
  7. Karın ameliyatından sonra hayvanın arkasına 3 x 3 mm'lik bir yeri kalıcı bir işaretleyici ile etiketleyin, fareyi tekrar besleme kafesine koyun ve yeterli yiyecek ve su ile temiz ve patojensiz bir ortam sağlayın.
  8. Filtrelenmiş hava, sterilize edilmiş yiyecek ve su yoluyla ortamı steril bir durumda tutun. Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvana iyi bakın. Postoperatif analjezi için, 3 gün boyunca her 12 saatte bir deri altından bir doz buprenorfin (0.1 mg / kg) uygulayın. Tamamen iyileşene kadar farenin diğer hayvanların şirketine iade edilmediğinden emin olun.
    NOT: Farelere postoperatif bakım verilir ve gerektiğinde postoperatif ağrıyı azaltmak için% 0.5 lidokain kullanılarak yaraya uygun şekilde lokal anestezi verilir.

2. Hematoksilin-eozin (HE) boyama ve histopatoloji

  1. Karın ameliyatından dört gün sonra, bir CO 2 odasında2 L / dak akış hızında CO2 ile fareleri ötenazi yapın. Servikal çıkık ile ölümü doğrulayıcı bir ötenazi yöntemi olarak doğrulayın. Skrotumu açmak ve testisleri forseps ile çıkarmak için cerrahi makas kullanın. GSK923295 enjeksiyondan 4 gün sonra fare testislerini toplayın ve 12 saat boyunca oda sıcaklığında 30 mL% 10 formaldehit çözeltisine sabitleyin.
  2. Gradyan dehidrasyonu için, numuneyi 1 saat boyunca 40 mL% 70 etanol, 1 saat boyunca 40 mL% 85 etanol, 1 saat boyunca 40 mL% 95 etanol ve 1 saat boyunca 40 mL% 100 etanol olarak sırayla inkübe edin.
  3. Numuneyi 40 dakika boyunca 40 mL ksilen içinde ve daha sonra 65 ° C'de 1 saat boyunca 40 mL parafin içinde inkübe edin. Dokuları gömme kutusunun altına yerleştirin. Erimiş parafini gömme kutusuna ekleyin. Dokuları 6 saat boyunca 4 ° C'de tam katılaşma için soğutun.
  4. Numuneleri ultramikrotomun tutucusuna sabitleyin, numuneler ile bıçak yüzeyi arasındaki açıyı 5-10 ° C'de tutun ve dilim kalınlığını 5 μm'ye ayarlayın. 5 μm kalınlığındaki bölümleri bir ultramikrotom kullanarak hazırlayın, slaytları 40 ° C'de bir su banyosuna yayın ve bölümleri 37 ° C'de 12 saat boyunca bir slayt kurutucusunda kurutun.
  5. Slaytları 40 dakika boyunca 200 mL ksilene, 6 dakika boyunca 200 mL% 100 etanolde, 2 dakika boyunca 200 mL'de% 95 etanolde, 2 dakika boyunca% 90 etanolde 200 mL'de, 2 dakika boyunca% 80 etanolde 200 mL'de ve 2 dakika boyunca% 70 etanolde 200 mL'de inkübe edin, sırasıyla.
  6. Slaytları damıtılmış suda 5 dakika durulayın ve oda sıcaklığında 6 dakika boyunca Mayer'in hematoksilin çözeltisi ile lekeleyin.
    NOT: Mayer'in hematoksilin çözeltisi: 0.011 mol / L hematoksilin,% 6.7 susuz etanol, 0.646 mol / L alüminyum potasyum sülfat ve 0.003 mol / L sodyum iyodat.
  7. Slaytları akan suda 5 dakika durulayın ve 2 dakika boyunca damıtılmış suyla inkübe edin.
  8. Slaytları 3 s boyunca% 1 etanol hidroklorür içinde inkübe edin ve ardından 2 dakika boyunca akan suda durulayın.
  9. Numuneyi 15 sn boyunca% 1 eozin ile lekeleyin ve daha sonra 5 saniye boyunca% 95 etanol, 2 dakika boyunca% 100 etanol ve 40 dakika boyunca ksilen ile inkübe edin.
  10. Kızakları 15 μL nötr sakız ve 24 x 50 mm kapak kayması kullanarak kapatın.

