Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

2.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63413

⸱

24 Mayıs 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Bu makalede

Özet

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Özet

Canlı bir tümör mikroortamında çok sayıda hücre tipi ve hücre dışı matriks (ECM) arasındaki karmaşık ve dinamik fizyolojik etkileşimleri görselleştirme yeteneği, tümör progresyonunu düzenleyen mekanizmaları anlamak için önemli bir adımdır. Bu, mevcut intravital görüntüleme teknikleriyle gerçekleştirilebilse de, dokuların heterojen doğası ve deneysel gözlem içindeki mekansal bağlama duyulan ihtiyaç nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, kollajen ikinci harmonik jenerasyon görüntülemeyi, metabolik ko-faktör NAD(P)H'den endojen floresanı ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunu (FLIM) tümör mikroçevresini tümör yuvasının, çevresindeki stroma veya ECM'nin ve vaskülatürün temel alanlarına invaziv olmayan bir şekilde bölümlere ayırmak için bir araç olarak eşleştiren intravital bir görüntüleme iş akışı geliştirdik. Bu non-invaziv protokol, meme tümörü modellerinin hızlandırılmış görüntülerinin elde edilmesinden işlem sonrası analiz ve görüntü segmentasyonuna kadar uzanan adım adım süreci detaylandırır. Bu iş akışının birincil avantajı, eksojen floresan etiketler kullanmadan dinamik olarak değişen canlı tümör mikro ortamını bağlamsallaştırmak için metabolik imzalardan yararlanmasıdır, bu da onu insan kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri ve dışsal floroforların kolayca uygulanamadığı gelecekteki klinik kullanım için avantajlı hale getirir.

Giriş

Tümör mikroortamındaki hücre dışı matriksin (ECM), hastalığın ilerlemesini daha da kolaylaştırmak için çoklu hücre tipleri tarafından dinamik olarak biriktirildiği ve yeniden şekillendirildiği bilinmektedir 1,2,3. Bu matris değişiklikleri, hücre davranışını değiştiren ve sıklıkla matris yeniden şekillenmesinin devam eden bir döngüsüyle sonuçlanan hem mekanik hem de biyolojik ipuçları sağlar4. Tümör hücreleri ve hücre dışı matriks arasındaki dinamik, karşılıklı etkileşimin araştırılması genellikle üç boyutlu (3D) in vitro kültür veya mikroakışkan sistemler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu aşağıdan yukarıya yaklaşımlar ECM yeniden şekillenme mekanizmalarını göstermiş olsa da 5,6,7, artmış proliferasyon8, epitelden mezenkimal geçişegeçiş 9,10,11,12 ve tümör hücresi migrasyonu ve invazyonu 7,13,14,15,16 , odak noktaları öncelikle fizyolojik bir doku içinde bulunan etkileşimlerin çeşitliliği ve heterojenliği ile karşılaştırıldığında homojen bir 3D matris içindeki birkaç hücre tipi (örneğin, tümör hücreleri veya fibroblastlar) üzerinde olmuştur. İn vitro sistemlere ek olarak, ex vivo tümör histolojisi de bu hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri hakkında bazı bilgiler sağlayabilir17. İmmünohistokimya, ECM'nin mekansal olarak heterojen bileşimi ve mimarisi açısından çoklu hücre tiplerini analiz edebilme avantajına sahiptir, ancak sabit dokunun statik sonlanım noktaları, hücreler ve mikroçevre arasındaki etkileşimlerin dinamik doğasını yakalamaz. İntravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin fizyolojik bağlamı içinde çeşitli ve dinamik etkileşimleri sorgulamak için kapıyı açmıştır.

İntravital tümör görüntülemenin yetenekleri hızla ilerlemektedir. Görüntüleme pencerelerinin tasarımındaki gelişmeler ve pencereleri implante etmek için cerrahi teknikler, çeşitli anatomik lokalizasyonlarda (yani primer tümör, lenf nodları, metastatik bölgeler18,19,20) uzun süreli uzunlamasına tümör görüntülemesini mümkün kılmıştır. Dahası, optik enstrümantasyonun çoklu boyutlarda (yani spektral, uzamsal floresan yoğunluğu ve kullanım ömrü) ve yüksek çözünürlükte ve hızda (video hızı) verileri görselleştirme ve toplama kapasitesi yaygın olarak erişilebilir hale gelmektedir. Gelişmiş teknoloji, fizyolojik bir ortamda hücre sinyalizasyonundaki ve fenotipik dinamiklerdeki hızlı değişiklikleri keşfetme fırsatı sunar. Son olarak, optogenetik araçların genişlemesi ve çok çeşitli genetik floresan yapılar, tümör mikro ortamında hücre göçünü yakalamak için spesifik hücre tiplerinin etiketlenmesine veya gelişim veya hastalık ilerlemesi sırasında hücre soyu izlemesine izin verir21,22. Bu araçların CRISPR / Cas9 teknolojisi ile birlikte kullanılması, araştırmacılara zamanında benzersiz hayvan modelleri oluşturma fırsatı sunar.

