Sivrisinekler ve Meyve Sinekleri için İnsektisit Toksisitesini Ölçmek için Topikal Uygulama Biyotahlili

Özet

Sivrisineklerde ve meyve sineklerinde insektisit duyarlılığını ölçmek için topikal uygulama biyotestinin metodolojisini ve önemini açıklıyoruz. Sunulan tahlil yüksek verimlidir, böcek kütlesini kullanır - böylece konsantrasyon yerine kütle ile ilişkili ölümcül bir dozun hesaplanmasına izin verir - ve muhtemelen diğer benzer yöntemlerden daha düşük değişkenliğe sahiptir.

Özet

İnsektisitlerin halk sağlığı ve tarım için kullanılmaya devam edilmesi, insektisit direncinin yaygınlaşmasına ve kontrol yöntemlerinin engellenmesine yol açmıştır. Sivrisinek popülasyonlarının insektisit direnci sürveyansı tipik olarak Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) şişe biyotahlilleri veya Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tüp testleri yoluyla yapılır. Bununla birlikte, bu yöntemler, böcekle değişken insektisit teması, test edilen nispeten az sayıda organizma, popülasyonlar arasındaki kütlede geniş çaplı varyasyon ve sürekli değişen çevresel koşullar nedeniyle mortalite verilerinde yüksek derecede değişkenliğe neden olabilir ve değişken sonuçlara yol açabilir. Bu yazıda, bir dizi insektisit konsantrasyonu boyunca çok sayıda böceği test etmek için hem sivrisinekler hem de meyve sinekleri için yüksek verimli bir fenotipik biyotahlil olarak uyarlanmış topikal uygulama biyotahlili sunulmaktadır.

Bu tahlil 1) her organizma ile tutarlı tedavi ve insektisit teması sağlar, 2) suşlar ve cinsiyetler arasındaki ortalama kütledeki farklılıkları hesaba katan oldukça spesifik doz-yanıt eğrileri üretir (özellikle sahada toplanan organizmalar için önemlidir) ve 3) istatistiksel olarak titiz medyan ölümcül dozların hesaplanmasına izin verir (LD₅₀ ), direnç oranı karşılaştırmaları için gerekli olan - larvikid direnci sürveyansı için de kullanılan tanısal doz mortalitesinden alternatif bir sürveyans yaklaşımı. Bu tahlil, sivrisinek popülasyonlarını doğru bir şekilde fenotiplemek için tamamlayıcı bir araç olacaktır ve meyve sinekleri kullanılarak gösterildiği gibi, diğer böceklerle kullanım için kolayca uyarlanabilir. Bu tahlilin, çoklu böcek türlerinde genotipik ve fenotipik insektisit direnci arasındaki boşluğu doldurmaya yardımcı olacağını savunuyoruz.

Giriş

Sivrisinekler, insanlara bulaştırdıkları hastalıklar nedeniyle her yıl 700.000'den fazla ölümden sorumludur ve bu ölümlerin yarısından fazlası yalnızca sıtmaya bağlıdır¹. Sıtma ve diğer vektör kaynaklı hastalıkların bulaşmasına karşı ana önleyici yöntem, genellikle uzun ömürlü insektisit ağları veya iç mekanda artık püskürtme şeklinde insektisitlerin kullanılmasıdır². Bununla birlikte, böcek ilacı direnci sivrisinekler ve diğer böcek vektörleri ile tarımsal zararlılar arasında yaygındır ^3,4. Direnişi etkili bir şekilde yönetmek için, gözetim kilit öneme sahiptir⁵. Bunun için son derece doğru ve yüksek verimli direnç algılama yöntemlerine ihtiyaç vardır. Şu anda, sivrisinekler için en yaygın insektisit direnci gözetim araçları WHO tüp testi⁶ ve CDC şişe biyotahlili^7'dir. Meyve sinekleri için artık temas uygulama yöntemi (CDC şişe biyotahliline benzer) yaygın olarak kullanılan bir insektisit biyotahlilidir ^8,9,10. Bununla birlikte, bu yöntemlerden elde edilen verilerdeki değişkenlik tipik olarak yüksektir, aynı laboratuvar suşunun ölçümleri CDC şişe tahlillerinde ~% 20-70 mortalite ve sublethal dozlara maruz kaldığında DSÖ tüp testlerinde% 0-50 arasında değişmektedir¹¹. Bu tür varyasyonlar şaşırtıcıdır, çünkü çoğu laboratuvar suşundaki sınırlı genetik varyasyonun, popülasyonda sınırlı insektisit duyarlılık varyasyonuna yol açması beklenmektedir. Bununla birlikte, biyotahlil sonuçlarında hala yüksek düzeyde bir varyasyon gözlenmektedir.

Bu varyasyonun potansiyel kaynakları, yüzey yoluyla dolaylı insektisit maruziyeti, heterojen çevresel etkiler, aynı genotipteki bireyler arasındaki normal biyolojik varyasyon ve aynı popülasyondaki örneklerin kütlesindeki varyasyon nedeniyle biyotahlildeki örnekler arasındaki heterojen insektisit maruziyetinin bir sonucu^olabilir12 . Daha yüksek tekrarlanabilirliğe sahip nadir kullanılan bir yöntem, topikal uygulama biyotahlilidir. Bu tahlilde, insektisit doğrudan her bir böceğe^13,14 uygulanır ve aynı tahlil içindeki farklı örneklerin heterojen maruziyet faktörünü ortadan kaldırır. Bununla birlikte, bu yöntemin yavaş verimli doğası nedeniyle, sivrisinek popülasyonları için rutin olarak bir insektisit duyarlılığı gözetim aracı olarak kullanılmamaktadır. Bu yazıda, topikal uygulama biyotahlili için, daha yüksek verimli maruziyetlere izin veren ve aynı zamanda böcek kütlesindeki varyasyonu düzelten, insektisit duyarlılığındaki değişikliklerle ilişkili bir parametre olan modifiye edilmiş bir protokol sunulmaktadır¹². Değişken insektisit maruziyetinden kaynaklanan mortalite verilerinde gürültü ve kütle ile ilişkili varyasyonda bir azalma, daha doğru teknik direnç sürveyansı için izin verecektir^11,15. Bu veriler, fenotipik direnci genetik belirteçler, uygunluk parametreleri ve / veya vektör yeterliliği ile daha doğru bir şekilde ilişkilendirmek için kullanılabilir. Ek olarak, daha küçük gövdeli bir böcek türü olan meyve sinekleri üzerindeki topikal uygulama biyotahlilini kullanarak bu tahlilin diğer böcek türlerine nasıl kolayca adapte edilebileceğini gösteriyoruz.

Yukarıda bahsedilen kalıntı temas uygulamalarının temel sınırlaması, insektisit maruziyetinin aynı tahlil içinde numuneden numuneye değişebilmesidir. CDC şişe biyotahlilleri ve temas yöntemi durumunda, insektisit maruziyeti aynı tahlilin replikaları arasında değişebilir. Böcekler, bir cam şişenin içine (CDC şişe biyotahlili ve temas yöntemi) veya emprenye edilmiş kağıtlara (WHO tüp testi) dağıtılan insektisitlere maruz kalır. Her iki yüzeydeki (cam ve kağıt) insektisit konsantrasyonu, bilinen genotiplerin farklı türlerinin taranmasıyla bilinir ve önceden belirlenir. Bununla birlikte, böcek tarafından potansiyel olarak emilebilecek miktar, kullanılan yüzeye, böcek ilacı karışımı bileşenlerine ve insektisitin yüzey malzemesi boyunca homojen bir şekilde nasıl dağıldığına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir^16,17. CDC şişe biyotahlilinde, şişenin içindeki insektisit kaplama, her laboratuvar ve kullanıcı tarafından kullanılan prosedürlere bağlıdır. DSÖ tüp testinde, insektisit ile muamele edilmiş kağıtlar merkezi olarak üretilir ve bu nedenle büyük olasılıkla laboratuvarlar arasında oldukça homojendir. Bununla birlikte, WHO tüp testinde, maruz kalma tüpü, örneklerin iniş inişine maruz kalmayan metal ağ üzerinde inmesine ve dinlenmesine izin verir, bu da her testteki örnekler arasında potansiyel heterojen insektisit maruziyetine yol açar. Her yöntemle örnekler tarafından toplanan ve emilen gerçek insektisit miktarının hala^{araştırılması gerekiyor 18}.

