Method Article

Yumuşak Madde Nanoindentasyonu için Deneysel ve Veri Analizi İş Akışı

DOI:

10.3791/63401

⸱

January 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, hidrojeller ve hücreler de dahil olmak üzere yumuşak malzeme nanogirinti deneyleri için eksiksiz bir iş akışı sunar. İlk olarak, kuvvet spektroskopisi verilerini elde etmek için deneysel adımlar detaylandırılmıştır; Daha sonra, bu tür verilerin analizi, GitHub'dan ücretsiz olarak indirilebilen yeni geliştirilen açık kaynaklı bir Python yazılımı aracılığıyla detaylandırılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanogirinti, yumuşak biyomalzemelerin ve hücrelerin yerel mekanik özelliklerini ölçmek için bir mikrometrik kuvvet probunun kullanıldığı bir deneysel teknikler sınıfını ifade eder. Bu yaklaşım, tek hücrelerin boyutuyla (μm) karşılaştırılabilir bir çözünürlüğe sahip yumuşak malzemelerin uygun bir mekanik karakterizasyonunu elde etmek için mekanobiyoloji, biyomalzeme tasarımı ve doku mühendisliği alanlarında merkezi bir rol kazanmıştır. Bu tür deneysel verileri elde etmek için en popüler strateji, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanmaktır; Bu cihaz kuvvette (pN'ye kadar) ve uzayda (alt-nm) benzeri görülmemiş bir çözünürlük sunarken, kullanılabilirliği genellikle Young Modülü (E) gibi mekanik özelliklerin integral göstergelerinin rutin ölçümlerini önleyen karmaşıklığı ile sınırlıdır. Optik fiber algılama teknolojisine dayananlar gibi yeni nesil nanoindenterler, son zamanlarda μm uzamsal çözünürlüğe sahip alt-nN kuvvetlerinin uygulanmasına izin verirken, entegrasyon kolaylığı nedeniyle popülerlik kazanmıştır, bu nedenle hidrojellerin ve hücrelerin yerel mekanik özelliklerini araştırmak için uygundur.

Bu protokolde, ticari olarak temin edilebilen bir yüksük üstü optik fiber algılama nanoindenter kullanarak hidrojeller ve hücreler hakkında nanogirinti verilerini elde etmek için deneysel prosedürü detaylandıran adım adım bir kılavuz sunulmaktadır. Bazı adımlar burada kullanılan cihaza özgü olsa da, önerilen protokol, bazı adımların üreticinin yönergelerine göre uyarlanması koşuluyla, diğer nanoindentasyon cihazları için bir rehber olarak alınabilir. Ayrıca, nanogirinti verilerinin analizi için kullanıcı dostu bir grafik kullanıcı arayüzü ile donatılmış yeni bir açık kaynaklı Python yazılımı sunulmaktadır; bu, yanlış edinilmiş eğrilerin taranmasına, veri filtrelemeye, temas noktasının farklı sayısal prosedürlerle hesaplanmasına, E'nin geleneksel hesaplamasına ve özellikle tek hücreli nanogirinti verileri için uygun daha gelişmiş bir analize olanak tanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekaniğin biyolojideki temel rolü günümüzde 1,2 olarak belirlenmiştir. Tüm dokulardan tek hücrelere kadar, mekanik özellikler incelenen biyomateryalin patofizyolojik durumu hakkında bilgi verebilir 3,4. Örneğin, kanserden etkilenen meme dokusu, popüler palpasyon testinin temeli olan bir kavram olan sağlıklı dokudan daha serttir5. Özellikle, son zamanlarda, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu koronavirüs hastalığı 2019'un (COVID-19), SARS-CoV-2-naif bireylerden gelen kan hücrelerine kıyasla ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nanogirinti ölçümleri için substratların / hücrelerin hazırlanması

  1. Nanogirinti deneyleri için PAAm hidrojellerinin / hücrelerinin hazırlanması için Ek Protokolde verilen adımları izleyin. Prosedür Şekil 2'de özetlenmiştir.
    NOT: PAAm hidrojelleri, mekanobiyoloji alanında kullanılan en yaygın hidrojeller oldukları için seçilmiştir. Bununla birlikte, protokol her türlü hidrojel25 için eşit derecede geçerlidir (bkz.