Tüm bu ilerlemeler, intravital görüntülemeyi dinamik ve fizyolojik hücresel etkileşimleri keşfetmek için giderek daha güçlü bir yöntem haline getirirken, bu biyolojik etkileşimlere doku düzeyinde mekansal, zamansal ve yapısal bağlam sağlayan stratejiler geliştirmeye hala önemli bir ihtiyaç vardır. Şu anda, birçok intravital görüntüleme çalışması, vaskülatüre floresan boyalar enjekte ederek veya fiziksel özellikleri tanımlamak için floresan proteinleri dışsal olarak eksprese eden fare modellerini kullanarak kan damarları gibi görsel işaretlerin eksikliğini telafi etmektedir. Enjekte edilebilir boyalar ve floresan dekstrans gibi substratlar, intravital koleksiyonlarda vaskülatürü başarılı bir şekilde etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır19, 23, 24. Ancak, bu yaklaşım sınırlama olmaksızın değildir. Birincisi, ek fare manipülasyonları gerektirir ve faydası kısa vadeli deneylerle sınırlıdır. Uzunlamasına çalışmalar için, fagositik hücrelerde dekstran birikimini veya zamanla çevre dokuya difüzyonu gözlemlediğimiz için floresan dekstran sorunlu olabilir25. Fare modeline eksojen floresan protein katılımı, floresan dekstransa alternatif olarak sunulmuştur, ancak kendi sınırlamalarını sunmaktadır. Fare modellerindeki eksojen floroforların mevcudiyeti ve çeşitliliği hala sınırlı ve oluşturulması pahalıdır. Ek olarak, PDX modelleri gibi belirli modellerde, genetik manipülasyonlar arzu edilmez veya mümkün değildir. Ayrıca, hücrelerdeki floresan veya biyolüminesan proteinlerin varlığının fare içinde yabancı olarak kabul edildiği ve immünokompetan fare modellerinde, bunun konakçı bağışıklık sisteminin tepkisine bağlı metastaz miktarını azalttığı gösterilmiştir26,27. Son olarak, uzamsal bağlam için veya sonraki verileri segmentlere ayırmak için kullanılan eksojen floresan proteinler veya floresan boyalar, genellikle ilginin fizyolojik etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilecek ışık spektrumunun asal aralıklarını işgal eder.

ECM'den gelen içsel sinyalin veya doku içindeki hücrelerden endojen floresanın kullanılması, daha derinlemesine hücresel ve mekansal analiz için intravital verileri segmentlere ayırmak için potansiyel bir evrensel etiketsiz aracı temsil eder. İkinci harmonik jenerasyon (SHG), ECM28'i görselleştirmek için uzun zamandır kullanılmaktadır. Daha sonra fiber organizasyonu 29,30,31'in karakterizasyonuna yardımcı olacak önemli araçların geliştirilmesiyle, yerel ECM yapısına göre hücre davranışını karakterize etmek mümkündür. Ek olarak, endojen metabolitten gelen otofloresan olan NAD (P) H, tümör mikro ortamını in vivo olarak bölümlere ayırmak için başka bir etiketsiz araç sağlar. NAD (P) H, tümör hücrelerinde parlak bir şekilde flüoresan eder ve büyüyen tümör yuvasının sınırlarını çevresindeki stroma21,32'den ayırt etmek için kullanılabilir. Son olarak, vaskülatür, tümör mikroortamında ve anahtar hücre tipine özgü etkileşimlerin yapıldığı yerde önemli bir fizyolojik yapıdır33,34,35. Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) veya kan plazmasının uyarılması, tümör vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılmıştır ve iki veya üç foton uyarımı (2P; 3P) kullanılarak kan akış hızlarının ölçülmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir36. Bununla birlikte, daha büyük kan damarları endojen floresan imzaları ile kolayca tanımlanabilirken, ince, değişken ve daha az floresan küçük kan damarlarının tanımlanması daha fazla uzmanlık gerektirir. Bu doğal zorluklar optimum görüntü segmentasyonunu engeller. Neyse ki, bu endojen floresan kaynakları (yani, kırmızı kan hücreleri ve kan plazması), vaskülatürün benzersiz fotofiziksel özelliklerinden yararlanan ve büyüyen intravital alet kutusuna yararlı bir katkı sağlayan floresan ömür boyu görüntüleme37 ile de ölçülebilir.

Bu protokolde, endojen floresan ve SHG gibi içsel sinyalleri açıkça kullanarak dört boyutlu (4D) intravital görüntülemenin segmentasyonu için bir iş akışı, edinimden analize kadar tanımlanmıştır. Bu protokol, PDX modellerinde olduğu gibi, eksojen floresanın pratik veya mümkün olmayabileceği bir meme görüntüleme penceresinden geçen uzunlamasına çalışmalar için özellikle uygundur. Bununla birlikte, burada özetlenen segmentasyon ilkeleri, tümör biyolojisini, doku gelişimini ve hatta normal doku fizyolojisini araştıran intravital kullanıcılar için geniş çapta uygulanabilir. Bildirilen analiz yaklaşımları paketi, kullanıcıların hizalanmış veya rastgele kollajen lifi konfigürasyonlarının bölgeleri arasındaki hücresel davranışı ayırt etmelerine, tümör mikro ortamının belirli bölgelerinde bulunan hücrelerin sayılarını veya davranışlarını karşılaştırmalarına ve vaskülatürü yalnızca etiketsiz veya içsel sinyal kullanarak tümör mikro ortamına eşlemelerine olanak sağlayacaktır. Birlikte, bu yöntemler meme bezinin 4D intravital görüntülemesinden elde edilen bilgi derinliğini en üst düzeye çıkarmak için operasyonel bir çerçeve oluştururken, ek eksojen etiketlere olan ihtiyacı en aza indirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Açıklanan tüm deneyler Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan deneylerinde refah ve ağrı yönetimi her şeyden önemlidir. Bu nedenle, prosedürün her adımında hayvanın rahat ve bakımlı olduğundan emin olmak için her türlü çaba gösterilmektedir.

