Yöntem makalesi

Primer Siliyer Diskinezinin Birinci Basamak Tanısı için Yüksek Hızlı Video Mikroskopi Analizi

DOI:

10.3791/63292

⸱

19 Ocak 2022

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek hızlı video mikroskopi analizi, gerçekleştirilmesi nispeten kolay, hızlı, uygun maliyetli ve deneyimli ellerde, primer siliyer diskinezinin birinci basamak teşhisi için oldukça güvenilir bir araçtır ve ciddi akciğer hastalıklarının teşhisi ve tedavisinde yer alan her merkezde mevcut olmalıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer siliyer diskinezi (PKD), ağırlıklı olarak otozomal resesif geçişli kalıtsal bir konjenital hastalıktır. Bozukluk, kirpiklerin hareketinde bozulmaya neden olur ve mukosiliyer klirensin (MCC) ciddi şekilde bozulmasına neden olur. Teşhis edilmezse veya çok geç teşhis edilirse, durum bronşektazi gelişimine ve daha sonraki yaşamda akciğerlerde ciddi hasara yol açar. PCD'yi teşhis etme yöntemlerinin çoğu zaman alıcıdır ve bunları kurmak için kapsamlı ekonomik kaynaklar gerektirir. Yüksek hızlı video mikroskopi analizi (HSVMA), canlı solunum hücrelerini in vitro kirpikleri yenerek görselleştirmek ve analiz etmek için tek tanı aracıdır. Hızlı, uygun maliyetli ve deneyimli ellerde PCD için bir teşhis aracı olarak çok güvenilirdir. Ek olarak, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gibi klasik tanısal önlemler, morfolojik değişiklikler olmadığı için bazı mutasyonlar için geçerli değildir.

Bu yazıda solunum epitel hücrelerinin toplanması süreci, numunenin daha fazla hazırlanması ve HSVMA süreci açıklanmaktadır. Ayrıca, fırçalanmış hücrelerin, bir kliniğin HSVMA'yı gerçekleştirecek ekipmana sahip olmadığı durumlarda, depolama ve araştırma alanına taşınması için besleyici bir ortamda tutarak nasıl başarılı bir şekilde zarar görmeden ve dövülmeden tutulabileceğini de açıklıyoruz. Ayrıca, TEM tanısı konamayan dynein kolu ağır zincir 11 geninde (DNAH11) mutasyonu olan hastalardan patolojik dayak paternleri içeren videolar da gösterilmiştir; üst solunum yollarının enfeksiyonu nedeniyle sonuçsuz bir HSVMA'nın yanı sıra kırmızı kan hücrelerinin üst üste binmesiyle başarısız bir fırçalamanın sonucu. Bu makalede, pulmonoloji hastaları ve nadir görülen akciğer hastalıkları ile ilgilenen her birimi, PCD için günlük rutin teşhislerinin bir parçası olarak HSVMA gerçekleştirmeye veya örnekleri HSVMA gerçekleştirme konusunda uzmanlaşmış bir merkeze göndermeye teşvik etmek istiyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer siliyer diskinezi (PKD), kirpiklerin dövülme hareketinde bozukluklara neden olan nadir, kalıtsal bir genetik bozukluktur. Teşhis edilmezse, MCC'nin ciddi şekilde bozulması nedeniyle daha sonraki yaşamda ciddi akciğer hasarına yol açar. Geçmişte, prevalansının 1: 4.000 ila 50.000 arasında olduğu tahmin edilmektedir. Sürekli olarak gelişen teşhis ve durumun artan farkındalığı nedeniyle, PCD prevalansı ile ilgili güncellemeler, çok daha yaygın olabileceğini ve muhtemelen 1.2yerine 1: 4.000 ila 20.000 aralığında olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, PCD'li hastalar hala az teşhis edilir veya çok geç teşhis edilir 1,3. Bu nedenle, konjenital situs inversus ve/veya heterotaksi veya perinatal rinore, yenidoğan solunum sıkıntısı, tıkalı burun ve beslenme güçlüğü olan bebekler PKD açısından şüpheli olmalıdır. Daha sonraki yaşamda, kronik otitis, tekrarlayan pnömoni, rinosinüzit ve bozulmuş MCC'ye bağlı kronik, tipik ıslak öksürük, bronşektazi ve bozulmuş akciğer fonksiyonu ile kombinasyon halinde yetişkinliğe kadar devam eden PCD'nin ayırt edici semptomlarıdır2.