3. İmmünofloresan ve konfokal mikroskopi

  1. İmmünofloresan için fare testislerinin 5 μm kalınlığında parafin bölümlerini toplayın. Slaytları 40 dakika boyunca ksilende, 6 dakika boyunca% 100 etanolde,% 95 etanolde 2 dakikada,% 90 etanolde 2 dakika, 2 dakikada% 80 etanolde ve% 70 etanolde 2 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları damıtılmış suda 5 dakika durulayın ve slaytları 0,01 M PBS ile 5 dakika durulayın.
  2. Slaytları antijen geri alma çözeltisine (0.01 M sitrat tamponu) yerleştirin ve antijen alımı için 4 dakika boyunca düdüklü tencere kullanarak yüksek basınç altında kaynatın. Slaytları doğal olarak oda sıcaklığına soğutun. Damıtılmış suyla iki kez 5 dakika ve PBS ile 5 dakika durulayın.
    NOT: 0,01 M sitrat tamponu (pH 6,0): 2,1 mmol/L sitrik asit, 11,6 mmol/L trisodyum sitrat dihidrat.
  3. Slaytları 10 dakika boyunca% 0.25 TritonX-100 / PBS'nin 500 μL'sinde inkübe ederek hücreleri geçirgenleştirin. Slaytları PBS ile üç kez 5 dakika durulayın.
  4. Antijen blokajı için, numuneleri 300 μL% 3 sığır serum albümini (BSA) / PBST (PBS'de% 0.1 Ara-20) ile 1 saat boyunca inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 16 saat boyunca% 3 BSA/PBST'de birincil antikorlarla inkübe edin. Dokuların kurumasını önlemek için slaytları nemlendirilmiş bir kutuya koyun. Slaytları 30 dakika boyunca doğal olarak oda sıcaklığına ısıtın.
  5. Birincil antikoru atın ve ardından slaytları PBST'de 5 dakika boyunca üç kez durulayın. İkincil antikorları %3 BSA/PBST'de seyreltin. Numuneleri 37 ° C'de 1-2 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin. Numuneleri PBST'de beş kez 5 dakika durulayın.
  6. Çekirdekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 50 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile lekeleyin. Kapak kapağını solmaya karşı montaj ortamıyla monte edin ve kapak kapağını oje ile kapatın.
  7. NA 40x / 0.75 hedefi ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak slaytlardaki floresan sinyallerini gözlemleyin ve kaydedin.

4. Akış sitometrisi

  1. Fare testislerini 6 cm'lik Petri kaplarında toplayın ve cerrahi makas kullanarak testisleri 1 mm3 parçaya bölün.
  2. Testisleri, 37 ° C'de 10 dakika boyunca 1.5 mL santrifüj tüpünde% 1 kollajenaz kullanarak sindirin ve daha sonra spermatojenik hücreleri çökeltmek için numuneleri 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
  3. Süpernatanı atın ve ardından 37 ° C'de 20 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA (Etilen Diamin Tetraasetik Asit) çözeltisi ekleyin ve ardından numuneleri 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
  4. Süpernatanı atın ve daha sonra çökeltilmiş hücreleri 1 mL% 70 soğuk etanol ile 4 ° C'de 8 saatten fazla inkübe edin.
  5. Numuneleri 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin ve ardından hücre tortularını toplayın. Spermatojenik hücreleri 500 μL propidium iyodür (PI) boyama çözeltisi (50 μg / mL PI, 100 μg / mL RNaz A ve% 0.2 Triton X-100) ile 30 dakika boyunca 37 ° C'de lekeleyin.
    NOT: Hücre kümelenmelerini önlemek için santrifüj tüpünü her 5 dakikada bir hafifçe sallayın.
  6. Hücre kalıntılarından kurtulmak için numuneleri 300 örgülü bir ekran kullanarak filtreleyin; Hücreleri bir akış tüpünde toplayın ve 4 ° C'de saklayın.
  7. Bir akış sitometresi kullanarak 488 nm uyarma dalga boyunda floresan sinyallerini ve ışık saçılımını tespit edin. Modfit MFLT32 yazılımını kullanarak DNA içeriğini ve ışık saçılımını analiz edin.