1. Meme görüntüleme penceresinin oluşturulması (MIW)

  1. Meme görüntüleme penceresini inşa etmek için, cerrahi sınıf paslanmaz çelikten 14 mm'lik bir halka imal edin.
  2. İşlenmiş pencere çerçevesini %5'lik sıcak bir temizleme deterjanı çözeltisi kullanarak temizleyin, akan deiyonize su (DI) altında 10 dakika durulayın, 10 dakika boyunca %100 etanol içinde bekletin ve ardından bir ısı lambası altında kurutun. Kurutulmuş MIW çerçevesini otoklav yapın ve daha sonra kullanmak üzere saklayın.
  3. MIW kapak camını aşağıdaki gibi hazırlayın: #1.5 12 mm yuvarlak kapaklı camı 10 dakika boyunca% 100 etanol içinde bekletin, bir ısı lambası altında kurutun ve ardından siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak metal MIW çerçevesine sabitleyin. Yapıştırıcıyı gece boyunca kürleyin.
  4. Aseton ıslatılmış bir çubuk kullanarak monte edilmiş fazla yapıştırıcının MIW'sini temizleyin ve 10 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak temizleyin. Temizlenen pencerenin kurumasını bekleyin. MIW'yi önceden hazırlayın ve cerrahi implantasyondan önce steril bir Petri kabında saklayın.

2. MIW'nin cerrahi implantasyonu

  1. Otoklav cerrahi aletleri ve pencere implantasyonu için ameliyata başlamadan önce yüzeyleri% 70 etanol ile sterilize edin.
  2. Steril bir alanla kaplı bir ısınma battaniyesi kullanarak sterilize edilmiş bir masa üstünde ameliyat yapın. Isınma battaniyesini, steril alanın üstünde ölçülen sıcaklık 40 °C olacak şekilde ayarlayın.
  3. Doku kurumasını önlemeye yardımcı olmak için yardımcı soğuk aydınlatma kullanın. Cerrahi prosedürü kolaylaştırmak için büyüteç kullanın. Steril, tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, cerrahi kılıflar, eldivenler, göz koruması ve yüz maskesinden oluşan KKD'leri cerrahi en iyi uygulamaların önerdiği şekilde giyin.
  4. %2,0 izofluran ayarına ve 2,0 L/dak oksijen akış hızına sahip bir anestezi buharlaştırıcı makinesi kullanarak fareyi anestezi altına alın. Analjezik (10 mg / kg meloksikam) deri altı enjeksiyonu ile uygulayın.
    NOT: İlk 24 saat içinde, tercihen ameliyattan sonraki ilk 2 gün boyunca her 8-12 saatte bir ek dozlar sağlayın.
  5. Anestezi uygulandıktan sonra (ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediği doğrulanır), gözlerin kurumasını önlemek için nemlendirici bir göz jeli uygulayın. Ameliyat bölgesinde kürkü çıkarmak için tüy dökücü bir krem kullanın (4. kasık meme bezi) ve ardından steril suya batırılmış gazlı bezle durulayın.
  6. Cilt yüzeyini 3 alternatif betadin ve etanol ovma ile dezenfekte ederek epilasyon yapılan cerrahi bölgeyi ameliyat için hazırlayın.
  7. Ameliyata başlamak için, forseps kullanarak cildi 4 numaralı 4. meme bezinin üzerine yavaşça kaldırın. Cilt vücut duvarından çekildikten sonra, forsepslerin ucundaki dermal tabakanın ~ 1 mm'lik bir bölümünü cerrahi mikro makasla çıkarın. Kanama meydana gelirse, kanama durana kadar steril gazlı bezle hafif basınç uygulayın.
    NOT: Genel olarak, daha büyük tümörler, daha küçük tümörlerden veya normal dokulardan daha büyük bir kanama potansiyeline sahiptir.
  8. Altta yatan bezin kesilmesini önlemek için meme bezini dermal tabakadan cerrahi açıklıkta forsepslerin nazik hareketleriyle ayırın.
  9. 10 mm'lik bir kesi oluşturun ve meme bezini periferdeki dermal tabakadan serbest bırakın, böylece dikişler meme bezine nüfuz etmeden yerleştirilebilir. Maruz kalan bezi/tümörü örtmek ve kurumayı önlemek için PBS ekleyin.
  10. 5-0 ipek örgülü dikiş kullanarak açıklığın çevresi boyunca bir çanta ipi dikiş oluşturun. MIW'nin bir kenarını yerleştirin, böylece dermal tabaka MIW'nin alıcı çentiğine girer.
  11. Epiteli MIW'nin karşı tarafındaki yavaşça gerin ve metal MIW'yi yerine itin, böylece dermal tabaka alıcı çentiği tüm MIW çevresine tam olarak oturtur. Dermal tabakayı çentiğin içine çekmek için cüzdan ipini sıkıca sıkıştırın ve MIW'yi tamamen sabitlemek için bağlayın.
  12. MIW'deki dermal tabakaya topikal bir antibiyotik ekleyin ve sternal yatışmayı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi sürekli izleyin. MIW implante edilmiş fareyi, kafese yerleştirilmiş bir iglo ile yumuşak yataklara ayrı ayrı yerleştirin ve görüntülemeden önce farenin 48 saat boyunca iyileşmesine izin verin.

