Domuz Periferik Kanından Kan Büyümesi Endotel Hücrelerinin (BOEC) Karakterizasyonu

Endotel oldukça karmaşık, dinamik bir yapıdır ve vasküler duvarın hayati bir bileşenidir. Dolaşımdaki kan ve çevresindeki dokular arasında fiziksel bir arayüz sağlamak için kan damarlarının iç yüzeyini hizalar. Bu heterojen yapının anjiyogenez, inflamasyon, vazoregülasyon ve hemostaz gibi çeşitli işlevleri yerine getirdiği bilinmektedir 1,2,3,4. İnsan göbek damarı endotel hücreleri, endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmek için yaygın olarak çalışılan bir hücre tipidir. Bununla birlikte, hastaya özgü parti değişkenliği, tutarsız fenotip ve minimum ayrılma verimliliği, tüm bu özellikleri geliştirebilecek bir hücre kaynağının belirlenmesi ihtiyacını ortaya koymaktadır⁵.

Primer endotel hücrelerinin homojen bir popülasyonunu elde etmek teknik olarak zor olabilir ve primer endotel hücreleri yüksek proliferatif kapasiteye sahip değildir⁶. Bu nedenle, vasküler rejenerasyonu incelemek ve patofizyolojik süreçleri değerlendirmek için, çeşitli gruplar periferik kandan türetilen farklı endotel hücreleri tiplerini elde etmeye ve değerlendirmeye çalışmışlardır, örneğin endotel progenitör hücreleri (EPC'ler) veya kan büyümesi endotel hücreleri (BOEC'ler)6,7,8,9 . İğ şeklindeki erken EPC'ler hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) kaynaklanır ve olgun endotel hücreleri üretmek için sınırlı büyüme potansiyeline ve sınırlı anjiyojenik yeteneğe sahiptir. Ayrıca, enflamatuar monositlere çok benzerler. Ek olarak, işlevsel, çoğalan, olgun endotel hücrelerine daha da farklılaşma kapasiteleri hala tartışmalıdır 6,7,9,10. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) sürekli kültürü, geç büyüme EPC'leri, BOEC'ler veya endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFC'ler) olarak bilinen ikincil bir hücre popülasyonuna yol açabilir6,7,9,10. Medina ve ark. 2018'de, EPC'lerin sınırlamalarını, isimlendirmelerinin belirsizliğini ve EPC'ler¹¹ altında sürekli olarak gruplandırılmış birçok farklı hücre tipiyle genel bir uyum eksikliğini kabul etmiştir. Buna karşılık, BOEC'ler vasküler onarım, sağlık ve hastalık ve hücre tedavisindeki rolleri ile tanınmıştır. Bu hücrelerin daha fazla araştırılması ve terapötik kullanımı, bu hücre tiplerini dolaşımdaki progenitör hücrelerden tutarlı bir şekilde türetmek için protokollere dayanacaktır.

BOEC'ler gibi primer hücreler, yüksek proliferatif olgun endotel hücreleri elde etmek için bir vekil olarak kullanılabilir⁶. BOEC'ler fenotipik olarak erken EPC'lerden farklıdır ve parke taşı morfolojisi ve aderens kavşaklarının ve kaveoların ekspresyonu gibi tipik endotel özellikleri sergiler¹². Hebbel ve ark.13,14,15 tarafından yapılan gen profillemesi^, BOEC'lerin veya ECFC'lerin mikrovasküler ve büyük damar oluşumunu teşvik ettikleri için gerçek endotel hücreleri olduğunu bulmuştur. Bu nedenle, BOEC'ler patofizyolojik süreçleri ve genetik çeşitliliği değerlendirmek için bir araç olarak kullanılabilir¹⁶. Ayrıca vasküler rejenerasyon için hücre tedavisi için mükemmel bir hücre kaynağı olarak kabul edilirler¹⁷. Bu nedenle, bu yüksek proliferatif hücreleri tutarlı bir şekilde türetmek için standartlaştırılmış bir protokol gereklidir.