Ek olarak, CDC şişe biyotahlili, WHO tüp testi ve temas yöntemi en yaygın olarak önceden belirlenmiş bir insektisit konsantrasyonunu test eden eşik tahlilleri olarak kullanılır. Bu yaklaşım, direncin varlığını doğru bir şekilde tespit edebilir ve direnç gözetimi için değerlidir (özellikle direnç yayılırken). Bununla birlikte, eşik testleri direncin gücünü ölçemez, bu da müdahale araçlarının etkinliğinin daha öngörücü olabilir. Bu yöntemlerle çoklu insektisit konsantrasyonları kullanılıyorsa, yoğunluk tahlilleri olarak kullanılabilirler. CDC şişe biyotahlili ve WHO tüp testi için yoğunluk testleri, gözetim 6,19'daki bu boşluğu gidermek için önceden belirlenmiş ayırıcı dozajların 5x ve ^10x'ini test ederek tanıtılmıştır. Dirençli popülasyonlar arasında ayrım yapmak için daha fazla yetenek sağlarken, 3-5 (önceden belirlenmiş) dozaj, ölümcül konsantrasyonları hesaplamak için sınırlı çözünürlük sağlar. Ek olarak, bu tür tahlillerde çeşitli boyutlarda sivrisinekler kullanılır. Bununla birlikte, kütlenin ölçülmesi önemlidir, çünkü daha büyük örneklerin öldürülmesi için daha yüksek bir doza ihtiyaç duyulabilir, çünkü kütle birimi başına etkili doz, daha küçük bir organizmanınkinden çok daha düşük olacaktır¹². Kütle ile ilişkilendirilmiş ölümcül bir dozun (böcek kütlesi başına böcek ilacı miktarı) hesaplanması, böcek kütlesinin cinsiyetler, popülasyonlar ve genotipler arasındaki değişimini göz önünde bulundurduğu için daha yaygın ölümcül konsantrasyondan (örneğin, yüzey alanı başına böcek ilacı miktarı) daha yararlı bir metrik olacaktır. Bu tür veriler, laboratuvar ve sahadaki genotipik ve fenotipik direnç arasındaki boşluğu doldurmaya yardımcı olacak ve ayrıca bilinen ortalama kütleye sahip bir böcek popülasyonunu tedavi etmek için gerekli uygulama konsantrasyonunu hesaplamanın kolay bir yolunu sağlayabilir.

Örneklerin% 50'sini öldüren kütle göreli ölümcül dozajların kullanımı (LD₅₀) ayrıca diğer birçok faydayı da içerir. Belirli bir bileşiğin mg / kg (= ng / mg) cinsinden toksisitesinin değerlendirilmesi insan ve veteriner toksikolojisinde standarttır¹⁴ ve LD₅₀ değerleri malzeme güvenlik bilgi formlarında bulunur. Ölümcül dozajlar ayrıca, belirli bir türe yönelik farklı kimyasallar arasındaki toksisitenin doğrudan karşılaştırılmasına veya aynı kimyasalın farklı türlere doğru doğrudan karşılaştırılmasına izin verir²⁰, ayrıca yeni böcek öldürücülerin ve kimyasalların yüksek kalitede değerlendirilmesine izin verir¹³. Ek olarak, LD₅₀ , tanısal doz mortalite sonuçlarından elde edilenlerden daha anlamlı ve doğru direnç oranları sağlayabilir, bu da bir popülasyonda mevcut direnç seviyesinin abartılmasına neden olabilir. Bu nedenle, bu tahlil, diğer biyotahliller²¹ için önerilenden daha fazla örnekten elde edilen kütle-görecelileştirilmiş ölümcül dozlara dayanan daha titiz direnç izlemesi sağlayarak rutin sürveyans programları için uygun olacaktır.

Topikal uygulama yöntemi, direnç zaten bilindiğinde veya şüphelenildiğinde standart insektisit duyarlılık biyotahlillerine alternatif olarak sivrisinekler ve sinekler için insektisit duyarlılık sürveyansında^{kullanılmış 22,23,} ayrıca bazı haşere böceklerinde sürveyans için²⁴ direnç profillerini ve insektisit içsel toksisitesini daha doğru bir şekilde değerlendirmek için ²¹ . Topikal uygulama biyotahlillerinde, insektisit her organizmaya uygulanır ve insektisit maruziyetinde minimum varyasyona neden olur. Bu yazıda, böcek öldürücü maruziyetinin kısa sürede çok sayıda böceğe uygulanmasına izin veren ve aynı zamanda böcek kütlesini kontrol eden biraz uyarlanmış ve geliştirilmiş bir yöntem sunulmaktadır²². İyi düzeyde tekrarlanabilirliğe sahip bu yüksek verimli yöntem, rutin insektisit duyarlılığı gözetimi için yararlı bir ek araç olabilir.

Protokol

NOT: İnsektisitler insan, hayvan ve çevresel tehlikelere neden olabilir²⁵. Dikkat, eğitim ve kişisel koruyucu ekipman şiddetle tavsiye edilir. Kullanılan tüm insektisitler ve çözücüler için malzeme güvenlik bilgi formlarına uyduğunuzdan emin olun.

1. Arka örnekler

1. Arka 3-5 günlük yetişkin sivrisinekler.
   NOT: Aşağıdaki protokol, Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü kılavuz ilkeleri^26'yı yakından takip eden Aedes aegypti yetiştiriciliği koşullarını yansıtmaktadır.
   1. 27 ± 1 °C ve 75'te tüm yaşam aşamalarının arka sivrisinekleri, 12:12 saat aydınlık ve karanlık döngü ile% 5 bağıl nem ±.
   2. Sivrisinek yumurtalarını deiyonize suya batırarak ve maya²⁶ ekleyerek yumurtadan çıkarın veya batık yumurtaları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.
      NOT: Her iki yöntem de su içindeki oksijen içeriğini azaltır ve kuluçka^27'yi arttırır.
   3. Yeni yumurtadan çıkan larva balık mamasını (veya öğütülmüş kedi kibble gibi eşdeğer bir diyeti) tepsilerin içinde besleyin ve larva yoğunluğu gelişimi etkilediğinden larva yoğunluğunu tepsiler arasında mümkün olduğunca benzer tutun¹² (örneğin; toplam 1.5 L su içeren tepsi başına 200-250 larva).
   4. Larvaları pupa aşamasına ulaşana kadar (yaklaşık 7-10 gün) her gün besleyin ve gerektiğinde yiyecek miktarını artırın.
      NOT: Çok az beslendiğinde, larva büyümesi bodur olur ve larvalar birbirlerini yiyebilir. Çok fazla beslendiğinde, larvalar ölebilir ve suyun kirlenmesine neden olabilir.
   5. Pupa geliştikten sonra, onları günlük olarak yetişkin sivrisinek kafeslerinde bir su kabına aktarın ve% 10 sakkaroz çözeltisi ad libitum sağlayın.
   6. Yetişkin ortaya çıkışının ilk gününü kaydedin. Kalan pupaları ortaya çıkmaya başladıktan 2 gün sonra kafesten çıkarın.
      NOT: Erkek sivrisinekler daha hızlı ortaya çıkar. Erkeklerin ve kadınların ayrı ayrı ortaya çıktığına dikkat edin ve her test için yeterli erkek ve dişinin mevcut olduğundan emin olun.
   7. Test için 3-5 günlük sivrisinekler elde etmek için pupaları çıkardıktan sonra 3 gün bekleyin.
2. Arka meyve sinekleri (Zürih Üniversitesi^28'in protokollerini gevşek bir şekilde takip ederek).
   1. Arka Drosophila , stok şişelerinde 23 ± 1 °C ve 60 ± 12:12 saat aydınlık ve karanlık döngü ile% 5 bağıl nem suşları oluşturur.
      NOT: Drosophila stok şişeleri, önce şişelerin dibine sıvı olarak dökülen ve daha sonra gece boyunca katılaşmasına izin verilen 75 mL'lik standart bir sinek ortamı içermelidir.
   2. Aşırı nüfus ve küf büyümesini önlemek için kolonileri her iki haftada bir taze gıda içeren yeni stok şişelerine aktarın. Bunu yapmak için, elde taşınan bir karbondioksit (CO₂) dağıtıcısı kullanarak sinekleri devirin, anestezi uygulanan sinekleri bir buz torbası veya soğuk masa üzerindeki bir tartım kağıdına aktarın ve ince uçlu bir boya fırçası kullanarak sinekleri taze bir stok şişesine fırçalayın. Sineklerin yiyeceğe düşmesini ve boğulmasını önlemek için bu işlem sırasında şişeleri yanlarında tuttuğunuzdan emin olun.

