Yöntem makalesi

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

DOI:

10.3791/63419

⸱

7 Aralık 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAV6'ya karşı nötralize edici unsurları tespit etmek için hızlı, uygun maliyetli ve basit kolorimetrik hücre tabanlı bir test için kapsamlı bir laboratuvar protokolü ve analiz iş akışı açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV), hem laboratuvarda hem de klinikte çeşitli sağlık koşullarını tedavi etmek için genetik materyal transferi için güvenli ve başarılı bir vektör olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, AAV kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorlar (NAbs), hem büyük hayvan deney modellerinde hem de insan popülasyonlarında gen tedavilerinin başarılı bir şekilde verilmesi için devam eden bir zorluk oluşturmaktadır. AAV'ye karşı konak bağışıklığı için ön tarama, AAV tabanlı gen tedavilerinin hem bir araştırma aracı hem de klinik olarak uygulanabilir bir terapötik ajan olarak etkinliğini sağlamak için gereklidir. Bu protokol, AAV serotip 6'ya (AAV6) karşı nötralize edici faktörleri tespit etmek için kolorimetrik bir in vitro testini açıklar. Test, alkali fosfataz (AP) muhabir geni kodlayan bir AAV ile kombinasyon halinde çözünmeyen ölçülebilir mor bir leke oluşturan NBT/BCIP alt tabakası arasındaki reaksiyonu kullanır.

Bu protokolde serum örnekleri AP'yi ifade eden bir AAV ile birleştirilir ve potansiyel nötralizasyon aktivitesinin gerçekleşmesine izin vermek için inkübe edilir. Virüs serum karışımı daha sonra nötralize edilmemiş AAV'lerin viral transdüksiyonu için hücrelere eklenir. NBT/BCIP substratı eklenir ve viral transdüksiyon ve nötralize edici aktiviteye karşılık gelen kromojenik bir reaksiyona uğrar. Renkli alan oranı, nötralize edici titreler oluşturmak için özgür bir yazılım aracı kullanılarak nicelleştirilir. Bu test, renklenme ve viral konsantrasyon arasında güçlü bir pozitif korelasyon görüntüler. Rekombinant AAV6'nın uygulamadan önce ve sonra koyunlardan alınan serum örneklerinin değerlendirilmesi nötralize edici aktivitede çarpıcı bir artışa yol açtı (125 ila >10.000 kat artış). Test, 1:32.000 > serum seyreltmesinde nötralizasyon aktivitesini tespit etmek için yeterli hassasiyet gösterdi. Bu tahlil, NAB'leri AAV'lere karşı tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno ilişkili virüsler (AAV), gen tedavilerinin kardiyovasküler, pulmoner, dolaşım, oküler ve merkezi sinir sistemlerini etkileyen çeşitli sağlık durumları için deneme tedavilerine ulaştırılmasında vektör olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1,2,3,4,5. AAV vektörlerinin önde gelen gen tedavisi platformu olarak popülaritesi, pozitif güvenlik profili, uzun süreli transgene ekspresyasyonu ve dokuya özgü geniş kapsamlı tropizmlerinden kaynaklanmaktadır1,6. Hayvan çalışmalarındaki başarılı sonuçlar, etkinlik uç noktalarına başarıyla ulaşan elliden fazla AAV gen tedavisi klinik denemesinin ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi8 tarafından onaylanan ilk ticari olarak mevcut AAV gen tedavisi ilacının piyasaya sürülmesinin önünü açmıştır8. İlk başarıların ardından, AAV tercih edilen bir vektör olarak temel ve klinik araştırma sektörlerinde ilgi görmeye devam etti ve şu anda ABD ve Avrupa'da klinik kullanım için onaylanan tek in vivo gen tedavisi9. Bununla birlikte, AAV vektör kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorların (NAbs) varlığı hem klinik öncesi araştırmalara hem de klinik çalışmaların etkinliğine engel olmaya devam etmektedir. NAb'ler hem naif insan hem de hayvan popülasyonlarında bulunur ve bir AAV vektörün in vivo yönetimini takiben gen transdüksiyonu inhibe eder1. AAV seropozitliği çoğu gen tedavisi denemesi için bir dışlama kriteridir ve bu nedenle konak bağışıklığı için ön tarama hem laboratuvarda hem de klinikte çok önemlidir. AAV'ye karşı NAB'lerin varlığını tespit edebilecek bir test oluşturmak, herhangi bir AAV gen terapisi tabanlı araştırma projesinin boru hattında önemli bir adımdır. Bu rapor, çizgili kas (kalp ve iskelet kası)1,10,11,12'de etkili ve seçici transdüksiyon nedeniyle araştırmacıların ilgisini çeken AAV6'ya odaklanmıştır. Gen tedavisi kalbi hedeflemek için umut verici bir strateji olarak kabul edilir, çünkü invaziv açık kalp prosedürleri olmadan kalbi özellikle hedeflemek zordur.