2. Cihazın başlatılması, prob seçimi ve prob kalibrasyonu

  1. Cihazı başlatmak içi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolü takiben, bir dizi F-z eğrisi elde edilir. Veri kümesi büyük olasılıkla iyi eğriler ve analize devam etmeden önce atılacak eğriler içerecektir. Genel olarak, şekilleri Şekil 4A'da gösterilenden farklıysa eğriler atılmalıdır. Şekil 5AI, NanoPrepare GUI'ye yüklenen beklenen E 0.8 KPa35'in yumuşak bir PAAm hidrojeli üzerinde elde edilen ~ 100 eğriden oluşan bir veri kümesini göstermektedir. Çoğu eğri net, düz bir t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hem hidrojeller hem de tek hücreler üzerinde ticari olarak temin edilebilen bir yüksük üstü nanoindenter kullanarak kuvvet spektroskopisi nanogirinti verilerinin sağlam bir şekilde nasıl elde edileceğini göstermektedir. Ek olarak, nanogirinti verilerinin analizi için kesin bir iş akışı içeren Python'da programlanmış açık kaynaklı bir yazılımın kullanımı için talimatlar sağlanmaktadır.

Protokoldeki kritik adımlar
Aşağıdaki adımların, bu protokolü izlerken özelli.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GC ve MAGO CeMi'nin tüm üyelerini kabul eder. MSS, EPSRC Programı Hibesi (EP/P001114/1) aracılığıyla destek kabul eder.

GC: yazılım (yazılım geliştirme ve algoritmalara katkı), biçimsel analiz (nanogirinti verilerinin analizi), doğrulama, Araştırma (poliakrilamid jeller üzerinde nanogirinti deneyleri), veri kürasyonu, yazma (orijinal taslak, gözden geçirme ve düzenleme), görselleştirme (şekil ve grafikler). MAGO: araştırma (jellerin ve hücre örneklerinin hazırlanması, hücreler üzerinde nanoindentasyon deneyleri), yazma (orijinal taslak, gözden geçirme ve düzenleme), görselleştirme (şekil ve grafikl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm lamellerVWR631-1577P
35 mm hücre muameleli kültür kaplarıGreiner CELLSTAR627160
AkrilamidSigma-AldrichA4058
AkrilsilanAlfa AesarL16400
Amonyum PersülfatMerk7727-54-0
BisakrilamidMerk110-26-9
Chiaro nanoindenterOptik 11 Ömür  katalog numarası yok
Etanolgenel
Fetal sığır serumuGibco16140071
Yüksek glikozlu DMEMGibco 11995065
İzopropanolgenel
KimwipeKimberly Clark21905-026
Mikroskop cam slaytlarıVWR631-1550P
MilliQ sistemiMerk MilliporeZR0Q008WW
OP1550 İnterferometreOptik11 Lifekatalog numarası yok
Optik 11 Ömür probu (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)Optik 11 Hayatkatolog numarası yok
Optik 11 Hayat sondası (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)Optik 11 Lifekatolog numarası yok
Penisilin/StreptomisinGibco15140122
RainX yağmur iticiRainX26012
Standart petri kapları (90 mm)Thermo Scientific101RTIRR
TetrametiletilendiaminSigma-Aldrich110-18-9
Vakum kurutucuThermo Scientific531-0250
Software
Veri toplama yazılımı (v 3.4.1)Optics 11 Life
GitHub Desktop (İsteğe bağlı)Microsoft
Python 3Python Software Foundation
Visual Studio Code (İsteğe bağlı)Microsoft

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  3. Gu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soft Matter NanoindentationNanoindentation WorkflowAtomic Force MicroscopyOptical Fiber NanoindenterYoung s ModulusMechanical PropertiesHydrogel StiffnessCell NanoindentationHertz ModelElasticity Spectra

Related Articles