Yöntem makalesi

Megakaryopoezi Keşfetmek için In Vitro ve In Vivo Yöntemler

702 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63286

⸱

17 Kasım 2021

 ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

Bu makalede

Özet

TARTIŞILAN MAKALELER:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. Leukodepletion, megakaryosit farklılaşmasını ve trombosit oluşumunu incelemek için bir hücre kaynağı olarak türetilmiş CD34+ hücrelerini filtreler. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Fare megakaryosit progenitörlerinin izolasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Hücre olgunlaşmasını iyileştirmek ve sertlik ve hapsedilmenin etkisini incelemek için 3D metilselüloz bazlı hidrojelde megakaryosit kültürü. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak murin megakaryopoezinin yerinde araştırılması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171) E62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. Fare taze kemik iliği eksplantlarının proplatelet oluşum dinamikleri. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Fare kafatası kemik iliğindeki megakaryositlerin ve proplateletlerin in vivo iki fotonlu görüntülemesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi: JoVE. (171), E62515 (2021)

Editöryal

Trombositler, kemik iliğindeki (BM) megakaryositlerden (MK'ler) türetilen hemostaz için gerekli olan küçük, anükleat kan hücreleridir. Hematopoietik kök hücrelerden farklılaşmaları sırasında MK'ler, poliploidizasyon ve sitoplazmik olgunlaşmayı içeren karmaşık bir farklılaşma ve olgunlaşma sürecinde dev hücrelere dönüşür. Gelişimin son aşamasında, MK'ler endotel hücreleri ile temas halindeyken, olgun aşamalarına ulaşırlar ve proplatelet adı verilen uzun sitoplazmik uzantıları kan damarlarına uzatırlar, bunlar daha sonra kan dolaşımındatrombositlere yol açmak için parçalanır 1,2. MK olgunlaşmasını ve transendotelyal proplatelet oluşumunu düzenleyen mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu koleksiyonun amacı, MK'lerin biyolojisinin in vitro ve in vivo olarak daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacak tamamlayıcı yöntemleri bir araya getirmektir.