3. Görüntüleme için fareyi mikroskop aşamasında konumlandırma ve sürdürme

  1. Isıtma odasını mikroskop aşamasında ayarlayın. 30 °C'ye ayarlanmış bir zorunlu hava sistemi veya benzeri bir sistem kullanın. Z odakta kaymayı önlemek için objektif bir ısıtıcı kullanın. Görüntülemeden önce sistemin en az 1 saat dengeye gelmesine izin verin.
    NOT: Anestezi uygulanan fareler vücut ısılarını düzgün bir şekilde koruyamazlar ve bu nedenle, herhangi bir hızlandırılmış edinim için ısıtılmış bir ortama sahip olmak gerekir. Objektif ısıtıcı, nesnel lens ve görüntülenen doku termal dengeye geldikçe z odağında sürüklenmeye neden olan bir fenomen olan termal genleşmenin etkileriyle mücadeleye yardımcı olur.
  2. Mikroskop üzerindeki ısıtma odası 30 °C'de stabilize edildikten sonra, alıcı fareyi% 2 izofluran ve 2 L / dak oksijen akış hızına sahip anestezi makinesi ayarları ile anestezi yapın.
  3. Fare yatıştırıldıktan sonra (ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek onaylanır), MIW camının dışını pamuklu bir aplikatör ve cam temizleyici ile temizleyin, kurumayı önlemek için göz merhemi ekleyin ve gerekirse bir kuyruk damarı kateteri yerleştirin.
  4. Uygun hidrasyonu korumak için, kuyruk damarı kateterinden deri altından 0.5 mL PBS veya 100 μL'lik bir ilk enjeksiyon yapın. Görüntüleme seansı boyunca her 2 saatte bir tekrarlayın.
  5. Fare düzgün bir şekilde hazırlandıktan sonra, görüntüleme için mikroskopu ayarlayın. Hızlandırılmış ölçümler sırasında buharlaşmayı azaltmak için, daldırma ortamı için su yerine su bazlı bir jel kullanın. Bu, fareyi sahneye yerleştirmeden önce yapılmalıdır. Optik bileşenlerin ayrıntıları için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
  6. Fareyi mikroskop aşamasına yerleştirin, izofluran hortumunu takın ve görüntüleri stabilize etmek için MIW'nin yakasını sahne ekindeki 14 mm'lik bir alma deliğine bastırın. Mikroskop okülerlerini kullanarak görüntüleme alanını odaklayın ve vaskülatürü kan akışıyla gözlemlemek için parlak alan aydınlatması kullanın.
  7. Görüş alanının kararlılığını kontrol edin. Solunum hareketi artefaktları varsa, bezin arka tarafına küçük bir köpük blok ve cincture benzeri bir yapışkan bant parçası ile nazik bir sıkıştırma uygulayın. Sıkıştırma uygulandıktan sonra, görüş alanı boyunca kan akışının korunduğunu doğrulayın.
  8. Hayvan solunumunu manuel olarak sayarak uygun bir sedasyon seviyesini korumak için görüntüleme seansı sırasında% 0.25'lik artışlarla izofluran seviyelerini periyodik olarak ayarlayın.
  9. Hayvan ömrünü ve optik görüntülemeyi iyileştirmek için dakikada 36-40 solunum (rpm) hızını koruyun. Daha düşük solunum hızları, farenin deneyden sağ çıkamamasına neden olabilirken, 60 rpm'nin üzerindeki solunum hızları, görüntü verilerindeki solunum ve hareket artefaktlarını artırabilen zayıf sedasyona neden olabilir.

4. Dinamik hücre davranışının 4D, yoğunluğa dayalı, etiketsiz intravital görüntülemesi için ayarlayın

  1. Fare sakinleştirildikten ve ters çevrilmiş mikroskop aşamasına güvenli bir şekilde yerleştirildikten sonra, ilgilenilen bölgeleri bulmaya başlayın.
  2. MIW'ye yönelik bir ışık kaynağı kullanarak, araştırma için potansiyel alanları tanımlamak için mikroskopun okülerlerini kullanın. Bu konumlara dönmek için yazılımdaki x, y konumlarını ekleyin ve kaydedin.
    NOT: Tümörün ince detayları bu tür bir aydınlatma ile kolayca görülemeyecektir. Amaç, daha fazla araştırma için bölgeleri belirlemektir. Odak noktası vaskülatür ve kan akışını görmektir.
  3. Yazılıma birkaç konum kaydedildikten sonra, 890 nm uyarım ve FAD/SHG filtre küpünü kullanarak seçilen görüş alanlarını önizleyin. Daha düşük güç ve yüksek PMT ayarı ile maksimum 4 μs bekleme süresi kullanın. Amaç, dokuyu aşırı lazer ışığına aşırı maruz bırakmadan görüş alanlarını önizlemektir.
  4. Uygun güç seviyeleri ayarlandıktan sonra, z-yığınlarını ayarlayın. MIW'nin cam yüzeyinin altında 20-50 μm'de bol miktarda kollajen lifinin (SHG) görünümünü gözlemleyin. Kollajen, mikroskop tümörün derinliklerine indikçe daha az yaygın hale gelecektir (Şekil 1B). SHG'deki boşluklar tümör kitlelerinin yerini ortaya çıkarır.
  5. Üst z-dilimini, ilk kollajen liflerinin ~ 50-100 μm'de göründüğü yalnız hücre tabakasının altına yerleştirin. Alt z-dilimini ~ 250 μm'ye ayarlayın, burada lifler kaybolur ve zayıf sinyal hakimdir. Kaydedilen tüm x-y pozisyonları için bunu tekrarlayın.
  6. Z-stack aralığı ayarlandıktan sonra, bekleme süresini artırın (8 μs'ye kadar) ve güç ve dedektör ayarlarını optimize edin. Her deney için dokuyu heyecanlandırmak için güç seviyelerini gerektiği gibi optimize edin. Hedefin arka diyafram açıklığında 750 nm'de 90 mW'a veya 890 nm'de 70 mW'a kadar olan güçlerin kullanılması kabul edilebilir bir aralıktadır.
    NOT: Görüntüleme derinliği, doku içindeki saçılma miktarı, objektif özellikler ve dedektör hassasiyeti, görüntü elde etmek için gereken güç miktarını önemli ölçüde etkileyecektir.
  7. Zaman aralıklarını deneysel hedeflere göre ayarlayın. Çoğu intravital geçiş filmi için toplama noktaları arasında 10 dakikalık aralıklarla başlayın.
  8. 2P uyarımı hücreler ve dokular üzerinde nazik olsa da, hücre ağartması veya hızla artan otofloresan ve aşırı fotobeyazlatma gibi fototoksisite belirtilerinin farkında olun. Koşulların gösterdiği gibi lazer gücünü azaltın veya zaman atlama aralıklarını artırın.