Nötralize edici aktivite genellikle hücre bazlı in vitro veya in vivo transdüksiyon inhibisyon tahlili kullanılarak belirlenir. In vivo NAb tahlilleri genellikle serumun bir denekten (örneğin, insan veya büyük hayvan) farelere verilmesini, ardından muhabir geni olan bir AAV'nin ve ardından muhabir geninin veya ilgili antijenin ekspresyozunun testini içerir. İn vitro tahliller, bir muhabir genini ifade eden rekombinant AAV (rAAV) ile seri seyreltmelerde insan veya büyük bir hayvandan serum veya plazma inkübasyon yaparak NAb titrlerini belirler. Hücreler serum/virüs karışımı ile enfekte edilir ve muhabir gen ekspresyonlarının ne ölçüde inhibe edildiği kontrollerle karşılaştırıldığında değerlendirilir. In vitro tahliller, in vivo testlere kıyasla nispeten daha düşük maliyeti, testlerdeki hızlılığı ve standardizasyon ve doğrulama için daha fazla kapasite13,14 nedeniyle NAb taraması için yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo tahlillerin genellikle daha fazla hassasiyete sahip olduğu bildirilmektedir15,16, ancak aynı iddia in vitro tahlillerle ilgili olarak da ortaya atıldı14,17.

Bugüne kadar, in vitro NAb tahlilleri nötralizasyonunu tespit etmek için muhabir geni olarak esas olarak lüminesans (luciferaz) kullanmıştır. Işık tabanlı bir yöntemin birçok bağlamda değeri olsa da, kolorimetrik/kromojenik bir NAb tahlili bazı durumlarda avantajlı olabilir. Nötralizasyonunu değerlendirmek için yapılan kolorimetrik tahliller influenza ve adenovirüs gibi diğer virüsler için başarıyla sunulmuştir18,19. Çekicilikleri basitliklerinden, daha düşük maliyetlerinden ve sadece günlük laboratuvar cihazları ve araçları için gereksinimden kaynaklanmaktadır20. Lüminesans tabanlı bir muhabir geni kullanan NAb tahlilleri, yüksek maliyetli substrat kitleri, bir luminometre ve analiz için ilgili yazılım gerektirir21. Bu kolorimetrik test, sadece hafif bir mikroskop ve çok ucuz bir substrat gerektirme avantajına sahiptir. Kolorimetrik ve parlak testlere karşı duyarlılığının raporlanması çelişkili sonuçlar verdi. Bir çalışma, lüminesans tabanlı ELISA testlerinin daha fazla hassasiyet ve kolorimetrik testlerle karşılaştırılabilir tekrarlanabilirlik gösterdiği öne sürsürürd22, bir diğeri ise daha fazla hassasiyet sağlamak için kolorimetrik tabanlı ELISA tahlilleri buldu23. Burada, alkali fosfataz (AP) muhabir geni ile nitro mavisi tetrazolium /5-bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (NBT/BCIP) substratı arasındaki kromojenik reaksiyonu kullanan AAV'ye karşı bir in vitro NAb tahlili için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu adım adım protokol, AAV24'e karşı nötralize edici aktiviteyi tespit etmek için hPLAP (insan plasntal alkali fosfataz) muhabir geni (AAV6-hPLAP) kullanan önceki bir rapora dayanarak geliştirilmiştir. Bu test uygun maliyetli, zaman verimli, kurulumu kolaydır ve minimum teknik beceri, laboratuvar ekipmanı ve reaktif gerektirir. Ayrıca, bu tahlilin basitliği, farklı hücre, doku veya viral serotip türlerinde geniş uygulamalar için optimize edilebilir potansiyel verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan bakımı ve deneyinin tüm yönleri Florey Nörobilim ve Ruh Sağlığı Enstitüsü yönergeleri ve Avustralya Hayvanların Bakımı ve Kullanımı için Referans25'i takiben Bilimsel Amaçlar için Kodu'nu izleyerek gerçekleştirildi. Çalışmada 1,5-3 yaşındaki Merinos koyunları kullanılmıştır. Şekil 1'de test protokolüne şematik bir genel bakış sağlanmaktadır.