5. İletim elektron mikroskobu

  1. Keskin neşter kullanarak testisleri 1 mm 3 parçaya bölün ve ultrayapı değişikliklerini önlemek için numuneleri 0.1 M PBS (pH 7.2) içinde%3 glutaraldehit-% 1.5 paraformaldehit çözeltisi ile 4 saat boyunca 4 ° C'de hızlı bir şekilde inkübe edin. Numuneleri 0,1 M PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
    NOT: Neşter ve makas keskin olmalı ve yapay sıkma ve çekmeden kaçınmaya çalışmalıdır. Numunelerin işlenmesi fiksasyon sıvısında yapılmalıdır.
  2. Numuneleri 1,5 saat boyunca 4 °C'de %1 ozmik asit-%1,5 potasyum ferrosiyanür çözeltisine sabitleyin. Suyu filtre kağıdı ile kurutun ve numuneleri 5 dakika boyunca 0,1 M PBS ile üç kez durulayın.
  3. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 40 mL% 50 etanol içinde dehidrate edin. Numuneleri 4 °C'de 12 saat boyunca 40 mL'lik %70 etanol doymuş uranyum asetat boyasında, 4 °C'de 10 dakika boyunca 40 mL'lik %90 etanolde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 40 mL'lik %90 etanol-asetonda ve oda sıcaklığında üç kez 10 dakika boyunca 40 mL susuz asetonda inkübe edin.
  4. Numuneleri susuz aseton-epoksi reçine 618 gömme ajanları (v / v = 1: 1) karışımında 1,5 saat boyunca inkübe edin ve daha sonra numuneleri 3 saat boyunca 35 ° C'de epoksi reçine 618 gömme maddelerine gömün.
  5. Reçine polimerizasyonu için, numuneleri epoksi reçine 618 gömme maddelerinde 12 saat boyunca 35 ° C'de, 12 saat boyunca 45 ° C'de ve daha sonra 24 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
  6. Numuneleri ve cam bıçağı takın ve ardından numuneler ile bıçak arasındaki mesafeleri ayarlayın. 90 nm kalınlığındaki ultra ince bölümleri ultra ince bir mikrotom kullanarak hazırlayın. Numuneleri sabit bir hızda dilimleyin ve ardından slaytları nikel bir ağ üzerine yerleştirin. Slaytları oda sıcaklığında bir Petri kabına yerleştirin.
  7. Slaytları 10 dakika boyunca% 2 uranil asetat ile lekeleyin ve ardından numuneleri% 2 kurşun sitrat ile 10 dakika boyunca boyayın. Slaytları damıtılmış suyla durulayın. Slaytları oda sıcaklığında 24 saat kurutun.
  8. Slaytları gözlemleyin ve bir transmisyon elektron mikroskobu kullanarak elektron görüntülerini 70-100 kV'da kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karın cerrahisi ve GSK92329519'un testiküler enjeksiyonu yoluyla fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini başarıyla oluşturduk. Bu yöntemin temel teknik adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. 4 gün boyunca testiküler GSK923295 enjeksiyonundan sonra, testisler daha ileri analizler için toplandı. Kontrol grubunda seminifer tübüllerdeki spermatojenik dalga düzenli ve organize idi (Şekil 2A). Bununla birlikte, GSK923295 gru...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, karın cerrahisi ve GSK923295 mikroenjeksiyonu kullanılarak fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini oluşturduk. Bu çalışmada kullanılan abdominal cerrahi ve testis enjeksiyon yöntemi aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, farelerin yaşı ile sınırlı değildir. Deneyciler testis enjeksiyonunu erken bir aşamada, örneğin 3 haftalık veya daha genç farelerde gerçekleştirebilirler. İkincisi, GSK923295 CENP-E üzerinde spesifik ve mükemmel bir inhibitör etkiye sahiptir. Üçüncüsü, bu yöntemi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fujian Tıp Üniversitesi Hücre İskelet Laboratuvarı'nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi'nden Jun-Jin Lin'e akış sitometrisindeki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi Elektron Mikroskobu Laboratuvarı'nda Ming-Xia Wu ve Lin-Ying Zhou'ya elektron mikroskobundaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi'nden Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke ve Jun Song'a destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 82001608), Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (hibe numarası 2019J05071), Fujian İl Sağlık Teknolojisi Projesi (hibe numarası 2018-1-69), Bilimsel Araştırma Başlangıç Fonu, Fujian Tıp Üniversitesi (hibe numarası 2017XQ1001), Fujian Tıp Üniversitesi üst düzey yetenekler bilimsel araştırma başlangıç fonu projesi (hibe numarası XRCZX2017025) ve Araştırma projesi Çin tıbbı lisansüstü öğrencilerinin çevrimiçi eğitim ve öğretimi (hibe numarası B-YXC20200202-06).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTAGibco25200056