BOEC'ler insan patofizyolojik ve genetik varyasyonunu incelemek için güçlü bir araç sağlarken, daha homojen bir BOEC kaynağı daha sağlam ve güvenilir deneysel ve terapötik sonuçlar sağlayabilir. Üstün homojenlik, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanlardan elde edilen ksenojenik hücre kaynakları kullanılarak elde edilebilir¹⁸. Ksenojenik hücre kaynakları konakçı immün yanıtını ortaya çıkarmaya eğilimli olsa da, immünomodülasyon stratejileri, hücreler de dahil olmak üzere immünouyumlu hayvanlar ve hayvansal ürünler üretmek amacıyla geliştirilmektedir. Özellikle domuzlar, bol miktarda periferik kan kaynağıdır ve insanlarla anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle tıbbi cihazları ve diğer terapileri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, bu çalışma, domuz periferik kanından yüksek proliferatif BOEC'lerin izolasyonu ve genişlemesi için protokolü rafine etmektedir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, nispeten küçük bir kan hacminden çok sayıda BOEC elde etmek için basit ve güvenilir bir yöntemdir. Kültürler, tek bir kan örneğinden milyonlarca hücre üretmek için birkaç pasajla genişletilebilir.

Tüm hayvan çalışmaları, Wisconsin Tıp Fakültesi ve Mayo Clinic'teki ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Bu çalışmada Yorkshire/Landrace/Duroc çapraz evcil domuzları (Sus domesticus), 40-80 kg, 3-6 aylık erkek ve dişi kullanılmıştır.

1. Domuz periferik kanının toplanması

1. Malzemeleri hazırlayın.
   1. Heparin çözeltisini steril salin içinde 100 U/mL'ye seyreltin.
   2. İki adet 50 mL konik tüpün ve iki adet 60 mL şırınganın her birine 3-4 mL heparin çözeltisi ekleyin.
   3. Seyreltilmemiş heparin çözeltisini (1.000 U/mL) bir uzatma tüpüne çekin.
   4. Heparin dolgulu uzatma tüpünün bir ucuna 19 G'lık bir iğne ve diğer ucuna heparin içeren 60 mL'lik bir şırınga bağlayın.
2. Bir domuzu Kurumsal politikalara göre uyuşturmak
   1. Anesteziyi indüklemek için IM atropin (0.05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) ve ksilazin (2 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.
      NOT: Hayvan bilinçsiz olduğunda ve mandibuler kaslar sert olmadığında yeterli anestezi sağlanır.
   2. Hayvanı sırtüstü pozisyonda koyun ve stabilite sağlamak için her iki tarafa da yuvarlanmış havlular yerleştirin.
   3. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik bir merhem sürün.
   4. Anestezi sırasında battaniyeler, ısıtma pedleri ve / veya ısıtmalı prosedür masası dahil olmak üzere termal destek sağlayın.
3. Femoral kasık bölgesini betadin ovma çözeltisi ile temizleyin.
4. Femoral veni veya arteri 19 G iğne ile delin ve yavaşça (~ 1-2 mL / s) şırıngaya 50 mL kan çekin.
   NOT: Çok hızlı çizim yapmak hücrelere zarar verebilir.
5. İğneyi yerinde bırakarak, hemen uzatma tüpünü bükün ve 60 mL şırınganın bağlantısını kesin
6. Kanı yavaşça heparin içeren 50 mL konik bir tüpe aktarın.
7. 50 mL konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.
8. Kalan heparin içeren 60 mL şırıngayı uzatma tüpüne bağlayın, uzatma tüpünü açın ve yavaşça şırıngaya 50 mL daha kan çekin.
9. İğneyi derhal arterden veya damardan çıkarın ve kalan kanı uzatma tüpünden yavaşça şırıngaya çekin.
10. 60 mL şırıngayı uzatma tüpünden ayırın ve kanı yavaşça kalan heparin içeren 50 mL konik tüpe aktarın.
11. 50 mL konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.
12. Domuzun femoral kasık bölgesine basınç hemostazı uygulayın.
13. Domuzu Kurumsal politikalara göre kurtarın. Sternal yatmayı sürdürmek ve düzenli konut / köpek kulübesi alanına geri dönmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı sürekli izleyin.

