Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı
Bu makalede
Özet
Özet
Canlı bir tümör mikroortamında çok sayıda hücre tipi ve hücre dışı matriks (ECM) arasındaki karmaşık ve dinamik fizyolojik etkileşimleri görselleştirme yeteneği, tümör progresyonunu düzenleyen mekanizmaları anlamak için önemli bir adımdır. Bu, mevcut intravital görüntüleme teknikleriyle gerçekleştirilebilse de, dokuların heterojen doğası ve deneysel gözlem içindeki mekansal bağlama duyulan ihtiyaç nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, kollajen ikinci harmonik jenerasyon görüntülemeyi, metabolik ko-faktör NAD(P)H'den endojen floresanı ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunu (FLIM) tümör mikroçevresini tümör yuvasının, çevresindeki stroma veya ECM'nin ve vaskülatürün temel alanlarına invaziv olmayan bir şekilde bölümlere ayırmak için bir araç olarak eşleştiren intravital bir görüntüleme iş akışı geliştirdik. Bu non-invaziv protokol, meme tümörü modellerinin hızlandırılmış görüntülerinin elde edilmesinden işlem sonrası analiz ve görüntü segmentasyonuna kadar uzanan adım adım süreci detaylandırır. Bu iş akışının birincil avantajı, eksojen floresan etiketler kullanmadan dinamik olarak değişen canlı tümör mikro ortamını bağlamsallaştırmak için metabolik imzalardan yararlanmasıdır, bu da onu insan kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri ve dışsal floroforların kolayca uygulanamadığı gelecekteki klinik kullanım için avantajlı hale getirir.
Giriş
Tümör mikroortamındaki hücre dışı matriksin (ECM), hastalığın ilerlemesini daha da kolaylaştırmak için çoklu hücre tipleri tarafından dinamik olarak biriktirildiği ve yeniden şekillendirildiği bilinmektedir 1,2,3. Bu matris değişiklikleri, hücre davranışını değiştiren ve sıklıkla matris yeniden şekillenmesinin devam eden bir döngüsüyle sonuçlanan hem mekanik hem de biyolojik ipuçları sağlar4. Tümör hücreleri ve hücre dışı matriks arasındaki dinamik, karşılıklı etkileşimin araştırılması genellikle üç boyutlu (3D) in vitro kültür veya mikroakışk....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Açıklanan tüm deneyler Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan deneylerinde refah ve ağrı yönetimi her şeyden önemlidir. Bu nedenle, prosedürün her adımında hayvanın rahat ve bakımlı olduğundan emin olmak için her türlü çaba gösterilmektedir.
1. Meme görüntüleme penceresinin oluşturulması (MIW)
- Meme görüntüleme penceresini inşa etmek için, cerrahi sınıf paslanmaz çelikten 14 mm'lik bir halka imal edin.
