Callinectes sapidus'ta Nöropeptitlerin Çok Yönlü Kütle Spektrometrik Araştırması

Ashley Phetsanthad; Nhu Q. Vu; Lingjun Li

doi:10.3791/63322

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Callinectes sapidus'ta Nöropeptitlerin Çok Yönlü Kütle Spektrometrik Araştırması

2.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63322

⸱

31 Mayıs 2022

Ashley Phetsanthad^*¹ , Nhu Q. Vu^*¹ , Lingjun Li¹^,²

¹Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, ²School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Nöropeptitlerin kütle spektrometrik karakterizasyonu sekans, kantitasyon ve lokalizasyon bilgileri sağlar. Bu optimize edilmiş iş akışı sadece nöropeptit çalışmaları için değil, aynı zamanda diğer endojen peptitler için de yararlıdır. Burada verilen protokoller, LC-ESI-MS, MALDI-MS lekeleme ve MALDI-MS görüntüleme kullanılarak nöropeptitlerin örnek hazırlama, MS edinimi, MS analizi ve veritabanı oluşturmayı açıklamaktadır.

Özet

Nöropeptitler, gelişim, üreme, gıda alımı ve dış stresörlere yanıt gibi hemen hemen tüm fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen sinyal molekülleridir. Bununla birlikte, nöropeptitlerin biyokimyasal mekanizmaları ve tam tamamlayıcısı ve fonksiyonel rolleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu endojen peptitlerin karakterizasyonu, bu sinyal molekülleri sınıfındaki muazzam çeşitlilik tarafından engellenir. Ek olarak, nöropeptitler, nörotransmitterlerinkinden 100x - 1000x daha düşük konsantrasyonlarda biyoaktiftir ve sinaptik salınımdan sonra enzimatik bozunmaya eğilimlidir. Kütle spektrometresi (MS), kapsamlı a priori bilgi olmadan analitleri tanımlayabilen, ölçebilen ve lokalize edebilen oldukça hassas bir analitik araçtır. Nöropeptitlerin küresel olarak profillenmesi ve yeni peptitlerin keşfine yardımcı olmak için çok uygundur. Bu peptit sınıfının düşük bolluğu ve yüksek kimyasal çeşitliliği nedeniyle, çeşitli numune hazırlama yöntemleri, MS edinme parametreleri ve veri analizi stratejileri, optimal nöropeptit karakterizasyonuna izin vermek için proteomik tekniklerden uyarlanmıştır. Burada, sıvı kromatografisi (LC)-MS ve matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyonu (MALDI)-MS kullanılarak sekans karakterizasyonu, kantitasyonu ve lokalizasyonu için nöropeptitleri karmaşık biyolojik dokulardan izole etmek için yöntemler tanımlanmıştır. Mavi yengeçten bir nöropeptit veritabanı hazırlamak için bir protokol, kapsamlı genomik bilgiye sahip olmayan bir organizma olan Callinectes sapidus dahil edilmiştir. Bu iş akışları, çeşitli aletler kullanılarak farklı türlerdeki diğer endojen peptit sınıflarını incelemek için uyarlanabilir.

Giriş

Sinir sistemi karmaşıktır ve bir organizma boyunca sinyalleri iletmek için bir nöron ağı gerektirir. Sinir sistemi duyusal bilgileri ve biyolojik tepkiyi koordine eder. Sinyal iletiminde yer alan karmaşık ve kıvrımlı etkileşimler, nörotransmiterler, steroidler ve nöropeptitler gibi birçok farklı sinyal molekülü gerektirir. Nöropeptitler, strese ve diğer uyaranlara karşı fizyolojik tepkileri aktive etmede kilit rol oynayan en çeşitli ve güçlü sinyal molekülleri olduğundan, bu fizyolojik süreçlerdeki spesifik rollerini belirlemek ilgi çekicidir. Nöropeptit fonksiyonu, hareketliliği, reseptör etkileşimini ve afinite^1'i belirleyen amino asit yapıla....