5. NAD (P) H'nin floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM)

  1. X-y konumlarını zaman atlamalı alımlardan korurken, bir FLIM yığını toplamak için mikroskopu ayarlayın. GaAsP dedektörünün önündeki bir filtre tutucusuna 440/80 filtre yerleştirin ve yazılımda GaAsP dedektör voltajını 800 olarak ayarlayın. Dedektörler açıkken oda ışıklarını kapatın.
  2. Yazılımda, galvanometre tabanlı yoğunluk görüntülemeden FLIM görüntüleme moduna geçin.
  3. Vaskülatürü tanımlamak ve maskelemek amacıyla, çözünürlüğü 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Tamamlayıcı metabolik bilgileri toplamak için, yaşam boyu imzanın zamansal çözünürlüğünü artırmak üzere çözünürlüğü 256 x 256 piksel olarak ayarlayın. Bekleme süresini 4 μs'ye ayarlayın ve lazeri 750 nm'ye ayarlayın.
  4. Önizleme taramasını başlatın ve lazer gücünü ayarlamaya başlayın. Sabit kesir ayırıcı (CFD) için okuma 1 x 105 ile 1 x 106 arasında olana kadar lazer gücünü ayarlayın. 1 x 10 6'yı aşmayın, çünkü bu foton birikmesine ve genel sonuçların bozulmasına neden olur.
  5. Güç seviyesi ayarlandıktan sonra, entegrasyon süresini 90 s ile 120 s arasında ayarlayın ve FLIM koleksiyonunu başlatın. Ayrılan süre boyunca görüş alanından fotonlar alacaktır.
  6. İsteğe bağlı: Gerekli tüm koleksiyonlar yapıldıktan ve fare sahne alanından çıkarıldıktan sonra, bir enstrüman yanıt işlevi (IRF) toplayın. Ticari olarak temin edilebilen üre kristallerinin yüzeyini cam tabanlı bir tabakta aynı parametrelerle görüntüleyerek IRF'yi ölçün ve dokuyu görüntülemek için kullanılan ayarlayın.
    NOT: IRF, elektronik veya optik kurulumdan kaynaklanan gecikmeleri veya yansımaları hesaba katar. IRF, tüm FLIM alımlarında birleştirilmiştir ve verilerden ayrılması, hesaplanan floresan bozunma eğrilerinin doğruluğunu artırabilir. Bununla birlikte, hesaplanan IRF'ler genellikle ölçülen IRF'den floresan bozunma eğrilerinin kalitesini makul bir şekilde çoğaltabilir. Hesaplanan IRF'nin bozunma eğrilerine eşdeğer uyumlar sağlayacağı ve ölçülen IRF'den elde edilen sonuçlara yeterince yaklaşacağı belirlenene kadar IRF'yi ölçmek iyi bir uygulamadır.