2. Mononükleer hücrelerin izolasyonu

1. Kanı 1: 1 oranında fosfat tamponlu salin (PBS) ile dört adet 50 mL konik tüpte seyreltin.
   NOT: Bu çalışmanın, hücre kültürünün kirlenmesini önlemek için aseptik bir teknik kullanılarak bir hücre kültürü başlığında yapılması gerekir.
2. Sekiz adet 50 mL konik tüpe 25 mL oda sıcaklığında kullanıma hazır yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin.
3. Çok yavaş pipet, tüpü pipet ucuna keskin bir açıyla tutarak 50 mL konik tüp içeren her yoğunluk gradyanı çözeltisinin iç kısmı boyunca 25 mL kan/salin çözeltisi haline getirin.
   NOT: Kan çözeltisi, yoğunluk gradyanı çözeltisinin üzerine nazikçe katman oluşturmalı ve iyi tanımlanmış bir arayüz sağlamalıdır.
4. Tüpleri 560 x g ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
   NOT: En iyi sonuçlar için, mümkünse santrifüj frenini devre dışı bırakın.
5. Her tüpten buffy kaplamayı (yoğunluk gradyanı çözeltisinin üstünde ve berrak plazmanın altında bulunan mononükleer hücrelerin bulutlu tabakası) dikkatlice toplamak ve iki yeni 50 mL konik tüpe eşit olarak dağıtmak için ince bir pipet kullanın. Tüpleri içeren yoğunluk gradyanı çözeltisini atın.
   NOT: Yoğunluk gradyanı çözeltisinin ve plazmanın mümkün olduğunca azını toplarken buffy katın mümkün olduğunca fazlasını toplayın.

3. Hücrelerin yıkanması ve kaplanması

1. 6 delikli bir plakayı fibronektin ile kaplayın.
   1. Steril suda 1 mg / mL'ye seyrelterek insan plazma fibronektininin stok çözeltisini yapın. Aliquotları -20 °C'de saklayın.
   2. 3 mL PBS'de 600 μL fibronektin stok çözeltisini seyrelterek 3.6 mL çalışan bir fibronektin çözeltisi yapın.
   3. 600 μL fibronektin çalışma çözeltisini 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın.
   4. Fibronektinin kuyucukları kaplaması için 30 dakika bekleyin ve çözeltiyi her bir kuyucuktan nazikçe aspire edin.
2. Fibronektinin kaplanmasını beklerken, mononükleer hücreleri yıkayın
   1. Tüpleri 45 mL'ye kadar PBS ile doldurun
   2. Düşük frenle 560 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.
   3. Her hücre peletini 25 mL PBS'de yeniden askıya alın.
   4. İkinci kez yıkamak için tekrarlayın.
3. Her hücre peletini 5 mL PBS içinde yeniden askıya alın ve her tüpe 15 mL% 0.8 amonyum klorür çözeltisi ekleyin.
   NOT: Bu adım, kalan kırmızı kan hücrelerini lize etmektir.
4. 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
5. Tüpleri PBS ile doldurarak hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın ve düşük frenle 560 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.
6. Her hücre peletini 25 mL PBS'de tekrar askıya alın ve ikinci kez yıkamak için tekrarlayın.
7. Her hücre peletini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10.000 U/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amfoterisin içeren 1x antibiyotik/antimikotik solüsyon ile desteklenmiş 6 mL EGM-2 kültür ortamında yeniden askıya alın.
   NOT: EGM-2 kültür besiyeri, 200 μL hidrokortizon, 2 mL insan fibroblast büyüme faktörü (hFGF-B), 500 μL vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), 500 μL insülin benzeri büyüme faktörünün rekombinant analoğu (R₃ IGF-1), 500 μL askorbik asit, 500 μL insan epidermal büyüme faktörü (hEGF) ile desteklenmiş EBM-2 kültür ortamından oluşur, 500 mL başına 500 μL gentamisin/amfoterisin ve 500 μL heparin.
8. Hücre süspansiyonunun 2 mL'sini fibronektin kaplı 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın.
   NOT: Amaç, oluşacak endotel kolonilerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğunca çok hücre tohumlamaktır.