PCD'li olduğundan şüphelenilen hastalara farklı tanı araçları kullanılarak tanı konulabilir. TEM, geçmişte birinci basamak teşhis için altın standart olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, PCD vakalarının% 30'una kadarı anormal ultrayapı 1,3,4,5,6 göstermez ve farklı bir tanısal yaklaşım gerektirir. Bu nedenle, giderek artan sayıda merkez ve Avrupa Solunum Derneği'nin (ERS) kılavuzları, ilk basamak tanı1,7,9,10 olarak nazal nitrik oksit (nNO) ve HSVMA'nın bir kombinasyonunu önermektedir. HSVMA ve nNO, PCD11'li bir hastanın tanımlanmasında da en uygun maliyetli seçeneklerdir. Bununla birlikte, genetik testler tanıya dahil edilmiş olsa bile, şu anda PCD'yi% 100 kesinlik 8,9,10 ile dışlayabilecek tek başına bir test veya test kombinasyonu olmadığı akılda tutulmalıdır.

Mevcut tanı seçeneklerinden HSVMA, canlı, kirpik kaplı solunum hücrelerine odaklanan ve siliyer atım paterni (CBP) ve siliyer atım frekansını (CBF) değerlendiren tek testtir. TEM'in aksine, HSVMA'nın sonuçları genellikle test gününde hızlı bir şekilde elde edilebilirken, TEM'in sonuçları numune alındıktan aylar sonra gelebilir. HSVMA tüm yaş grupları için uygulanabilirken, nNO yüksek derecede uyumluluk gerektirir; 5 yaşın altında kullanma girişimleri genelliklebaşarısız olur 10. Deneyimli ellerde, HSVMA PCD'yi sırasıyla% 100 ve% 96,12'de teşhis etmek için mükemmel duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir.

Bu makalede, kirpik kaplı solunum hücrelerinin burnun inferior konkasından toplanması, hasat edilen hücrelerin araştırma bölgesine taşınması için hücre besleyici bir ortamda korunması ve CBF ve CBP'yi belirlemek için mikroskobik video analizi süreci dahil olmak üzere HSVMA'yı gerçekleştirmek için adım adım prosedür açıklanmaktadır. Ek olarak, normal CBP'leri ve CBF'leri anormal kirpik fonksiyonu ile karşılaştıran hastalardan bazı video klipler gösterilmiştir (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 ve Video 8).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyan:

Bu çalışma yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır (69/2017) ve Helsinki deklarasyonuna uygun olarak yürütülmüştür.