2. Gravimetrik yaklaşımı kullanarak insektisit formülasyonları hazırlayın

1. Bir duman davlumbazının içinde 0,1 mg hassasiyete sahip analitik bir terazi kullanarak gravimetrik yaklaşımı izleyerek ilk stok çözümünü yapın.
   NOT: Gravimetrik yaklaşım, eklenen insektisit ve çözücü miktarlarını ölçmek için kütle kullanır. Standart uygulama (hacimsel yaklaşım), ilk stok çözeltisi hazırlandığında eklenen (katı) insektisit miktarını ölçmek için analitik bir ölçek gerektirecektir; Bununla birlikte, eklenen çözücü miktarı ve aşağıdaki tüm seyreltmeler yalnızca hacimle ölçülür. Gravimetrik yaklaşım daha yüksek bir doğruluk seviyesine sahiptir ve bu nedenle tercih edilir.
   1. İlk stok çözeltisi için hedef insektisit konsantrasyonunu ve hedef hacmini (dondurucuda saklanırken dökülmeyi önlemek için 15 mL konik tüpler kullanılıyorsa maksimum 10 mL önerilir) belirleyin ve Eq (1) kullanarak ne kadar insektisit aktif bileşenin (AI) ekleneceğini hesaplayın:
        (1)
   2. Bir depolama tüpü hazırlayın (daha büyük hacimler için önerilen 15 mL konik tüp, 1 mL veya daha az hacimler için önerilen 1,5 mL mikrosantrifüj vidalı kapak tüpleri) ve böcek ilacı ve çözücü adı, hedef konsantrasyonu ve hazırlama tarihi ile etiketleyin. Tüpü ve kapağı terazinin üzerine bir raf veya tutucu içine yerleştirin ve teraziyi darmadağın edin.
   3. Adım 2.1.1'den belirlenen istenen miktarda katı veya sıvı insektisit AI'yı tartın. (örneğin, temsili veriler için kullanılan deltametrin) tüpe yerleştirin ve kütleyi kaydedin.
   4. Teraziyi darmadağın ve istenen miktarda çözücüyü (hedef hacme eşdeğer) tüpe ekleyin, kapağı hemen kapatın ve kütleyi kaydedin. Buharlaşmayı önlemek için çözücüyü (burada kullanılan aseton) ekledikten hemen sonra tüpün kapağını kapatın ve çözeltiyi karıştırın.
   5. Oda sıcaklığını kaydedin. Aseton gibi bazı çözücüler, sıcaklığa bağlı olarak hacimde (ve dolayısıyla yoğunlukta) önemli değişikliklere sahip olabilir.
   6. Hemen saklıyorsanız, tüpün kapağını parafilme sarın (buharlaşmayı azaltmak için), bir tüp rafına/tutucusuna yerleştirin (dik tutmak ve sızıntıyı önlemek için), folyo içine örtün (UV ışınlarına maruz kalmayı önlemek için), yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun (buharlaşmayı azaltmak için) ve torbayı -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Hemen saklanmazsa, kapağın sabitlendiğinden ve folyo veya hafif korumalı bir kapla kaplandığından emin olun.
   7. Eklenen çözücü hacmine (ve sıvı formdaysa eklenen insektisit hacmine) eklenen insektisit AI kütlesini bölerek stok çözeltisinin gerçek konsantrasyonunu (mg / mL) hesaplayın. Eklenen çözücünün (veya sıvı insektisitin) hacmini hesaplamak için, eklenen kütleyi, kaydedilen sıcaklığa uygun olan bilinen yoğunluğa bölün.
   8. Eklenen toplam kütleyi (insektisit ve çözücü) eklenen toplam hacme (sıvı formdaysa çözücü ve insektisit) bölerek stok çözeltisinin yoğunluğunu (g / mL) hesaplayın. Sıvı kütleyi hacme dönüştürmek için adım 2.1.7'ye bakın.
2. İlk stok çözeltisini seyreltmelerle seri olarak seyreltin. Gerekirse, biyotahlil için hedef insektisit konsantrasyonları aralığını tanımlamak üzere bir başlangıç doz-yanıt eğrisi oluşturmak için bu seri seyreltmeleri kullanın.
   1. İnsektisit stok çözeltisinin hacmini ve her tüpe eklenecek çözücüyü hesaplayın (örneğin, önceki konsantrasyonun% 10'unun 10 mL'lik bir seyreltilmesi için 9 mL çözücü içinde seyreltilmiş 1 mL insektisit stok çözeltisi).
   2. 10 sn'lik stok çözümü vorteks. Terazide önceden etiketlenmiş bir ilk seyreltme tüpü dara. Bir pipet kullanarak gerekli hacimdeki stok çözeltisini ilk seyreltme tüpüne ekleyin. Her iki tüpün kapağını hemen kapatın ve kütleyi ilk seyreltme tüpüne kaydedin.
   3. İlk seyreltme tüpünü tekrar darmadağın ve gerekli miktarda çözücü ekleyin. Kapağı hemen kapatın, eklenen çözücünün kütlesini kaydedin ve ilk seyreltmeyi 10 saniye boyunca vorteksleyin.
   4. Kalan seyreltmeler için 2.2.2 ve 2.2.3 numaralı adımları yineleyin.
   5. Tüm seyreltmeleri yukarıda adım 2.1.6'da açıklandığı gibi saklayın.
   6. Adım 2.1.7'yi izleyerek seyreltmelerin gerçek konsantrasyonlarını hesaplayın.
   7. Eklenen toplam kütleyi (insektisit çözeltisi ve çözücü) eklenen toplam hacme (insektisit çözeltisi ve çözücü) bölerek her bir insektisit seyreltmesinin yoğunluğunu hesaplayın. Her seri seyreltme için, Eq (2) 'yi takip eden yeni seyreltmenin yoğunluğunu hesaplamak için önceki insektisit stok seyreltmesinin yoğunluğunu kullanın:
      (2)
3. İsteğe bağlı: Seri seyreltme ile daha küçük artışlarla insektisit seyreltmeleri oluşturun.
   1. İlk seri seyreltmelerin, önceki çalışmaların veya yayınlanmış literatürün doz-yanıt eğrisi yardımıyla yapılacak her yeni çözeltinin konsantrasyonlarını ve hacimlerini seçin.
      NOT: Seçilen konsantrasyonlar, Probit analizine izin vermek için bu aralıktan en az üç konsantrasyon ile% 0-100'lük bir mortalite aralığına neden olmalıdır.
   2. Her yeni seyreltmeyi yapmak için seri seyreltmeleri stok çözümleri olarak kullanın ve 10 katlı seyreltmeler arasında yeni seyreltmeler oluşturmak için adım 2.2'yi izleyin.
4. İsteğe bağlı: Aliquot insektisit çözeltisi. İnsektisit çözeltilerinin daha büyük hacimleri yapılırsa, stok çözeltilerinin sık sık taşınmasından ve ışığa maruz kalmasından kaynaklanan kontaminasyonu, buharlaşmayı ve bozulmasını önlemek için çözeltileri 1,5 mL vidalı kapaklı tüplere ayırın.
   1. En düşük konsantrasyondan başlayarak çözeltileri serbest bırakın ve potansiyel kontaminasyonu azaltmak için en yüksek konsantrasyona doğru çalışın. İstenilen hacmi (örneğin, 0,5 mL) önceden etiketlenmiş bir vidalı kapak tüpüne açmadan ve pipetlemeden önce her stok çözeltisini 10 sn boyunca vorteks yaparak karıştırın.
   2. Alikotları ışığa dayanıklı bir kapta -20 °C dondurucuda saklayın.
      NOT: Alikotların düzenli olarak (aylık) doğrudan stok pestisit seyreltilerinden alınan küçük yeni alikotlarla değiştirilmesi önerilir. Bu, numuneler tezgahta kullanılırken kontaminasyonun diğer deneylere veya buharlaşma veya UV bozulması nedeniyle değişikliklere taşınma potansiyelini sınırlayacaktır. Protokol burada duraklatılabilir ve insektisit çözeltileri düzgün bir şekilde depolandığı sürece (bkz. adım 2.1.6) ve -20 ° C dondurucuda tutulduğu sürece yıllar sonra bile yeniden başlatılabilir.
5. Solvent buharlaşmasını izlemek için saklamadan önce menisküsü işaretlemek için kalıcı bir işaretleyici kalem kullanın. Aliquots yapmak için insektisit çözeltisini çıkarırken, çözelti her çıkarıldığında menisküsü işaretleyin.

3. Topikal uygulama biyotahlil çalışma alanını hazırlayın

NOT: Kaçan sivrisineklerin veya sineklerin daha kolay yakalanması için tezgah üstü böcek taşıma çadırında çalışmanız önerilir. Bir böcek taşıma çadırının görüntüleri için Ek Şekil S1'e bakın.

1. Gerekli insektisit çözeltilerini dondurucudan çıkarın, hemen vorteks yapın ve insektisitlerin kullanmadan önce oda sıcaklığına ısınmasına izin vermek için oda sıcaklığında ışığa dayanıklı bir kaba koyun.
   NOT: İnsektisit AI'lar daha düşük sıcaklıklarda çözücüden ayrılabilir. Ek olarak, aseton hacmi, uygulanan insektisit dozunu değiştirebilen sıcaklıkla birlikte değişir. Çözeltilerin karıştırılması ve oda sıcaklığına ısınmalarına izin verilmesi, insektisit çözeltilerini kullanırken tutarlılığın sağlanmasına yardımcı olur.
2. Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi böcek taşıma çadırındaki topikal uygulama testi için gerekli tüm araçları ve malzemeleri belirleyin.
3. Aseton alikotu başına 5 yıkama işlemini tamamlayarak şırınga namlusunu ve iğneyi analitik sınıf asetonla temizleyin. Bunu toplam 25 yıkama için 5 ayrı aliquot ile tamamlayın. Şırınga ve tekrarlayıcı pipetör parçaları için Ek Şekil S2'ye bakınız.
   1. Her biri 0,5 mL aseton içeren 5 mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
   2. Şırınga namlusunu ilk tüpten 0,025 mL aseton ile doldurun ve ardından pistonu hızla aşağı iterek bir atık kabına atın. Aynı aseton aliquot'tan toplam beş aseton yıkamasını tamamlamak için dört kez daha tekrarlayın. Ardından, şırınga varilini tamamen havayla doldurun ve havayı ve potansiyel aseton kalıntılarını atık kabına atın. Havayla üç "yıkama" işlemini tamamlamak için iki kez daha tekrarlayın.
   3. Kalan 4 tüp aseton için adım 3.3.2'yi tekrarlayın.
   4. Şırınga pistonu ile iğnenin üstü arasında, pistonu namluya hafifçe yukarı çekerek (~ 5 mm) namlu içinde bir hava cebi oluşturun.
      NOT: Bu hava cebi, pistonu insektisit çözeltilerine temas etmekten korur ve insektisit taşınmasını azaltır.
   5. Şırıngayı topikal uygulama için kullanıma hazır olana kadar bir kenara koyun.
4. Uygulanacak dozları içeren bir anahtar oluşturun ve rasgele sayı veya harf üreteçlerini izleyerek rastgele kimlikler atayın (bkz. Ek Dosya 1).
5. Plastik tutma bardaklarını kör mortalite değerlendirmesi için rastgele kimlikle etiketleyin.
   NOT: Gerekirse, protokol burada duraklatılabilir ve daha sonraki bir gün ve saatte yeniden başlatılabilir. Duraklarken birkaç saatten fazla geçerse, şırınganın temiz olduğundan emin olmak için adım 3.3'ü tekrarlamanız ve böcek ilacı çözeltilerini böcekleri dozlamadan yaklaşık bir saat öncesine kadar dondurucuya geri yerleştirmeniz ve ardından adım 3.1'i tekrarlamanız önerilir.