4. Hücre kültürü

1. Hücreleri 37 ° C,% 5 CO₂ ve% 100 nemde inkübe edin.
2. Ertesi gün, her bir kuyucuğa yavaşça 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.
   NOT: Fibronektin kaplamaya gevşek bir şekilde yapışan hücreleri rahatsız etmemek için nazik olmak önemlidir.
3. Ertesi gün, her bir kuyudan 1,5 mL kültür ortamını nazikçe aspire ederek ve 1,5 mL taze kültür ortamı ile değiştirerek yarım kültür ortamı değişikliği gerçekleştirin.
4. Önümüzdeki 5 günün her birinde, her bir kuyucuk için nazikçe tam bir kültür ortamı değişikliği yapın (kuyu başına 2 mL taze kültür ortamı).
5. Bundan sonra, kültür ortamını haftada üç kez yavaşça değiştirin.
6. Hücre kültürlerini düşük güçlü (4x objektif) ışık mikroskobu altında düzenli olarak görselleştirin.
   NOT: Yapışkan kan büyümesi endotel hücresi (BOEC) kolonileri, kaplamadan 7-10 gün sonra kuyucuklarda görünmeye başlayacaktır. Yapışkan olmayan hücre tipleri orta değişikliklerle atılacak ve diğer yapışkan hücre tipleri BOEC kolonileri büyüdükçe yavaş yavaş dağılacaktır.
7. BOEC'leri fibronektin kaplı bir T-75 şişesine ~% 70 -% 80 birleştiğinde geçirin ve haftada üç kez kültür ortamını değiştirmeye devam edin.
   NOT: Tohumlama yoğunluğu, kolonilerin bunun yerine bir T25 şişesine geçirilmesiyle kontrol edilebilir. Sonraki pasajlar fibronektin kaplama gerektirmez ve kültür ortamı değişiklikleri haftada iki kez azaltılabilir.
8. 1-3 pasajlarındaki hücreler deneyler için kullanılabilir veya dondurucu bir ortama aktarılabilir ve ileride kullanılmak üzere sıvı azotta saklanabilir.

Kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi, kültürün başlangıcından BOEC kolonileri gözlenene kadar gözlendi (Şekil 1). Daha küçük bir yapışkan hücre popülasyonu kültür kaplarına yapışmaya ve büyümeye başlarken, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamı değişiklikleriyle uzaklaştırıldı (Şekil 1B). Koloniler ilk olarak 6. günde, merkezi bir noktadan radyal olarak dışa doğru çoğalan endotel benzeri hücrelerin bir koleksiyonu olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 1D). Kültür ilerledikçe, hücre kolonileri daha yoğun hale geldi ve olgun endotel hücrelerine benzer bir parke taşı morfolojisi sergiledi (Şekil 1F). Tipik endotelyal parke taşı morfolojisi, ışık mikroskobu kullanılarak BOEC'lerin kolay bir ön tanımlanmasını sağlar.

Endotel hücre kolonileri tipik olarak 10-14 günlük kültürde geçmeye hazırdır. Şu anda, 6 delikli plaka tipik olarak% 93 -% 98 canlılık yüzdesine sahip ~ 1 milyon hücre üretecektir. İlk geçiş sırasında, endotel hücreleri bir T75 şişesinde ~ 6-10 milyon hücre üretmek için genişleyecektir.