1. Solunum epitel hücrelerinin toplanması ve taşınması

  1. Fırçalama
    1. Fırçalamadan önce, kirpik fonksiyonuna müdahale eden biyofilmleri ortadan kaldırmak için hastaya iki haftalık bir oral amoksisilin-klavulanik asit kürü uygulayın. Antibiyotiğin işlemden 2 gün önce sonlandırıldığından emin olun.
    2. Fırçalanmış epitel hücre şeritleri üzerindeki mukoza materyalinin bir kaplamasını azaltmak için, hastadan burnunu iyice üflemesini isteyin. Ebeveynlerden küçük çocuklarının burunlarını üflemesine yardım etmelerini isteyin.
    3. Fırçalama için, 0,6 mm boyutunda bir diş arası fırça kullanın ( bkz. Hastanın başını bir elinizle sabit tutun ve diğer elinizle yeterli epitel hücre şeridi toplamak için her iki burun deliğinin inferior konkasını fırçalayın.
      NOT: Dişler arası fırçayı inferior konkanın altına derinlemesine yerleştirirken genellikle hafif bir direnç görülür. Burun fırçalama işlemi yaklaşık 2 sn hızlı dönme ve toplama ile gerçekleştirilir. Daha uzun ve yoğun fırçalama, aksi takdirde ciddi epitel hasarına ve ardışık epistaksislere neden olabilir.
    4. Bronkoskopi şüpheli PCD dışındaki nedenlerle planlanıyorsa, bronkoskopi sırasında karina veya bronşiyal epiteli fırçalayarak veya biyopsi ile örnekler toplayın13.
    5. Hasat edilen hücre şeritlerini, hücre besleyici Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne bırakın.
      NOT: Epitel hücre şeritleri genellikle fırçayı tüp duvarına fırlatıp çevirerek fırçayı daha kolay düşürür.
    6. Mikrosantrifüj tüpünün kapağını kapatın ve tüpü bir ışık kaynağına karşı tutun. Hasat edilen hücre şeritlerini ve konglomeraları keşfetmek için tüpü sallayın.
  2. Numunenin taşınması
    1. Mikrosantrifüj tüplerini sıkıca kapatılmış bir polistiren kutuya yerleştirin ve tüplerin kapağının düzgün bir şekilde kapatıldığından ve tüplerin kutunun içine sabitlendiğinden emin olun.
    2. Soğuk bir paket ekleyin; ancak, numuneyi dondurmaktan kaçının.
      NOT: İncelemeden önce numunenin korunması için optimum sıcaklık yaklaşık 4-8 ° C'dir (39.2-46.4 ° F).
    3. Korunan numunelerin sonraki 24 saat boyunca analiz edildiğinden emin olun.
      NOT: Bu deneylerde, fırçalama ve HSVMA arasındaki ortalama süre 3 saattir.