4. Topikal biyotahlil için örnekler hazırlayın. Prosedürel genel bakış için Şekil 1'e bakın

1. Sivrisinekleri sıralayın ve tartın
   1. Solumadan emme ile çalışan bir aspiratör kullanarak, hasarlı bireyleri hesaba katmak için bir fazlalık da dahil olmak üzere, tahlil için gerekli olan istenen sayıda 3-5 günlük yetişkin sivrisinekleri aspire edin. Sivrisinekleri konik bir tüpe (tüp başına 100 sivrisineğe kadar) aspiratörün ucunu ucun etrafına sarılmış pamukla tüpe yerleştirerek aktarın ve aspiratöre hafifçe nefes verin ve dokunun. Aspiratör ucu çıkarıldığında tüpü tıkaymak için pamuğu kullanın ve ardından kapakla kapatın. Aspiratörü ve tüpleri aynı anda çok fazla sivrisinekle doldurmaktan kaçının, çünkü bu sivrisinekler üzerinde ek stres yaratır ve ölüme neden olabilir.
   2. Tüplerdeki sivrisinekleri 4 ° C'de en az 10 dakika yerleştirerek veya bir buz tepsisinde buzun altına gömerek kısaca yıkın.
      NOT: Sivrisinekler 2 °C'de birkaç saat boyunca minimum mortalite²⁹ ile tutulabilir; Bununla birlikte, potansiyel olumsuz etkileri azaltmak için sivrisineklerin buz üzerinde olduğu süreyi en aza indirmek en iyisidir.
   3. Devrilen sivrisinekleri böcek taşıma çadırına aktarın ve sivrisinekleri buzun üzerine yerleştirilmiş plastik bir tepsiye (örneğin, Petri kabı) dikkatlice aktarın. Her birinin altındaki serin tepsiye dokunduğundan ve devrilmiş halde kaldığından emin olmak için bir seferde sadece yaklaşık 50 sivrisinek dökün.
   4. Sivrisinekleri forseps ile bacaklarından (veya kanatlarından) yavaşça toplayarak cinsiyete göre sıralayın ve her cinsiyeti ayrı bir tutma kabına yerleştirin. Sıralama yaparken her cinsiyetten sivrisinek sayısını sayın ve istenen sayıya ulaşıldığında durdurun. Sıralama yaparken, yaralı (örneğin, eksik bacaklar) veya ekstra büyük (örneğin, anormal şekilde genişlemiş karın) veya küçük (çıplak gözle o popülasyonun ortalama sivrisinek boyutundan daha küçük olarak kolayca ayırt edilebilir) sivrisinekleri çıkarın.
      NOT: Sivrisineklerin uzantılarla taşınması, yumuşak birincil gövdelerine (örneğin, karın) yapısal hasarı azaltır.
   5. Her bir bardak sivrisineğin ağırlığını 0,1 mg hassasiyetle analitik bir ölçek kullanarak kaydedin.
      1. Petri kabı olan boş bir bardağı teraziye kapak olarak yerleştirin ve teraziyi darmadağın edin. Sivrisinekleri kabın içine dökün, kapağı üstüne yerleştirin ve kabı teraziye yerleştirin.
      2. Numunelerin toplam ağırlığını ve sayısını puan tablosuna kaydedin (bakınız Ek Dosya 2). Numune kabını derhal hareketsiz tutmak için buzun üzerine geri yerleştirin.
      3. Tüm numune kapları tartılana kadar 4.1.5.1-4.1.5.2 adımlarını tekrarlayın.
   6. Hazırlanan sivrisinekleri, rastgele kimliklerle etiketlenmiş buz üzerine yerleştirilmiş ayrı kaplarda 20-25 kişilik gruplara bölün. Sivrisinekleri transfer ederken, forsepslerin neden olduğu stresi ve fiziksel hasarı azaltmayı hedefleyin. İdeal olarak, sivrisinekleri forseps kullanarak sadece 1-2 kez toplayın: bir kez sıralama / tartım için ve deneysel kaplara transfer için potansiyel bir ikinci kez.
      NOT: Bardak başına ideal bir sivrisinek sayısı 20-25'tir, bu da bir replikasyon için yeterlidir, mortaliteyi değerlendirmek için makuldür ve bardakta yoğunluğa bağlı stres / ölümle sonuçlanmamalıdır.
2. Meyve sineklerini sıralayın ve tartın
   1. Sinekleri 7 s için CO₂ kullanarak anestezi yapın.
      NOT: Sinekler CO_2'ye 7 saniyeden fazla maruz kalırlarsa,³⁰ saniyeden fazla uyandıklarında sürünmekte ve uçmakta zorlanabilirler.
   2. Sinekleri tezgah kağıdına sarılmış bir buz torbasına dökün ve erkekleri ve dişileri ayırmak ve saymak için ince uçlu bir boya fırçası kullanın.
   3. Seçilen sinekleri nazikçe almak ve temiz, boş bir stok şişesine yerleştirmek için boya fırçasını kullanın. Eşit sayıda erkek ve dişi meyve sineği seçin (örneğin, 15 erkek ve 15 dişi) ve stok şişelerini suş adı ve meyve sineği toplamı (örneğin, Kanton-S, 30 sinek) ile etiketleyin.
      NOT: Eşit sayıda dişi ve erkek meyve sineğine sahip olmak önemlidir, çünkü erkek meyve sinekleri dişilerin varlığından çıkarıldıktan sonra birbirlerine karşı artan saldırganlık yaşayabilirler³¹. Bu nedenle, insektisit olmayan ölüm veya yaralanmalardan kaçınmak için, eşit sayıda erkek ve dişi bulundurmak (veya erkek meyve sineklerini tamamen atlamak) en iyisidir.
   4. Analitik bir ölçek kullanarak her bir şişe meyve sineğinin ağırlığını kaydedin.
      1. Teraziye kapak olarak bir Petri kabı olan boş bir şişe (rastgele bir kimlikle etiketlenmiş, adım 3.4'e bakın) yerleştirin ve teraziyi dara alın.
         NOT: Cam şişeler, statiği önemli ölçüde azalttıkları için meyve sinekleriyle birlikte kullanılması tavsiye edilir.
      2. 7 s için CO₂ kullanarak şişenin rastgele kimliğine karşılık gelen meyve sinekleri şişesini anestezi altına alın.
      3. Meyve sineklerini tartım kağıdına dökün ve sinekleri şişeye sokmak için kağıdı huni olarak kullanın. Petri çanağı kapağını meyve sineği şişesinin üzerine yerleştirin ve teraziye yerleştirin.
      4. Kombine ağırlığı ve numune sayısını puan tablosuna kaydedin ve ardından hemen meyve sinekleri şişesini, sineklerin kaçmasını önlemek için kapak hala üstte olacak şekilde bir buz tepsisine yerleştirin.
      5. Her bir şişe meyve sineği için 4.2.4.1-4.2.4.4 arasındaki adımları yineleyin.
3. Yukarıdaki adımlar tamamlandığında, hemen bir sonraki bölüme geçin.