BOEC'lerin morfogenezini değerlendirmek için, bazal membran matrisi (örneğin, Matrigel), 10 μL / kuyuda 15 kuyucuklu anjiyogenez plakası üzerine kaplandı ve polimerizasyona izin vermek için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Pasaj 2 hücreleri bazal membran matris kaplı plakalar üzerine ekildi ve 14 saat ve 24 saat noktalarında görüntülendi. Kuyu başına yaklaşık 3.500 hücrelik bir yoğunluk, bir ağ ve tüp benzeri yapılar oluşturabildi. Tüp oluşumu, serum serbest ortamı için 14 saat içinde (FBS hariç tamamlayıcılarla EGM-2) ve tam büyüme ortamı için 24 saat içinde (FBS içeren takviyelerle EGM-2) fark edildi. FBS'nin eklenmesi, endotel hücresine özgü büyüme faktörlerini (örneğin, VEGF) seyreltmiş ve tüp oluşum sürecinin gecikmesine neden olan diğer sinyal faktörlerini ortaya çıkarmış olabilir. Serumsuz ortamda (Şekil 2A,B) ve tam büyüme ortamında (Şekil 2C,D) tüp oluşumunu görüntülemek için 2D faz-kontrast mikroskobu kullanıldı. Her iki ortam koşullarındaki hücreler morfolojik farklılaşmaya uğradı ve hızla kılcal tüp benzeri yapıların geniş ağlarına organize oldu. Bu yapılar in vivo kılcal ağlara benzeyen organize hücresel kordonlardan oluşuyordu. Ayrıca, 20x büyütmedeki mikrograflar, endotel hücrelerinin karmaşık çok hücreli organizasyonunu ve morfolojik farklılaşmalarını ayrıntılı olarak göstermektedir. Medya koşulları arasında morfolojik farklılık gözlenmedi. Kılcal tüp benzeri yapıların geniş ağı, kültürlenmiş hücrelerin olgun ve fonksiyonel endotel hücrelerine farklılaşmasını güçlü bir şekilde göstermektedir.

BOEC'ler ayrıca olgun endotel hücre belirteci CD31 veya trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM1) ekspresyonu ile karakterize edildi (Şekil 3A, B). BOEC'ler CD31'in tekdüze ekspresyonunu gösterdi. Ayrıca, akış sitometri analizi, PBMC'lerin pozitif kontrol grubuna kıyasla monosit belirteci CD14 için hücreler negatife boyandığı için EPC'lerin yokluğunu doğruladı (Şekil 3C, D).

Resim 1: Fenotip ışık mikroskobu görüntüleri. Kültürlenmiş BOEC'lerin ışık mikroskobu görüntüleri, ilk geçişten sonra (A) gün 0, (B) gün 2, (C) gün 4, (D) gün 6, (E) gün 8 ve (F) üzerinde 10x büyütmede gözlendi. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Geçiş 2 BOEC'lerinin morfolojik farklılaşması ve organizasyonu. Morfolojik farklılaşma ve pasaj 2 BOEC'lerin kılcal tüp benzeri yapılara organizasyonu, serumsuz ortam için 14 saat içinde ve tam büyüme ortamı için 24 saat içinde bazal membran matrisinde fark edildi. (A) 4x'te serumsuz ortam, (B) 20x'te serumsuz ortam, (C) 4x'te tam büyüme ortamı ve (D) 20x'te tam büyüme ortamı. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: BOEC'lerin CD31 ve CD14 ile karakterizasyonu. (A) Passage 2-3 BOEC'ler yeşil renkte görülen anti-CD31-FITC antikoru ve (B) karşılık gelen faz-kontrast mikroskopi görüntüleri kullanılarak PECAM1 için boyandı. Hücreler süspansiyonda boyandı ve süspansiyon mikroskop slaydında görüntülendi. Ölçek çubukları: 200 μm. (C) CD14-AF700 antikoru ile BOEC'lerin (D) pozitif kontrol periferik kan mononükleer hücrelerine (PBMC'ler) kıyasla akış sitometri analizi. Pozitif CD14 boyaması mavi renkte, lekesiz hücreler ise kırmızı renkte gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.