2. Yüksek hızlı video mikroskopi analizi (HSVMA)

  1. Örneklerin video mikroskopisi
    1. Numuneleri içeren mikrosantrifüj tüplerini aldıktan sonra, optimal, in vivo benzeri bir ortamı taklit etmek için 37 ° C'ye (98.6 ° F) kadar ısıtın.
    2. Mikroskop bir ısıtma ünitesi ile donatılmışsa, tüpleri kaputun altına yerleştirin ve orada ısıtın. Alternatif olarak, numuneleri ısıtmak için bir inkübatör kullanın.
    3. PC'deki kamerayı ve video ünitesinin yazılımını başlatın.
    4. Bir pipet kullanarak, numuneden az miktarda alın ve bir küvet veya cam tabanlı bir kaba iki damla yerleştirin ( bkz. Küvet veya tabağı bir kapakla örtün ve mikroskop altına yerleştirin.
    5. Örneklerin değerlendirilmesi için, soğuk ışık kaynağı ve yüksek hızda (en az 200 kare / s) kayıt yapabilen bir video kamera ile donatılmış bir diferansiyel girişim mikroskobu kullanın. 100x büyütmeli bir yağ daldırma lensi kullanın ve optiğin yüzeyine bir damla daldırma yağı koyun.
      NOT: Lensin aşağıdan yaklaştığı mikroskoplar önerilir.
    6. Kabın dibine mikroskop merceği ile yaklaşın ve kırmızı kan hücreleri olmayan ve düşük mukus içeriğine sahip hücre kümelerini arayın. Temsili bir ilgi alanı (ROI) bulduktan sonra, en büyük kirpik hareketlerine sahip belirli bir kirpik grubuna odaklanın ve bir video dizisi kaydedin. Yenen kirpikleri olan hücreleri yana doğru ve yukarıdan kaydedin. Bundan sonra, başka bir temsili hücre kümesi arayın ve kaydı tekrarlayın.
      NOT: Kirpik kaplı hücreler 1.000x büyütme altında araştırılmalı ve dövülen kirpikler, 200 / s veya daha fazla kare hızında ayarlanmış bir dijital yüksek hızlı video (DHSV) kamera ile kaydedilmelidir (bu protokolde 256 / s). Kaydedilen video kliplerden elde edilen veriler sabit sürücüde çok fazla alan gerektirdiğinden, harici bir SSD sabit sürücüsü önerilir.
  2. Video dizilerinin analizi
    1. CBF ve CBP'yi belirlemek için video klipleri kare kare oynatın.
    2. CBF'yi belirlemek için kare hızını 15 kare/sn ile ağır çekime ayarlayın ve art arda 10 vuruş sayın.
    3. 10 atımlık tek bir döngü sırasında geçen kare sayısını kaydedin ve sonucu Eq'ya (1) ekleyin. Kaydedilen tüm kirpik vuruş döngülerinin ortalamasını hesaplayarak frekansı belirleyin ve sonucu yaş için referans değerlerle karşılaştırın (bkz. Tablo 1)14.
      figure-protocol-1 (1)
      Burada X, 10 atımlık bir döngü sırasında geçen karelerin sayısıdır.
    4. CBP'yi değerlendirmek için, dayak kirpiklerinin hareketinin tam aralıkta olup olmadığını (bkz. Şekil 1) ve senkronize olup olmadığını izleyin. Seçim yanlılığını önlemek için CBP'yi iki bağımsız operatörün değerlendirmesini sağlayın.
    5. HSVMA analizinin sonuçlarını PCD ile uyumlu, olası olmayan veya sonuçsuz olarak raporlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Video 1 ve Video 2, CBF ve CBP'nin normal aralıkta olduğu normal bir kontrol gösterir (bkz. Şekil 1). Video 3, Video 4, Video 5 ve Video 6, DNAH11 geninde homozigot mutasyonu olan iki PCD hastasını temsil etmektedir (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. Bu temsili videolar, DNAH11 genindeki mutasyonların fenotiplerinin dikkate değer olmas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, HSVMA kullanarak PCD için teşhis süreci, birinci basamak teşhis ışığında tanımlanmış ve tartışılmıştır. HSVMA'nın kurulması nispeten kolay, uygun maliyetli11 ve deneyimli ellerde güvenilir bir yöntem12 olmasına rağmen, HSVMA tuzakları olmayan bir teşhis önlemi değildir. Anormal CBF ve CBP, bronko-respiratuar epitel15'in iltihaplanmasına yol açan ikincil enfeksiyona bağlı olabilir ve aynı nedenle, sigara içen bireylerin anormal vuruş frekansla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çocuk hemşiresi Bayan Johanna Juvankoski'ye fırçalamalarla ilgili mükemmel yardımı için özel teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz. Ayrıca, Profesör Heymut Omran'a (University Clinic Münster, UKM), web sitelerinden normal siliyer hareketin şematik figürünü kullanma izni verdiği için özel şükranlarımızı sunmak istiyoruz. Son olarak, PGCE'den Bay Alan Brown BA'ya (Hons) makaleyi düzelttiği için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amoksisilin-klavulanik asitOrion Oyj40 mg / kg, yetişkinler için 2 doz / gün'e bölünmüş, 875/125 mg 1 tablet x2 / gün
Kamera YazılımıHamamatsuHCI Image
ve taşıma içinherhangi birsoğuk paket
Diferansiyel girişim mikroskobuCarl ZeissTers, hücre gözlemci mikroskobu
Digitial High Hızlı Video KameraHamamatsuOrca Flash 4.0, dijital kamera tipi C11440
Dulbecco&akut; s Modifiye Eagle MediumThermo Fisher10565018bazal hücre kültürü ortamı
Eppendorf tüpüEppendorf301200861.5 mL tüp
Cam tabanlı mikro kuyu kabıMatTekP35G-1.5-14-Cküvet
için Isıtma ÜnitesiCarl Zeiss/PeCon810-450001Carl Zeiss PeCon TempModule S1 sıcaklık kontrollü
inkübasyon elemanlarıDiş arası fırçası 0,6 mmDoft872267Fermuarlı torbada yeniden kullanılabilir saplı ve kapaklı uzun bir tel üzerinde diş arası fırçası
ObjektifCarl Zeiss100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objektif
Taşıma içinherhangi birkapaklı küçük polistiren kutu
Koruma mikroskopi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2(2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675(2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14(2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Siliyer At m PaterniSolunum Epitel H creleriSiliyer At m FrekansElektron Mikroskobumm nofloresan MikroskopiDNAH11 MutasyonuMukosiliyer TemizlemeSiliyer H cre zolasyonu

İlgili makaleler