- İşlenmiş pencere çerçevesini %5'lik sıcak bir temizleme deterjanı çözeltisi kullanarak temizleyin, akan deiyonize su (DI) altında 10....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MIW'nin kurulumu ve temel deneysel planlama bu süreçteki ilk adımlardır. Bu özel MIW tasarımı ve protokolü, uzunlamasına çalışmalara19 daha uygundur ve hem dik hem de ters mikroskoplarla başarıyla kullanılmıştır. Bu durumda, daha az solunum artefaktı ile meme bezinin daha fazla görüntü stabilitesine neden olduğu için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılmıştır. Şekil 1A'da, rijit MIW'nin boyutlarını ve implantasyon işlemine grafiksel bir genel bakış sunuyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
4D intravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin mekansal ve zamansal bağlamındaki dinamik fizyolojik etkileşimleri araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu makale, tümör kütlesi, bitişik stroma veya vasküler ağa yakın dinamik hücre etkileşimlerini sadece ikinci harmonik jenerasyondan veya NAD (P) H otofloresansından gelen endojen sinyalleri kullanarak bölümlere ayırmak için çok temel ve uyarlanabilir bir operasyonel çerçeve sunmaktadır. Bu protokol, görüntüleme penceresinin implantasyonundan görüntü toplama, analiz v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, bu çalışmayı finanse etmek için NCI R01 CA216248, CA206458 ve CA179556 hibelerini kabul etmek istiyor. Ayrıca, Dr. Kevin Eliceiri ve görüntüleme grubuna, intravital programımızın erken gelişimindeki teknik uzmanlıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Ben Cox'a ve Morgridge Araştırma Enstitüsü'ndeki Eliceiri İmalat Grubu'nun diğer üyelerine, MIW'nin ilk aşamalarındaki temel teknik tasarımları için teşekkür ederiz. Dr. Ellen Dobson, ImageJ eğitilebilir WEKA segmentasyon aracı hakkında yararlı konuşmalara yardımcı oldu. Ayrıca, mikroskoplarını zamanında kullandıkları için Dr. Melissa Skala ve Dr. Alexa Barres-Heaton'a teşekkür ederiz. Son olarak, fare kullanım....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| # 1.5 12mm yuvarlak kapak camı | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW yapısı |
| SQ enjeksiyonu için 1.0 mL şırınga | BD | 309659 | Şırınga |
| 20x objektif | Zeiss | 421452-988 | SQ enjeksiyonu için suya daldırma |
| 27G iğne | Covidien | 1188827012 | İğnesi |
| 40x objektif | Nikon | MRD77410 | Suya daldırma |
| 5-0 ipek örgülü sütür | MIW implantasyonu için | Ethicon | K870 |
| Yapay gözyaşı jeli | Akorn | NDC 59399-162-35 | Göz jeli |
| Betadine çözeltisi, %5 | Fisher Scientific | NC1558063 | Cerrahisi antiseptik |
| pamuk uçlu aplikatör | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | Loctite | 1365882 | MIW yapımı |
| floresan dekstran | Sigma | T1287-50mg | vasküler forsepslerin intravenöz etiketlenmesi |
| Mckesson.com | Miltex #18-782 | paslanmaz, 4 inç, kavisli | |
| GaAsP fotoçoğaltıcı tüp | Hamamatsu | ||
| ısıtma battaniyesi | CARA 72 ısıtma yastığı | 038056000729 | Sıcaklık seçilebilir |
| ısıtma odası | ev yapımı | ||
| Floresan ömür boyu el kitabı | Becker ve Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
| ters mikroskop tabanı | Nikon | ||
| Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anestezi |
| Liqui-Nox | Fisher Bilimsel | 16-000-125 | MIW temizleme |
| Meloksikam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analjezik |
| Mikro Hortum | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
| çoklu foton tarama kafası | Bruker Ultima II | Çoklu foton tarama kafası ve görüntüleme platformu | |
| NADH FLIM filtresi | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
| Nair | CVS | 339826 | Tüy dökücü krem |
| objektif ısıtıcı | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
| SHG/FAD filtresi | Chroma | 320740 | ET450/ 40m-2P |
| Sparkle cam temizleyici | Amazon.com | implante | MIW |
| SPC-150 foton sayma tahtası | Becker ve Hickl | ||
| cerrahi ışık | FAJ | B06XV1VQVZ | Manyetik LED deveboynu ışık |
| cerrahi mikro makas | Excelta | 366 | paslanmaz, 3 inç |
| Üçlü antibiyotik merhem | Actavis İlaç | NDC 0472-0179-34 | Antibiyotik |
| TV kateteri | Özel | BD 30G iğne: | TV enjeksiyonu için 305106 kateter |
| İki foton filtresi | Chroma | 320282 | ET585 / 65m-2P |
| iki fotonlu lazer | Tutarlı charmeleon | Ayarlanabilir multifoton lazer | |
| ultrason jeli | Parker | PKR-03-02 | Suya daldırma jeli |
| Üre kristaller | Sigma | U5128-5G | İsteğe bağlı: FLIM IRF |
Kaynaklar
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
- Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous mat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