5. Doz örnekleri

1. Şırıngayı uygun insektisit konsantrasyonu ile yükleyin. En az konsantre dozla başlayın ve her organizma grubuyla en konsantre doza doğru çalışın. İsrafı önlemek için, şırıngaya sadece gerekli miktarda böcek ilacı ve önerilen ekstra 2 μL yükleyin.
2. Numuneleri, buz üzerindeki bir tepsinin üzerine yerleştirilmiş tartım kağıtlarına aktarın. Dozajlama için her bir numuneye kolay erişim sağlamak için temiz, böcek ilacı içermeyen bir boya fırçası veya pamuklu çubuk kullanarak birbirine yakın olan örnekleri ayırın. Sivrisinekler için, her bir örneğin dorsumlarına döşendiğinden ve ventral yüzeylerinin yukarı baktığından emin olmak için boya fırçasını da kullanın.
3. Şırıngayı kullanarak, sivrisinekler için ventral toraks ve karın bölgesine ve meyve sinekleri için dorsuma bir damla insektisit çözeltisi (veya kontrol için aseton) uygulayın. Meyve sinekleri gibi daha küçük boyutlu böcekler için 0.2 μL'lik bir damlacık (10 μL'lik bir şırınga gerektiren) ve sivrisinekler için 0.5 μL'lik bir damlacık (25 μL'lik bir şırınga gerektiren) uygulayın.
   NOT: İnsektisit duyarlılığı, birincil vücut parçaları (baş, toraks ve karın gibi) arasında, uzantılara (kanatlar, bacaklar veya hortum gibi) kıyasla anlamlı derecede farklılık ^göstermez32. Bu nedenle, doz damlacığı birincil vücuda uygulandığı sürece uygulama yerinin kesin olması gerekmez. Ventral toraks ve karın bölgesi sivrisinekler için seçilir, çünkü yıkıldıklarında genellikle dorsal taraflarında uzanırlar, oysa dorsum meyve sinekleri için seçilir çünkü genellikle yıkıldıklarında ventral taraflarında uzanırlar. Uygulama sitesinin bu azalan özgüllüğü, bu yöntemin verimini artırmaya yardımcı olur.
4. Numuneleri hemen etiketli plastik kaba geri dökün ve bardağı ağ ve lastik bantla örtün. Bardağı bir tutma tepsisine yerleştirin ve bu süreçte öldürülen, hasar gören veya kaçan örnekleri bardağın üzerine not edin (bu bardaktaki örneklerin son sayısında hariç tutmak için). İlk fincan için, dozajlamanın tamamlandığı zamanı kaydedin.
5. Dozlar arasında böcek ilacı kontaminasyonunu önlemek için numunelerin yerleştirildiği tartım kağıtlarını değiştirin.
6. Tüm örnekler uygun insektisit konsantrasyonları ile dozlanana kadar her fincan için dozlamayı tekrarlayın ve tüm örneklerin dozlandığı bitiş zamanını kaydedin.
7. Islatılmış bir pamuk topu aracılığıyla her bardağa% 10 sakkaroz çözeltisi sağlayın ve ertesi gün ölüm oranı değerlendirilene kadar bardakları bir kenara koyun. Sivrisinekleri u ± %5 bağıl nem 5 ile 27 ± 1 °C'de saklayın ve meyve sinekleri ` ± %5 bağıl nem ile 23 ± 1^°C'de saklayın.
   NOT: Aşırı doygunluğu veya az doygunluğu önlemek için pamuk toplarını sıkarken dikkatli olun. Pamuk topları nemli olmalı ancak damlamamalı. Bardağa şekerli su damlatmak, örneklerin mortalitesine yol açabilir ve böylece insektisitin mortalite değerlendirmesini etkileyebilir.

6. Mortaliteyi değerlendirin

1. İnsektisit maruziyetinin başlamasından 24 saat sonra örnek mortalitesini kaydedin. Sivrisinekleri uçabiliyorlarsa ve kendilerini dik tutabiliyorlarsa canlı olarak sınıflandırın; DSÖ⁶ tarafından tanımlandığı gibi, hareketsiz veya ataksik (uçuş için ayakta duramaz veya havalanamaz) ise ölü olarak. Meyve sinekleri için aynı ölüm oranı değerlendirmesini takip edin ^8,33.
   NOT: Gecikmiş mortaliteyi değerlendirmek için, mortalite günlük şekerli su değişimleri ile 48 ve 72 saat sonra da değerlendirilebilir.
2. Ölüm oranı kaydedildikten sonra, tüm numunelerin bertaraf edilmeden veya daha sonraki kullanımdan (örneğin, moleküler veya kimyasal analiz) önce öldüğünden emin olmak için tüm numune bardaklarını dondurucuda bulunan bir torbaya en az 1 saat boyunca yerleştirin.

7. Çoğaltmalar gerçekleştirme

1. İnsektisit duyarlılığı³⁴. günün saatine bağlı olarak değişebileceğinden, her gün aynı saatte çoğaltmalar yapmaya özen göstererek, yeni bir örnek kümesi üzerinde 3-6 arasındaki adımları tekrarlayın.
2. Örneklerin% 50'sini öldüren ölümcül dozun doğru bir şekilde tahmin edilmesi için her konsantrasyon için en az 3 replikasyon sağlayın (LD₅₀). Yüksek düzeyde değişkenlik gözlenirse daha fazla çoğaltma ekleyin.
3. Tüm veriler toplandıktan sonra analizi tamamlayın.

8. Sonuçları analiz edin

1. Verileri bir elektronik tablo programına kaydedin ve verilerin maskesini kaldırmak için rastgele kimlik anahtarını kullanın (başvuru adımı 3.4). R³⁵ istatistik programında (Ek Dosya 4'teki örnek R koduna bakın) veya 36 numaralı başka bir yazılımda analiz için verileri metin dosyası olarak kaydedin (Ek Dosya ^3'teki örnek verilere bakın).
2. Yazılım programı içinde aşağıdaki analizi tamamlayın. Örnek bir R kodu için Ek Dosya 4'e bakın.
   1. Aşağıdaki Eq (3) 'ü takiben numune kütlesi (mg) başına insektisit (ng) dozunu hesaplayın:
      (3)
   2. Mortaliteyi hesaplayın ve her kontrol 37'de gözlemlenen mortaliteye göre mortaliteyi düzeltmek için Abbott'un formül^37'sini uygulayın. Alternatif olarak, ölüm oranını düzeltmek için Schneider-Orelli (1947) formülünü kullanın³⁸. Her iki formülde de, kontrol verileri alışılmadık derecede yüksek olmadıkça, daha önce açıklandığı³⁷ ve uygulanan³⁹ gibi, her kontroldeki mortaliteden bağımsız olarak düzeltmeyi tüm verilere uygulayın (aşağıdaki tartışmaya bakın).
      NOT: Abbott'un formülü ve Schneider-Orelli formülü gibi eşdeğer alternatifleri, ölüm değerlerini kontrollerde gözlenmeyen mortalite derecesine orantılı olarak ayarlar ve 0 mortaliteye sahip bardaklar için mortalitede bir azalmaya neden olmaz. Daha fazla bilgi için, bu formüller için alıntılanan başvurulara bakın.
   3. Düzeltilmiş mortalite verilerini probit (olasılık birimi) değerleri^40'a dönüştürün ve insektisit dozu ile dönüştürülmüş mortalite verileri arasında doğrusal regresyon gerçekleştirin. Doğrusal model(ler)in uyumunu değerlendirmek için bir ki-kare testi kullanın.
      NOT: 0 (%0 mortalite) veya 1 (0 mortalite) mortalite değerleri, probit dönüşümü tamamlanmadan önce verilerden çıkarılır. Bu, probit dönüşümünün doğası gereği gereklidir. Bu nedenle, grafiklendirilen veriler pozitif veya negatif kontrolleri veya %0 veya 0 mortalite ile sonuçlanan diğer verileri (Abbott'un düzeltmesi uygulandıktan sonra) içermeyecektir.
   4. Daha önce yayınlanmış yöntemleri izleyerek örnek suşu,_popülasyonu ve / veya cinsiyeti başına LD 50 ve% 95 güven aralıklarını (CI'ler) hesaplayın 39,41,42.

Sonuçlar

Bu temsili sonuçlar, iki farklı Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) suşu ve Florida'dan bilinen knockdown direnci mutasyonları F1534C ve V1016I (IICC genotipi) ile izole edilmiş bir alan suşunu içermektedir. Ek olarak, Drosophila melanogaster (Kanton: S suşu) öne çıkmaktadır.

Şekil 2 ve Şekil 3, yukarıdaki protokolü izleyerek test edilen gerinim ve cinsiyete göre her organizmanın doz yanıtını göstermektedir. Her bir suş içindeki erkek ve dişi sivrisineklerin doz-yanıt eğrileri arasında herhangi bir fark gözlenmediğinden (t = 1.70, p = ROCK için p = 0.098 ve t = 0.64, IICC için p = 0.527), her sivrisinek suşu içindeki her iki cinsiyetten veriler toplanmıştır. ROCK ve IICC için kütle göreli LD₅₀ sırasıyla 0.008 ng / mg (% 95 CI: 0-0.104) ve 0.336 ng / mg (% 95 CI: 0.235-0.438) 'dir. Bu değerlerin% 95'i üst üste binmez, bu da suşların önemli ölçüde farklı doz yanıtlarını gösterir. IICC suşunun RR'si (ROCK suşuna göre), DSÖ'ye göre oldukça dirençli⁵ olarak kabul edilen 41.7'dir. Kanton-S meyve sinekleri için, kütle göreli LD₅₀ 0.213 ng / mg'dır (% 95 CI: 0-0.490).