6. NADH Ömür boyu görüntülerin analizi

  1. FLIM yazılımını açın ve veri kümesinden NAD(P)H yaşam boyu görüntüsünü içe aktarın. Yazılımın düzgün bir şekilde nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla bilgi için lütfen floresan ömür boyu el kitaplarına bakın (Bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Başlamak için, yazılımdaki model parametrelerini tanımlayın. Menü çubuğunda, Seçenekler > Model'i tıklatın. Şu kutuları seçin: Çok Üstel Bozunum, MLE'> Sığdırma Yöntemi, > Uzamsal Bağlama > Kare, Eşik > Tepe Noktası Ayarları ve Görüntü Hesaplamadan Önce Shift Düzeltme'yi işaretleyin.
  3. Menü çubuğunda, açılır menüden Renk > %1'i tıklatın. Pencerenin sağ tarafında, üç bileşenli bir uyum olarak tanımlayın. Kutu Boyutu'nu 3 > ayarlayın.
  4. Eşiği ~ 10 > ayarlayın. Bozunma matrisi ilk kez hesaplandıktan sonra eşik doğruluğunu yeniden değerlendirin.
  5. τ1 ile 200 ps arasında sabitleyin. Bu, kırmızı kan hücrelerinin kısa ömrünü temsil eder. Yoğunluk görüntüsünde görülebilen daha büyük kan damarındaki birden fazla noktaya en iyi uyan değeri bulmaya çalışın. τ2 değerini 1200 ps'ye sabitleyin. Bu, kırmızı kan hücrelerinin uzun ömrünü temsil eder.
    NOT: Ayarlanan değerler yalnızca başlangıç noktasıdır. Vaskülatürü daha fazla ortaya çıkarmak için değerlerin optimize edilmesi gerekecektir. Çoğu durumda, ancak her zaman değil, bu değerler düşecektir.
  6. Menü çubuğunda Hesapla altında, Bozunma Matrisi'ni seçin. Bu, vaskülatür yüksek değerlere sahip ilk A%1 ömür boyu görüntüler üretecektir. İmleci (artı işareti) kullanarak vaskülatürün üzerine gelin. Sistematik olarak ve teker teker, τ1 ve τ2'yi kaydırın (Fix kutusunun işaretini kaldırın). Sabit parametreleri optimize etmeye yardımcı olacakları için bu değerleri kaydedin.
    NOT: Amaç, görüntüdeki en doğru değerleri elde etmek değil, vaskülatür olarak tanımlanan alanı önemli ölçüde azaltmadan vaskülatür ve doku arasındaki eşitsizliği en üst düzeye çıkarmaktır.
  7. τ1 ve τ2 için uygun parametreler belirlendikten sonra, menü çubuğunda Toplu İşlemeyi Hesapla>yı seçin. Çoğu ayarın z dilimleri arasında benzer olduğundan emin olun.
  8. Diğerlerinden çok farklı bir ayar olmadığını doğruladığınızdan emin olun. Öyleyse, önce vardiyayı ayarlayın ve yeniden deneyin. Sorun devam ederse, yeni parametreler kullanmayı reddedin. Yanlış bir kayma, uyumlarda gürültünün büyük bir nedeni olabilir ve bitişik tümör bölgelerindeki A%1 değerlerini artırabilir.
  9. Menü sekmesinde, dosyaları kaydedin ve ardından A%1 dosyalarını dışa aktarın. Maskeleme ve segmentasyon için bu dosyaları ImageJ'ye yükleyin.

7. Vaskülatürün görüntü segmentasyonu

  1. ImageJ'yi açın ve A %1 görüntüsünü metin görüntüsü olarak içe aktarın. Yığın içindeki tüm görüntüler için bunu tekrarlayın.
  2. Tüm A %1 görüntüler açıkken Image > Stack (Yığın) > Z-Project'i seçin. Maksimum Yoğunluk Projeksiyonunu kullanın ve görüntüleri kaydedin. Temsili bir görüntü için Ek Veri 1'e bakın.
  3. Segmentasyon > Eklentiler'e gidin. Eğitilebilir WEKA segmentasyon eklentisi38'i seçin.
  4. WEKA penceresi açıldıktan sonra, varsayılan ayarları kullanın ve iki sınıf oluşturarak ve vaskülatür (yüksek A% 1 bölgeleri) ve vaskülatür olmayan (düşük A% 1 bölgeleri) üzerinde çizgileri izleyerek yazılımı eğitmeye başlayın.
  5. Yazılım, vaskülatürün yüksek A %1 bölgelerini tutarlı bir şekilde tanımlayana ve arka plan gürültüsünün daha yüksek bölgelerini ortadan kaldırana kadar iki sınıfa yeni izler eklemeye devam edin. Temsili sınıflandırıcı model için Ek Model'e bakın.
  6. Sınıflandırılmış görüntü üretildikten sonra, Resim > Type > 8 Bit'e tıklayın. Görüntüyü eşik haline getirin ve bir maske oluşturun. Eşikli görüntünün hala daha fazla temizlenmesi gerekiyorsa, Parçacıkları Analiz Et işlevini kullanın.
  7. Eşikli görüntünün daha küçük ve dairesel bölgeleri hariç tutulana kadar boyutu ve daireselliği ayarlayın. Sadece vaskülatür ve çok az arka plana sahip temiz bir maske elde edilir.
  8. Seçimi Düzenle > Seçimi Oluştur>a tıklayın. Yatırım getirisi yöneticisinin > Araçlarını Analiz >'a tıklayarak seçimi YG yöneticisine aktarın.
  9. Sınıflandırılmış görüntüyü çoğaltın. İkili > İşleme'ye geçin. Maskeyi genişletmek ve görüntü segmentasyonuna dahil edilecek vaskülatürden uzaklığı tanımlamak için Dilate (Genişlet) seçeneğini belirleyin. Maske istenen aralığa genişleyene kadar tekrarlayın. Bu ilgi alanını (YG) YG yöneticisine kaydedin.
    NOT: Bu adımın amacı, kan damarının belirli bir yakınlığındaki miktarı veya davranışı ölçmektir (örneğin, kan damarlarının X μm'sinde bulunan hücrelerin sayısı). Gerekli genişleme miktarı tamamen bilimsel soru tarafından belirlenir.
  10. Kısıtlayıcı bölgelerdeki hücre sayısını ölçmek için, ilgilendiğiniz pencereyi (görüntü/kanal) seçin. Bu, vasküler maske ile aynı görüş alanını paylaşan herhangi bir pencere olabilir. Açılır menüden XOR işlevini kullanarak her iki YG'yi de uygulayın.
    NOT: Bu işlem, vaskülatürün kendisi hariç, vaskülatürden istenen mesafedeki maddeleri ölçecektir. Bu birleşik yatırım getirisi yaklaşımı daha sonra yoğunluk, hücre sayısı veya geçiş gibi çok sayıda parametreyi ölçmek için kullanılabilir.