1 ml ŞırıngaÇeşitli ticari markalar mevcutturSteril.
1.5 mL Santrifüj tüpüAxygenMCT-150-C
50 mL Santrifüj TüpüCorning430828
6 cm Petri kabıCorning430166
%95 EtanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009164
tübülin tavşan poliklonal antikoruBeyotimeAF0001İmmünofloresan tahlilleri için. 1:100'de kullanın.
tavşan anti-Histon H3 (fosfo S10) monoklonal antikorAbcamab267372İmmünofloresan testleri için. 1:100'de kullanın.
tavşan anti-TUBA4A poliklonal antikoruSangon BiotechD110022İmmünofloresan testleri için. 1:100'de kullanın.
Anti-SYCP3 tavşan monoklonal antikoruAbcamab175191İmmünofloresan testleri için. 1:100'de kullanın.
Yapışma mikroskobu slaytlarıCITOTEST188105
Alexa fluor 488 etiketli keçi anti-tavşan antikoruBeyotimeA0423Sencodary antikor. 1:500'de kullanın.
Alüminyum potasyum sülfatSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10001060
Susuz etanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd100092690
Solmaya karşı dayanıklı montaj ortamıBeyotimeP0131Floresan sinyallerin fotoblebasyonunu önleyin.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Sığır Serumu AlbüminiSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd69003435
SantrifüjEppendorf5424BK745380
Kloral hidratSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd80037516
Sitrik asitŞangay Deney Reaktifi Co, Ltd122670
KollajenazSangon BiotechA004194-0100
LamelCITOTEST10212020C20 & kez; 20 mm. Kalınlık 0.13-0.16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
Boya kdv'si
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoksilen, susuzSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd71020784
ICR fareShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J yazılımıUlusal Sağlık Enstitülerihttps://imagej.nih.gov/ij/Floresan görüntü analizi.
Leica ultramikrotomLeica
Leica EM UC-7 ultramikrotomLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Yazılım EviAkış sitometrisi sonuçlarının analizi için.
OjeÇeşitli ticari markalar mevcuttur
Nötr sakızSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd,
Nikon Ti-S2 mikroskobuNikonTi-S2
Pikrik asitSinopharm Chemical Reagent Co., LtdJ60807
RheodyneSangon Biotech, F519160-000110 &; l reodyne
Dilimlenmiş parafinSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd69019461
Sodyum iyodatSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd80117214
Cerrahi aletlerçeşitli ticari markalar mevcuttur. 121 ° C'de sterilize edin; C, 20 dk.
Transmisyon elektron mikroskobuFEITecnai G2
Trisodyum sitrat dihidratŞangay Deney Reaktifi Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd301889280.25'lik bir çalışma çözeltisi yapmak için steril PBS'de seyreltin.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30189328% 0.1'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için steril PBS'de seyreltin.
ParaformaldehitSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd80096618
KsilenSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd10023418
Eosin Y, alkolde çözünür Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 71014460 Ether Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 10009318 91347802 çeşitli ticari markalar - sulu çözelti Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010018 : , 10004160 , , , , , , , Karın cerrahisi için %

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25(2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417(2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6(2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636(2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453(2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431(2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961(2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CENP E nhibisyonuFare SpermatositleriAbdominal CerrahiTestik ler Enjeksiyonmm nofloresan BoyamaKromozom Ayr lmasiplikleri Olu umuTransmisyon Elektron Mikroskobu

İlgili makaleler