Şekil 2: Topikal uygulama biyotahlili kullanan sivrisineklerin temsili verileri. Deltametrin ve sivrisinekler kullanılarak yukarıdaki protokolü takiben topikal uygulama biyotahlilinden elde edilen temsili doz-yanıt verileri: (A) dişi Ae. aegypti ROCK (n = 880) ve IICC (n = 550) suşları, (B) erkek Ae. aegypti ROCK (n = 880) ve IICC (n = 569) suşları. Deltametrin testi konsantrasyonları 0.00075 ng / μL ila 9.68705 ng / μL arasında değişmiştir ve ortalama sivrisinek kütlesi (mg) başına uygulanan deltametrin dozu (ng) x eksenine yansıtılmıştır. Mortalite y ekseninde bir oran olarak gösterilir. Her veri noktası kümesindeki siyah çizgi, gerinimi ve cinsiyete özgü doğrusal regresyonu temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Topikal uygulama biyotahlili kullanılarak meyve sineklerinin temsili verileri. Deltametrin ve meyve sinekleri kullanılarak yukarıdaki protokolü takiben topikal uygulama biyotahlilinden elde edilen temsili doz-yanıt verileri: D. melanogaster Kanton-S suşu (n = 1014). Deltametrin testi konsantrasyonları 0.00499 ila 5.02876 ng / μL arasında değişmiştir ve ortalama meyve sineği kütlesi (mg) başına uygulanan deltametrin dozu (ng) x eksenine yansıtılmıştır. Mortalite y ekseninde bir oran olarak gösterilir. Siyah çizgi doğrusal regresyonu temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Masaüstü böcek taşıma çadırı. Masaüstü böcek taşıma çadırı, topikal uygulama testi sırasında kaçan sivrisineklerin veya sineklerin daha kolay yakalanması için kullanılır. Yapı A'da kapalı ve B'de açıktır. Bu yapı PVC boru ve ince örgü kumaş ile inşa edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: Şırınga ve tekrarlayıcı aplikatör ünitesi. Şırınga ve tekrarlayıcı aplikatör ünitesi böceklerin dozlanması için kullanılır. Ana parçalar arasında 1) iğne, 2) şırınga namlusu, 3) piston, 4) tekrarlayıcı ve 5) tekrarlayıcı düğmesi bulunur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Randomizasyon komut dosyası: Her denemenin tüm fincanları için önyargısız etiketler oluşturmak üzere rastgele komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Mortalite puan tablosu: Mortalite değerlendirmesine yardımcı olmak için mortalite puan tablosu. Sayfa ayrıca, insektisit uygulamasının başlangıç ve bitiş zamanları gibi protokolde belirtildiği gibi, kaydedilecek diğer tüm önemli bilgileri kaydetmek için yerler içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: Örnek mortalite verileri: Şekil 2'yi oluşturmak için kullanılan örnek veri dosyası. Sütun başlığı açıklamaları aşağıdaki gibidir: "id" = her veri noktasının tanımlama kodu; "tür" = tür adı (örneğin, Aedes aegypti); "insektisit" = topikal olarak uygulanan insektisitin adı (örneğin, Deltametrin); "suş" = sivrisinek suşunun adı (örneğin, ROCK); "tarih" = başlangıç tarihi topikal başvuru; "seks" = sivrisineklerin cinsiyeti; "yaş" = sivrisineklerin yaşı (genç = 3-5 günlük; yaşlı = 4 haftalık); "total.mosq" = toplu olarak tartılan toplam sivrisinek sayısı; "ağırlık" = parti içindeki tüm sivrisineklerin ağırlığı (mg); "konsantrasyon" = insektisit konsantrasyonu (μg / mL); "şırınga" = şırınganın damlacık hacmi (mL); "doz" = her sivrisineğe (ng) uygulanan insektisit aktif bileşen miktarı; "toplam" = her bardaktaki sivrisinek sayısı; "ölü" = her bardaktaki ölü sivrisinek sayısı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 4: R analiz kodu: Probit analizini tamamlamak için kullanılabilecek örnek R kodu (protokolün 8. adımında açıklandığı gibi). Temsili sonuçlar (ek örnek veri dosyası aracılığıyla erişilebilir) bu R koduyla kullanılabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Bu yazıda sivrisinekler ve meyve sinekleri için topikal uygulama testi için uyarlanmış bir protokol sunulmaktadır. Bu prosedür, minimum özel ekipman gerektirdiğinden, sahada ve diğer organizmalarla kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Aşağıda bu protokolün kritik adımları, potansiyel değişiklikleri, sorun giderme önerileri, yöntemin sınırlamaları ve bu yöntemin önemi ele alınmıştır.

Protokoldeki kritik adımlar: Protokolde, yanlış tamamlanırsa, biyotahlilin sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilecek üç kritik adım vardır: insektisit konsantrasyon doğruluğu, numune nakavtı ve mortalite değerlendirmesi.

İnsektisit konsantrasyonu doğruluğu:
Tekrarlanabilir doz-yanıt eğrileri ve anlamlı sonuçlar elde etmek için doğru insektisit çözeltilerine sahip olmak son derece önemlidir. İnsektisit çözeltisi hazırlamaya hacimsel yaklaşım, hem CDC şişe biyotahlili⁷ hem de topikal uygulamalar^13,14,43 için literatürde daha yaygındır. Bununla birlikte, burada açıklanan gravimetrik yaklaşım, (sıcaklığa özgü) yoğunluğun dahil edilmesi yoluyla sıcaklığın dikkate alınması nedeniyle doğal olarak daha doğrudur ve bu da daha doğru formülasyon hazırlığına yol açar.

Örnek nakavt:
Numunelerin yıkılması, bu yöntemin kritik bir bileşenidir ve insektisit ve ağırlık ölçümlerinin doğru bir şekilde uygulanmasını sağlar. Bununla birlikte, organizmaları devirmek kaçınılmaz olarak, daha önce gösterildiği gibi fiziksel stres ve hasar riski içerir³⁰. Bu nedenle, i) her numunenin benzer bir süre boyunca devrilmesini, ii) nakavt süresinin minimumda tutulmasını ve iii) nakavt yönteminin tüm numuneler arasında tutarlı olmasını sağlamak için numuneleri devirirken dikkatli ve dikkatli olun. Ek olarak, yöntemin başarılı olduğundan ve% 10'dan fazla kontrol mortalitesine neden olmadığından emin olmak için insektisit uygulamasından önce knockdown yönteminin ayrı ayrı test edilmesi önerilir. İlk test deneyimsiz bir kullanıcı için daha uzun sürebilir ve bu da daha uzun nakavt sürelerine yol açabilir. Bu nedenle, ilk tahlillerden elde edilen sonuçları yorumlarken dikkatli olun.

Mortalite değerlendirmesi:
Ölüm oranını değerlendirmek, özellikle insektisit tamamen öldürmediğinde, ancak sadece sivrisinek veya sineği devirdiğinde veya sakat bıraktığında zor olabilir. Bu nedenle, insektisitin hedef organizmayı nasıl etkilediğinin farkında olmak ve başlamadan önce "ölü" (veya yıkılmış) organizmalar için net bir tanıma sahip olmak önemlidir. Ek olarak, varyasyonu azaltmak için aynı kişinin dozlar ve replikasyonlar arasındaki mortaliteyi değerlendirmesi önerilir.

Protokol değişiklikleri: Çok yönlülüğünü ve erişilebilirliğini artırmak için bu protokole aşağıda açıklanan çeşitli değişiklikler uygulanabilir.

Tahlilin daha küçük veya daha büyük boyutlu böceklere uyarlanması:
Daha küçük veya daha büyük örnekler kullanıldığında, sırasıyla daha küçük veya daha büyük bir doz insektisit hacminin uygulanması tavsiye edilir. Örnek olarak, 0.5 μL dozunu 0.2 μL'lik bir doza düşürerek sivrisinek protokolünü meyve sineklerine uyarladık. Seçilen doz hacmi için doğru şırınga boyutunun seçildiğinden emin olun.

Tahlilin tarla böceklerine uyarlanması:
Tarla böcekleri kullanırken, böcek boyutunda daha fazla değişiklik olabilir. Bu nedenle, böceklerin büyük bir grup yerine daha küçük gruplar halinde (örneğin, fincan başına) tartılması önerilir (örneğin, bir deney için kullanılan tüm böcekler). Bu, tarla böcek kütlesindeki farklılıklarla ilişkili insektisit duyarlılığındaki potansiyel varyasyonun yakalanmasına yardımcı olabilir.

Ekipman modifikasyonları:
Böcek taşıma çadırı: Numunenin dozlanması, PVC boru ve cibinlik ile basitçe inşa edilmiş bir böcek taşıma çadırı altında tamamlanabilir. Bu, kapalı bir odaya (örneğin, böcek) bir alternatif olabilir ve böcek yetiştiriciliğinin meydana gelebileceği alanlarda potansiyel böcek ilacı kontaminasyonunu ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Bu böcek taşıma çadırının yapımı kolaydır ve düşük maliyetlidir (~ 70 $). Alternatif olarak, bir böcek taşıma kafesi satın alınabilir (~ 425 $).

Soğuk masa: Buz paketleri veya buz tepsileri, numuneyi devirmek ve / veya numuneyi devirmek için kullanılabilir.

İnkübatör: İnkübatörler, inhibisit tedavisinden sonra numunenin yetiştirilmesi ve numunenin 24 saat tutulması için önerilir. Bir inkübatör mevcut değilse, inşa edilebilir. İnkübatörü inşa etmek için gereken ekipman, yalıtımlı bir kap, nemlendirici, ısı kabloları, nem ve sıcaklık kontrolörü ve önceki yöntemleri takip ederek ve genişleterek toplam maliyeti ~ 170 $ 'a kadar çıkarması gereken bir ışık içerir⁴⁴.