8. Tümör yuvasının görüntü segmentasyonu

  1. NADH görüntüsünü ImageJ'de yüksek çözünürlüklü yoğunluklu taramadan veya FLIM koleksiyonundan açın.
    NOT: Bu, tek tek z-dilimlerinde, tam yığınlarda yapılabilir veya birkaç dilimin z-projeksiyonlarına uygulanabilir.
  2. Segmentasyon > Eklentiler'e gidin. Eğitilebilir WEKA segmentasyon eklentisini seçin.
  3. WEKA penceresi açıldıktan sonra, varsayılan ayarları kullanın ve yazılımı NADH yüksek bölgeleri ve NADH düşük bölgeleri olmak üzere iki sınıfa eğitmeye başlayın. NADH yüksek bölgeleri, çekirdekleri olan çok ayırt edilebilir bir hücre modeline sahip olacak ve yazılım bunu kolayca tanımlayacaktır.
  4. Algoritmayı, tümörün tüm bölgelerini göz ve tümör morfolojisi hakkında önceden bilgi sahibi olarak belirleyene kadar ek eğitimle hassaslaştırmak için bindirme ile ileri geri geçiş yapmaya devam edin. Bu yinelemeli bir işlemdir.
  5. Algoritma tümörün tüm bölgelerini tanıdıktan sonra, Sonuç Oluştur düğmesini seçin. Bu yeni bir imaj üretecektir. Bu görüntüyü çoğaltın.
  6. İlk çoğaltılan görüntüyü seçin ve Görüntü > Türü > 8 Bit'i seçerek 8 bitlik bir görüntüye dönüştürün. İkili maske oluşturmak için bu görüntüyü eşikleyin. Ardından bir seçim oluşturun ve YG yöneticisine aktarın. Bu yatırım getirileri stromayı tanımlayacaktır.
  7. Çoğaltılan görüntünün ikincisini seçin ve 8 bitlik bir görüntüye dönüştürün. Görüntü > Düzenle > Ters Çevir'i seçerek bu görüntüyü tersine çevirin ve ardından ikili maske oluşturmak için bu görüntüyü eşik haline getirin. Bir kez daha bir seçim oluşturun ve YG yöneticisine aktarın. Bu ROI, tümör yuvasını tanımlayacaktır.

9. Fiber organizasyona veya hizalamaya göre görüntü segmentasyonu

  1. Başlamak için SHG görüntülerini açın, herhangi bir z-projeksiyonu hazırlayın ve herhangi bir ön işleme ihtiyacını değerlendirin. İyi sonuçlar için, ayırt edilebilir liflere ve düşük parazite sahip yüksek kaliteli görüntüler gereklidir.
  2. İsteğe bağlı: SHG kanalının sinyal-gürültü (SNR) değerini artırmak amacıyla ImageJ'de ön işleme için, yuvarlanan top çıkarma özelliğini kullanarak arka planı çıkarın. Çoğu uygulama için 20 piksel ile 50 piksel arasında bir yuvarlanan top çıkarma işlemi kullanın. Ardından görüntüyü düzgünleştirin ve kaydedin.
  3. OrientationJ eklentisini açın ve işleme parametrelerini ayarlayın. OrientationJ penceresinde, yerel tensör penceresinin boyutunu tanımlayın. Bu fiber yoğunluğunun 20x görüntüsü için, başlangıç noktası olarak 10 pikseli 15 piksele ayarlayın.
  4. Degrade modeli olarak Kübik Spline'ı seçin ve Renk Anketi Kutusunu işaretleyin. Renk anketini tanımlayın. Hem Tonu hem de Doygunluğu Tutarlılık olarak ayarlayın ve ardından Parlaklığı Orijinal Görüntü olarak tanımlayın, Çalıştır'a basın.
  5. Eklentinin çıktı dosyası RGB renk haritasıdır. Yerel tensör penceresinin değerini, göz tarafından belirlenen hizalanmış bölgeler mavi ve macenta tonlarıyla düzgün bir şekilde vurgulanana kadar ayarlayın.
  6. Çıkış görüntüsü tatmin edici olduğunda, bu RGB görüntüsünü 3 kanala ayırın. Image > Color (Bölünmüş Kanal) > seçin.
  7. Maskeleme amacıyla hizalanmış bölgelerin görünümünü geliştirmek için, Görüntü Hesaplayıcı'yı İşlem > seçerek görüntü hesaplayıcıyı kullanın. Bu işleci kullanarak, yeşil görüntüyü mavi görüntüden çıkarın. Daha kısıtlayıcı bir maske için, yeşil görüntüyü kırmızı görüntüden çıkarın. Rastgele bölgeler için, mavi kanalı yeşil kanaldan çıkarın.
  8. Anlar algoritmasını kullanarak elde edilen görüntüyü eşikleyin. Çoğu durumda, bunun daha fazla ayarlamaya ihtiyacı olmamalıdır. Ancak, gerekirse ayarlayın. Bu, ikili bir görüntü üretecektir.
  9. İkili görüntü oluşturulduktan sonra, İkili > İşle > Lifler arasındaki Delikleri Doldur'u seçerek delikleri doldurun ve bir medyan filtre kullanarak maskenin sınırlarını yuvarlayın. 10'luk bir medyan filtre iyi bir başlangıç noktasıdır, verilere iyi uyacak şekilde ayarlayın. Maskede sözleşme olup olmadığını el ile inceleyin ve hatalı YG'leri kaldırın.
  10. Maske tatmin edici olduğunda, Seçimi Düzenle > Seçim Oluştur> seçerek bir seçim oluşturun. Bu seçimi yatırım getirisi yöneticisine aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