MK'lerin in vitro genişlemesi ve farklılaşması, trombosit biyogenezinin altında yatan mekanizmaları incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Pongerard ve arkadaşlarının protokolünde yazarlar, MK'lerin insan CD34+ hematopoietik progenitörlerinden farklılaşması için standartlaştırılmış bir kültür protokolü tanımlamaktadır. Özellikle kan merkezlerinde bulunan lökosit filtrelerinin CD34+ hücrelerinin toplanması için istisnai bir kaynak olduğunu vurguluyorlar. Makaleleri, CD34+ hücrelerinin nasıl çıkarılacağı, saflıklarının nasıl değerlendirileceği ve tohumlama yoğunluklarının önemi hakkında birkaç temel kılavuz içermektedir. Yazarlar ayrıca fonksiyonel trombositleri verimli bir şekilde serbest bırakmak için art arda beş kez kalibre edilmiş bir pipetleme yöntemi önermektedir. Bu yöntemin ilginç uygulamaları, farmakolojik bileşikleri değerlendirme veya bir CRISPR-Cas9 genom düzenleme yöntemi 3,4 kullanarak CD34+ hücrelerini genetik olarak manipüle etme olasılığıdır. Fare çalışmaları için, Kimmerlin ve ark. MK progenitörlerini moleküler ve hücresel tahlillerle uyumlu yeterli sayıda saflaştırmak için bir hücre sıralama stratejisi sunar. Yazarlar, iliak krestin çok sayıda hematopoietik progenitör içeren bir kemik iliği kaynağı olarak kullanılmasının ve hücre yüzeyi belirteçlerinin bir kombinasyonunu kullanarak hücre sınıflandırmasından önce istenmeyen hücrelerin iki aşamalı manyetik tükenmesinin gerçekleştirilmesinin yararlarını tartışmaktadır. Bu yöntemin önemli bir avantajı, örneğin hematopoietik progenitörlerin hiyerarşisini ve farklılaşmasını inceleyen araştırmacıların ilgisini çekebilecek, yüksek oranda saflaştırılmış MK progenitörleri elde etmek için gereken hayvan sayısındaki azalmadır. Bu bağlamda, Boscher ve ark. in vivo ortamı daha iyi taklit etmek için %2 metilselülozdan oluşan bir 3B ortamda progenitörleri büyütmek için bir yöntem tanımlayın. Aslında, bu yazarlar daha önce bir 3D hidrojel içinde büyütülen MK'lerin, sıvı bir ortamda yetiştirilenlere kıyasla daha büyük bir olgunlaşma durumuna ve daha fazla progenitör oluşturma yeteneğine ulaştığını göstermişlerdi5. Bu protokolde, optimal orta sertliği elde etmek için uygun metilselüloz hacmi, her deney koşulunda eşdeğer olması gereken hücre sayısı ve kontaminasyon riski gibi kritik adımlar vurgulanmıştır. Olgunlaşma seviyesinin fonksiyonel olarak doğrulanması için yazarlar, jel kültürlenmiş hücrelerin kültürün üçüncü gününde sıvı ortamda nasıl yeniden süspanse edileceğini ve hücrelerin immün boyama, akış sitometrisi veya elektron mikroskobu ile gelecekteki analizler için nasıl sabitleneceğini açıklar. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), MK'lerin yüksek çözünürlüklü üst yapısını sağlamak için tercih edilen görüntüleme yaklaşımıdır. Burada, Scandola ve ark. MK'lerin doğal BM ortamlarındaki üst yapısını analiz etmek ve hücre yoğunluklarını ölçmek ve farklı olgunlaşma aşamalarını puanlamak için bir protokol paylaşırlar. Yazarlar, MK'ler sinüzoidal duvarla etkileşime girdiğinde meydana gelen hücresel olayları analiz etmek için TEM'i kullanırlar, örneğin endotelyumanüfuz eden kısa invaziv podozom benzeri çıkıntıları 6. Yöntemin bir sınırlaması, bu olgunlaşmamış hücrelerin spesifik ultrastrüktürel özelliklerinin olmaması nedeniyle MK etkileşiminin ilk aşamasının analiz edilememesidir. Belirtildiği gibi, bu görüntüleme yaklaşımı, tek bir fare ile birden fazla çalışma yapılmasına izin veren küçük BM örnekleri kullanma avantajına sahiptir. Örnek olarak, diğer kemik iliği örnekleri, bu koleksiyonda Guinard ve arkadaşları tarafından sunulan kemik iliği eksplant tekniği için kullanılabilir. Bu yöntemin gücü, BM'de gelişen MK'lerin kullanılmasında yatmaktadır, böylece kültürde hücre farklılaşması artefaktlarından kaynaklanan herhangi bir potansiyel yanlış yorumlamayı önler. Gerçekten de, bu daha önce MK kısıtlı MYH9 inaktivasyonu olan farelerde belgelenmiştir ve burada farklı sonuçlar bulunmuştur laboratuvar ortamında ve ex vivo7. Yazarlar ayrıca bu yaklaşımın basit, tekrarlanabilir ve hızlı doğasını vurgulamaktadır. Protokollerinin ilginç bir notu, proplateletleri genişleten MK'lerin izlenmesini/miktarının belirlenmesini kolaylaştırmak için navigasyon yazılımı ile donatılmış mikroskopları kullanma yeteneğidir. Explant modelinin tamamlayıcı bir yöntemi, fare kafatasındaki MK'lerin iki fotonlu görüntülenmesidir. Bu tekniğin benzersizliği, kemik iliğindeki floresan etiketli MK'lerin dinamik davranışını in vivo olarak inceleme ve proplatelet uzantısını görselleştirme yeteneğidir. Bu protokol, sınırlı cerrahi müdahalelerle minimal invaziv olma avantajına sahiptir, böylece proplatelet oluşumunu etkilediği bildirilen inflamatuar reaksiyonlardan kaçınır. Bornert ve ark. Bu yöntemin bir sınırlaması, kemiğin yoğunluğu nedeniyle görüntülenebilen dar derinliktir ve bu da daha genç farelerin kullanımını zorunlu kılar. Bu teknik, in vivo trombosit oluşumunda ilgilenilen genlerin rolünü incelemek için genetiği değiştirilmiş farelere uygulanabilir. Örneğin, yazarlar bu tekniği, proplateletlerin uzamasında mikrotübüllerin rolünün in vitro ve in vivo koşullar arasında farklılık gösterdiğini göstermek için kullanmışlardır8.

Anormal MK gelişimi ve trombosit üretimi, sırasıyla trombositopeni veya trombositemiye yol açarak kanama veya tromboz riskini artırabilir. Trombosit biyogenezini yöneten moleküler mekanizmaları incelemeye yönelik devam eden çabalar, trombositopeni ve trombositemi tedavisi için yeni stratejiler geliştirme kapasitemizi artıracaktır. Transfüzyon araştırmaları alanında, bu çabalar, seçilmiş durumlarda transfüzyon alternatifi olarak kültürlenmiş trombositlerin üretilmesinin temelini oluşturacaktır9.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) aracılığıyla Avrupa Birliği ve H.d.S'ye ANR-17-CE14-Megaplatprod ve C.L.'ye ANR-18-CE14-PlatForMechanics tarafından desteklenmiştir.

Kaynaklar

  1. Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
  2. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  3. Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
  4. Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
  5. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  6. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
  7. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  8. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
  9. Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Megakaryocyte DifferentiationPlatelet FormationCD34+ CellsMouse Megakaryocyte Progenitors3D Methylcellulose-based HydrogelCell MaturationMurine MegakaryopoiesisTransmission Electron MicroscopyProplatelet Formation DynamicsTwo-photon ImagingBone Marrow Explants
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.