Tutma bardakları: İşlem görmüş numuneyi sıralamak ve tutmak için plastik bardaklar kullanılsa da, balmumu kaplı kağıt bardaklar veya cam kaplar uygun alternatifler olacaktır.

Organizma ve yaşam evresi modifikasyonu:
Bu yöntem, Culex quinquefasciatus sivrisinekleri 32, ev sinekleri³² ve hamamböceği⁴⁵ gibi diğer vektörler, böcekler ve / veya eklembacaklılar ile ve ayrıca sivrisinek larvaları⁴⁶ gibi yetişkin olmayan yaşam aşamaları ile kullanım için çok uyarlanabilir.

Topikal uygulama konumu değişikliği:
Bu yöntem, insektisitin sivrisinekler için ventral toraks ve karın bölgesine (ve meyve sinekleri için dorsum) uygulanmasını açıklar. Ancak, maruz kalma sitesi tutarlı olduğu sürece diğer uygulama konumları kullanılabilir. Tutarlılık önemlidir, çünkü insektisit duyarlılığı uygulama konumuna bağlı olarak değişebilir³².

Sorun giderme önerileri: Bu yöntemin başlangıçta zorlayıcı olan birkaç adımı vardır. Aşağıda, karşılaşılabilecek en yaygın sorunlardan bazıları açıklanmaktadır.

Sızdıran / buharlaşan insektisit çözeltileri:
İnsektisitler genellikle oldukça uçucu bir bileşik olan aseton içinde çözülür. Bu, asetonun oda sıcaklığında hızla buharlaştığı ve zamanla insektisit konsantrasyonlarını arttırdığı anlamına gelir. İnsektisit çözeltileri sızıntı yapıyor veya buharlaşıyor gibi görünüyorsa, çözeltileri yeniden yapın, tüpün kapağının sıkıca açık olduğundan emin olun ve depolama protokollerinin uygun şekilde takip edilip edilmediğini iki kez kontrol edin (örneğin, parafilm kullanılıyor ve tüpler dik olarak saklanıyor). Sızıntı devam ederse, asetonun farklı sıcaklıklarda yaşadığı hacim değişikliği için daha fazla alana izin vermek için tüpleri daha düşük bir hacimle doldurmayı deneyin. Ek olarak, çözücü olarak aseton kullanılıyorsa, tüplerin aseton depolama için derecelendirildiğinden emin olun (örneğin, FEP, TFE ve PFA plastikleri). Hidrofobik böcek öldürücüler kullanıyorsanız, çözeltileri cam şişelerde saklayın (hidrofobik böcek öldürücüler cama plastikten daha az yapıştığından). Buharlaşmayı izlemek için depolamadan önce çözeltinin menisküsünü işaretlemek de iyi bir uygulamadır.

Organizmaları tartarken mikro terazide sürüklenen ağırlık:
Ölçekteki ağırlık okuması sürükleniyorsa (yavaşça yukarı veya aşağı gidiyorsa), bunun nedeni statik olabilir. Sürüklenme en sık plastik eşyalardaki organizmaları tararken meydana gelir, çünkü plastik statik bir yükü kolayca tutabilir. Bunu önlemek için, tartılan plastik kabın altına bir tartım kağıdı yerleştirilebilir veya cam gibi plastik olmayan bir kap kullanılabilir.

Anormal mortalite sonuçları:
Mortalite sonuçlarının anormal görünebileceği, kontrollerde yüksek mortalite veya tüm insektisit dozlarında yüksek / düşük mortalite gözlemlemek gibi birçok yol vardır. Her senaryoda sorun gidermek için aşağıdaki örnekleri gözden geçirin.

Yüksek kontrollü mortalite
Kontrol grubunda yüksek mortalite varsa (% 10 veya daha fazla), nakavt yöntemini ve örneklerin nakavt edilme süresini değerlendirin. Mümkünse, örneklerin devrildiği süreyi kısaltın. Kontrollerde yüksek mortalite için göz önünde bulundurulması gereken diğer potansiyel faktörler arasında i) inkübatör ayarlarının doğru olup olmadığının kontrol edilmesi - anormal sıcaklıklar ve / veya nem mortalitenin artmasına neden olabilir. Sıcaklık ve nem bağımsız bir datalogger ile kontrol edilmelidir. ii) Böcek kullanımının değerlendirilmesi. Böcekleri çok fazla veya çok kabaca ele almak, yüksek ölüm oranına yol açabilir. iii) Kontrol grubunu tedavi etmek için kullanılan %100 asetonda veya enstrümantasyonda insektisit kontaminasyonu olup olmadığını kontrol etmek. Asetonu değiştirin ve tüm aletleri aseton veya etanol ile temizleyin. Eldivenleri sık sık değiştirerek, dökülmeyi önleyerek ve aletleri temizleyerek kontaminasyonu önleyin. Ek Dosya 3'te, kontrol (yalnızca aseton) bardaklarında en fazla iki sivrisineğin öldüğünü unutmayın. Bu mortalite seviyesi yüksek olarak kabul edilmez (% 10'dan azdır) ve bu nedenle endişe için bir neden yoktur.

Maruz kalan tüm gruplarda yüksek mortalite (ancak kontrol gruplarında değil)
Test için daha düşük insektisit konsantrasyonları veya daha küçük doz hacimleri kullanın. Kullanılan dozajlar, mortaliteye neden olmayacak minimum dozun üzerinde olabilir. Doğru doz aralığını belirlemek ve kontaminasyonu dışlamak için birkaç 10 kat seyreltme kullanın. Kontaminasyonu önlemek için, en düşük konsantrasyonda dozlamaya başlayın ve en yüksek konsantrasyona doğru çalışın. Ek olarak, kullanılan tüm ekipmanların düzenli olarak aseton ve/veya etanol ile temizlendiğinden, numuneye uygulanan dozların çok küçük olduğundan ve en ufak bir çapraz kontaminasyonun bile sonuçları etkileyebileceğinden emin olun.

Maruz kalan tüm gruplarda düşük mortalite
Daha yüksek insektisit konsantrasyonları kullanın. Kullanılan dozajların hepsi popülasyonda mortaliteye neden olamayacak kadar düşük olabilir. Doğru doz aralığını belirlemek için, numuneleri birkaç kat daha 10 kat konsantre dozlara maruz bırakın. İnsektisit çözeltilerinin süresinin dolmadığından veya bozulmadığından emin olun (potansiyel olarak yüksek sıcaklık veya ışığa maruz kalma nedeniyle). Çözümlerin süresi dolmuşsa veya bozulduğundan şüpheleniliyorsa, çözümleri yeniden oluşturun ve uygun depolama koşullarına uyulduğundan emin olun.

Replikasyonlar/günler arasındaki tutarsız mortalite
Böceklerin insektisitlere maruz kaldığı günün zamanı, özellikle metabolik direnç için ifade edilen direnç seviyesini etkileyebilir³⁴. Mortalitedeki değişikliklere katkıda bulunan potansiyel bir değişken olarak günün saatinden kaçınmak için bu protokolü her gün aynı zaman penceresinde tekrarlayın. Replikalar arasındaki tutarsız mortaliteye katkıda bulunan diğer potansiyel faktörler arasında i) deneyler arasında farklı şekilde yetiştirilen örnekler bulunur. Tüm numunelerin aynı yaş aralığında olduğundan, aynı sıcaklıkta ve benzer yoğunluklarda ve gıda mevcudiyetinde yetiştirildiğinden emin olun. ii) aseton buharlaşması nedeniyle zamanla bozulan veya daha konsantre hale gelen insektisit konsantrasyonları. Çözümleri yeniden oluşturun ve uygun depolama koşullarını sağlayın. iii) Tutarsız mortalite puanlaması. Aynı kişinin ölüm oranını puanladığından emin olun veya ekip genelinde tutarlı bir şekilde kullanılacak net bir protokol geliştirin. Mortalite puanlamasında önyargıyı azaltmak için kör skorlamayı kullanın.

Sıralama tepsisinin yüzeyine yapışan böcekler:
Aseton Petri yemekleri gibi bu protokolde kullanılan plastiklere tepki verir. Petri kaplarında veya benzer plastik yüzeylerde aseton kullanılıyorsa, numune muhtemelen yüzeye yapışacaktır. Bu yapışma, ayıklama tepsisini tartım kağıdıyla kaplayarak veya plastik olmayan bir ayıklama tepsisi kullanarak önlenebilir. Ek olarak, ayırma tepsisindeki veya tutma kaplarındaki plastiğin yüzeyindeki yoğuşma, böceklerin yoğuşmaya yapışmasına neden olabilir veya numune çok soğuk olabilir ve potansiyel olarak yüzeye donabilir. Numunelerin çok soğuk/donmuş olmasını önlerken yoğuşmayı azaltmak için knockdown yöntemini ayarlayın (ör. numuneler ile plastik ayıklama tepsisi arasına tartım kağıdı yerleştirin).