MIW'nin kurulumu ve temel deneysel planlama bu süreçteki ilk adımlardır. Bu özel MIW tasarımı ve protokolü, uzunlamasına çalışmalara19 daha uygundur ve hem dik hem de ters mikroskoplarla başarıyla kullanılmıştır. Bu durumda, daha az solunum artefaktı ile meme bezinin daha fazla görüntü stabilitesine neden olduğu için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılmıştır. Şekil 1A'da, rijit MIW'nin boyutlarını ve implantasyon işlemine grafiksel bir genel bakış sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

4D intravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin mekansal ve zamansal bağlamındaki dinamik fizyolojik etkileşimleri araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu makale, tümör kütlesi, bitişik stroma veya vasküler ağa yakın dinamik hücre etkileşimlerini sadece ikinci harmonik jenerasyondan veya NAD (P) H otofloresansından gelen endojen sinyalleri kullanarak bölümlere ayırmak için çok temel ve uyarlanabilir bir operasyonel çerçeve sunmaktadır. Bu protokol, görüntüleme penceresinin implantasyonundan görüntü toplama, analiz v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmayı finanse etmek için NCI R01 CA216248, CA206458 ve CA179556 hibelerini kabul etmek istiyor. Ayrıca, Dr. Kevin Eliceiri ve görüntüleme grubuna, intravital programımızın erken gelişimindeki teknik uzmanlıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Ben Cox'a ve Morgridge Araştırma Enstitüsü'ndeki Eliceiri İmalat Grubu'nun diğer üyelerine, MIW'nin ilk aşamalarındaki temel teknik tasarımları için teşekkür ederiz. Dr. Ellen Dobson, ImageJ eğitilebilir WEKA segmentasyon aracı hakkında yararlı konuşmalara yardımcı oldu. Ayrıca, mikroskoplarını zamanında kullandıkları için Dr. Melissa Skala ve Dr. Alexa Barres-Heaton'a teşekkür ederiz. Son olarak, fare kullanımı ve bakımıyla ilgili tüm düşünceli tartışmalar ve tavsiyeler için Dr. Brigitte Raabe, DVM'ye teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
# 1.5 12mm yuvarlak kapak camıWarner Instruments# 64-0712MIW yapısı
SQ enjeksiyonu için 1.0 mL şırıngaBD309659Şırınga
20x objektifZeiss421452-988SQ enjeksiyonu için suya daldırma
27G iğneCovidien1188827012İğnesi
40x objektifNikonMRD77410Suya daldırma
5-0 ipek örgülü sütürMIW implantasyonu içinEthiconK870
Yapay gözyaşı jeliAkornNDC 59399-162-35Göz jeli
Betadine çözeltisi, %5Fisher ScientificNC1558063Cerrahisi antiseptik
pamuk uçlu aplikatörFisher Scientific23-400-101
Siyanoakrilat yapıştırıcıLoctite1365882MIW yapımı
floresan dekstranSigmaT1287-50mgvasküler forsepslerin intravenöz etiketlenmesi
Mckesson.comMiltex #18-782paslanmaz, 4 inç, kavisli
GaAsP fotoçoğaltıcı tüpHamamatsu 
ısıtma battaniyesiCARA 72 ısıtma yastığı  038056000729Sıcaklık seçilebilir
ısıtma odasıev yapımı
Floresan ömür boyu el kitabıBecker ve Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
ters mikroskop tabanıNikon
IsofluraneAkornNDC 59399-106-01Anestezi
Liqui-NoxFisher Bilimsel16-000-125MIW temizleme
MeloksikamNorbrookNDC 55529-040-10Analjezik
Mikro HortumScientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
çoklu foton tarama kafasıBruker Ultima IIÇoklu foton tarama kafası ve görüntüleme platformu
NADH FLIM filtresiChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826Tüy dökücü krem
objektif ısıtıcıTokai HitSTRG-WELSX-SET
SHG/FAD filtresiChroma320740ET450/ 40m-2P
Sparkle cam temizleyiciAmazon.comimplanteMIW
SPC-150 foton sayma tahtasıBecker ve Hickl
cerrahi ışıkFAJB06XV1VQVZManyetik LED deveboynu ışık
cerrahi mikro makasExcelta366paslanmaz, 3 inç
Üçlü antibiyotik merhemActavis İlaçNDC 0472-0179-34Antibiyotik
TV kateteriÖzelBD 30G iğne:TV enjeksiyonu için 305106 kateter
İki foton filtresiChroma320282ET585 / 65m-2P
iki fotonlu lazerTutarlı charmeleonAyarlanabilir multifoton lazer
ultrason jeliParkerPKR-03-02Suya daldırma jeli
Üre kristallerSigmaU5128-5Gİsteğe bağlı: FLIM IRF
Sütür için B00814ME24 Cam Temizleyici

Kaynaklar

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120(2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173(2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490(2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715(2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007(2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198(2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125(2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086(2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787(2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850(2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171(2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Meme T m r Modellerikinci Harmonik retimiFloresan m r G r nt lemeNADPH OtofloresansKolajen LifleriT m r StromasDamarlanma Tan mlama
Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.