R analizi hataları:
Mortalite verileri toplandıktan sonra, analiz sırasında çeşitli komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Bir R kodunun veri dosyası için eylemleri tamamlayamamasının en yaygın nedeni, veri biçiminin kodla eşleşmemesidir (örneğin, sütun başlıkları ve/veya boş hücreler). Daha ciddi komplikasyonlar ortaya çıkarsa, Rstudio^35'te yerleşik olarak bulunan R yardım sayfalarına bakın.

Yukarıda açıklanan topikal uygulama yönteminin sınırlamaları:
Topikal uygulama yöntemi ile insektisit emilimi doğal maruziyeti taklit etmez:
Birincil vücutta topikal uygulama, insektisit emiliminin doğal yolu değildir. Sahada, böcekler çoğunlukla insektisitleri, insektisitle muamele edilmiş yüzeyle temas halinde oldukları süre boyunca bacaklarından veya kanatlarında, ventral yüzeyde hızlı bir şekilde maruz kalmak yerine, küçük aerosol parçacıkları ^47,48 yoluyla emer. Bununla birlikte, bilinen bir insektisit dozunun doğrudan uygulanması, genetik ve evrimsel çalışmalar veya uzay veya zaman boyunca insektisit duyarlılığının karşılaştırılması için gerekli olan insektisitlere fenotipik bir yanıtı doğru bir şekilde oluşturacaktır. Bu nedenle, bu yaklaşım teknik direnci test etmek için faydalıdır, ancak pratik direnci doğrudan ölçmez (gerçek müdahale aracının bir saha ayarındaki etkinliği¹⁵). Bununla birlikte, mevcut standart yöntemlerin (örneğin, DSÖ tüp testleri ve CDC şişe biyotahlilleri) de sahadaki aerosol insektisit maruziyetini (yani sisleme yoluyla) yakalayamayacağını veya taklit edemeyeceğini belirtmek önemlidir.

Topikal uygulama testleri sadece temas absorpsiyon insektisitlerini değerlendirebilir:
Bu yöntem, insektisitin teması ve emilimi yoluyla çalışan ve çekici toksik şeker yemlerinde yaygın olarak kullanılan borik asit gibi oral insektisitlerle kullanım için tasarlanmamıştır⁴⁹.

Yöntemin önemi:
Topikal uygulama yöntemi, ölümcül dozu (konsantrasyon değil) hesaplayarak ve teknik (pratik olmayan) direnci ölçerek insektisit biyotahlilleri için iyi kurulmuş standartları genişletir¹⁵. Aşağıda verilmiştir, bu yöntemin mevcut insektisit duyarlılık testlerine göre avantajları ve dezavantajları verilmiştir.

Ölümcül doz hesaplaması:
Bu yöntem, CDC ve WHO biyotahlillerinin ayırıcı doz^11'i oluşturmak için kullandığı ölümcül konsantrasyondan ziyade, insektisitin ölümcül dozunu belirler. Ölümcül doz daha anlamlıdır, çünkü mortaliteyi ortaya çıkardığı bilinen niceliklendirilmiş bir insektisit miktarıdır. Buna karşılık, ölümcül konsantrasyon, organizmanın gerçekte ne kadar böcek ilacı edindiğini dikkate almaz. Ölümcül doz hesaplamasını kullanırken, cinsiyete veya boyuta bağlı duyarlılık profilleri arasındaki farklar daha doğru bir şekilde gözlemlenebilir ve ölçülebilir, bu da bu ölçümü daha da çok yönlü hale getirir.

Teknik direnç:
Bu yöntem, standartlaştırılmış, kontrollü ortamlarda ölçülen direnç olan teknik direnci değerlendirir. Bu tür ölçümler, insektisit direncinin yayılmasının gözetimi ve fenotipik direncin potansiyel belirteçlerle ilişkilendirilmesi için uygundur¹⁵. Topikal uygulama biyotahlilinden kaynaklanan mortalitedeki azalmış varyasyon nedeniyle, yeni direnç belirteçlerinin daha iyi tanımlanmasını sağlar. Bununla birlikte, insektisitlerin sivrisineğe doğal olmayan bir şekilde maruz kalması nedeniyle, bu tahlil, belirli bir popülasyonda spesifik bir müdahalenin etkinliğinin tahmini için uygun değildir. Bu tür pratik direncin ölçümleri için başka tahlillere ihtiyaç vardır¹⁵.

Numune uyarlanabilirliği:
Bu yöntem, mahsul zararlıları (örneğin, Colorado Patates böceği), ev zararlıları (örneğin, hamamböceği ve yatak böcekleri) veya tozlayıcılar (örneğin, arılar) gibi diğer önemli eklembacaklılarda, nakavt yaklaşımında ve / veya böcek ilacı dozunda, hacminde ve / veya konsantrasyonunda (yukarıda açıklandığı gibi) basit değişikliklerle uygulanabilir. Uyarlanabilirlik kolaylığı, farklı araştırma alanlarında insektisit direnci araştırmalarını analojize etmeye yardımcı olabilir. Örneklerin% 50'sini öldüren ölümcül bir konsantrasyon yerine LD 50 değerinin kullanılması (LC₅₀), türler arasında doğru karşılaştırmaya izin verir.

Masraf:
CDC şişe biyotahlillerine ve WHO tüp testlerine benzer şekilde, topikal uygulama tahlilini çalıştırma maliyetleri minimumdur ( Malzeme Tablosuna bakınız). Temel ekipman parçaları, tahliller arasında yeniden kullanılabilen şırınga (yaklaşık 70 $) ve dağıtıcıdır (yaklaşık 100 $).

Gerekli numune sayısı:
Topikal uygulama tahlil kabı başına en az 20-25 örnek kullanılmalıdır. Deney başına en az beş insektisit konsantrasyonunun test edilmesi önerilir, prosedür için en az üç kopya önerilir. Genel olarak, bu, WHO tüp testleri veya CDC şişe biyotahlilleri kullanarak direnç yoğunluğu testleri yapmak için gereken numune sayısıyla karşılaştırılabilir, tam bir test için gereken en az 300-375 numune ile sonuçlanır. Bununla birlikte, topikal uygulama biyotahlili ile azaltılmış değişkenlik elde edilirse, aynı sayıda örnek, uzay veya zaman boyunca duyarlılık verilerini karşılaştırmak için daha fazla istatistiksel güce yol açabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri	Thomas Scientific	20A00L068	Aseton alikot depolama
1.5 mL vidalı kapaklı tüpler	Thomas Scientific	1182K23	İnsektisit seyreltme depolaması
15 mL konik tüpler	VWR	339651	İnsektisit seyreltme depolaması
20 mL cam sintilasyon şişeleri	Fisher Scientific	0334125D	Meyve sineği tartımı
25 μ L şırınga	Fisher Scientific	14815288	Topikal aplikatör
Aseton	Fisher Scientific	AC423240040	ACS %99.6, 4 L
Aedes aegypti< / em> (IICC suşu)	USDA CMAVE	NA	Böcek ilacına dirençli
Aedes aegypti< / em> (Rockefeller suşu)	CDC	NA	Böcek ilacına duyarlı
Analitik ölçek	Fisher Scientific	14-557-409	0,1 mg'a kadar hassasiyet
Aspiratör	Amazon	6.49986E+11	Sivrisinek toplama cihazı
Tezgah kağıdı	VWR	89126-794	Çalışma alanının altına yerleştirin
Pamuklu çubuklar	Amazon	B092S8JVQN	Böcekleri ayırmak için kullanın
Pamuk yünü topları	Amazon	B0769MKZWT	Sükroz çözeltisi
Dispenser	Fisher Scientific	1482225	Tekrarlayıcı pipetleyici
Drosophila melanogaster (Kanton-S suşu)	University of Wisconsin-Madison	NA	Böcek ilacına duyarlı
İnce uçlu boya fırçaları	Amazon	B07KT2X1BK	Böcekleri ayırmak için kullanın
Meyve sineği stok şişeleri	Fisher Scientific	AS355	Yetiştirme ve sıralama için kullanın meyve sinekleri
Elde taşınan CO2< / sub> dağıtıcı	Fisher Scientific	NC1710679	Böcekleri devirmek için kullanın Bardakları
tutma	Amazon	B08DXG7V1S	Şeffaf plastik
Buz torbası	Amazon	B08QDWMMW5	Meyve sineklerini devirmek için kullanın
Buz tepsileri	Amazon	9301085269	Böcekleri devirmek için kullanın
Böcek forseps	Amazon	B07B4767WR	Böcek forseps
Böcek ilacı	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltametrin
Etiketleme çıkartmaları	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4 "Renkli nokta çıkartmaları
Etiketleme bandı	Amazon	B00X6A1GYK	Beyaz bant
Ağ	Amazon	B07F2PHHWV	Tutma kaplarını ve böcekleri örtmek için kullanın Taşıma çadırı
Petri kapları	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
PVC Boru	Lowe ' s	23971	Böcek taşıma çadırı malzemeleri
Lastik bantlar	Amazon	B00006IBRU	Bardaklarda ağ / ağı sabitlemek için kullanın
Sükroz	Amazon	B01J78INO0	Toz Beyaz Şeker
Tartı kağıdı	VWR	12578-165	4 "x 4"