Seri dilüsyonlar, hücre inkübasyonu ve mikroskopi sonuçları ile transdüksiyon inhibisyonu test diyagramı.
Şekil 1: NAb tahlil protokolünün şematik diyagramı. (A) Üç günlük protokolde yer alan birincil adımları gösteren NAb tahlilinin görsel gösterimi. Kısaca, hücreler bir gecede yetiştirilir ve kaplanr. Ertesi gün serumun seri seyreltmeleri hazırlanır, AAV ile inkübe edilir ve daha sonra bir gecede hücrelerle inkübe edilir. Ertesi gün, hücreler sabitlenir, yıkanır, inkübe edilir, substratla birleştirilir ve tekrar inkübe edilir, ardından görüntüleme ve nicelik. (B) Minimum sinyal kontrolü (komple AAV inhibisyonu), maksimum sinyal kontrolü (inhibisyon yok) ve ~P sinyal inhibisyonu olan bir yumurta serumu örneğinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. İlk hazırlık

  1. Koyunlarda değerlendirme için: 8 mL serum ayırıcı pıhtı aktivatör tüplerinde kan toplayın (bkz. Malzeme Tablosu), kan örneğini 20-30 dakika oda sıcaklığında (RT) bırakın ve daha sonra 15 dakika boyunca 2.100 x g'da aşağı çevirin. Tüplerin üst kısmında oluşan açık süpernatant serumdur. Berrak sulu fazı mikrosantrifüj tüplerine aliquot ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: -80 °C'deki serum ~5 yıl boyunca sabit kalır. Şah damarından 16 G iğne (ucu kesilmiş) ve bilinçli hayvanlardan şırınga kullanılarak kan toplandı.
  2. Isı fetal sığır serumu (FBS) 30 dakika boyunca 56 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek inaktive ve aralıklı olarak döner. Hassasiyet için, eşdeğer miktarda su içeren ikinci bir şişeye bir termometre yerleştirin ve FBS şişesiyle aynı anda ısı banyosuna ekleyin. Termometre 56 °C'ye ulaştığında zamanlamaya başlayın.
  3. Hücre kültürü kaputunda gerçekleştirilen sonraki tüm adımlar için uygun aseptik teknik ve hücre kültürü uygulaması 26,27.'yi uygulayın. Kullanmadan önce tüm nesnelere ve davlumbaz üzerine% 70 etanol püskürtün ve tamamlandığında% 1 sodyum hipoklorit ile temizleyin.








  2. >
  3. >>
  4. >>
  5. >
  6. >

Görüntü analiz süreci; eşik ayar şeması; Kapsam ölçümü için yazılım arayüzü.




Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plaka kapsamı için en uygun viral dozluğu belirlemek için transdüksiyon tahlilleri
Bu test için köklü bir fibrosarkom hücre hattı olan HT1080 hücreleri seçildi. 1 x 104 HT1080 hücre/kuyu konsantrasyonu, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusunda ~% 50 hücre konflüensi sağladı. Test için en uygun viral konsantrasyonu belirlemek için, bir hPLAP (insan plasetal alkali fosfataz) muhabir geni (AAV6-hPLAP)31'i kodlayan bir rAAV, hücre başına parçacık içeren bir dizi vg konsantra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, in vitro viral transdüksiyon derecesine karşılık gelen kromojenik reaksiyonu değerlendirerek belirli bir serum örneğinde AAV nötralizasyonunun kapsamını değerlendiren kolorimetrik bir tahlil açıklanmaktadır. Protokolün geliştirilmesi, immünhistokimi gibi uygulamalarda protein hedeflerinin tespiti için bir boyama aracı ve viral transdüksiyonu değerlendirmek için bir muhabir aracı olarak yaygın olarak kullanılan alkali fosfataz enzimi ile NBT/BCIP arasındaki bilinen kromojenik reaksiyona dayanıyordu24,33...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, JRM ve CJT'ye Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Proje Hibesi (ID 1163732) ve kısmen Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından finanse edildi. SB, Baker Kalp ve Diyabet Enstitüsü-La Trobe Üniversitesi Doktora Bursu ile desteklenmektedir. KLW, Avustralya Ulusal Kalp Vakfı'ndan (ID 102539) Shine On Foundation ve Geleceğin Lider Bursu tarafından desteklenmektedir. JRM, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kıdemli Araştırma Bursu (ID 1078985) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 Tripsin / EDTAGibco25300-054
50 mL konik santrifüj tüpüFalcon14-432-22Veya eşdeğeri
75 cm2 kare şişelerFalcon353136Veya eşdeğeri
96 kuyulu düz tabanlı plakaFalcon353072
AAV6-CMV-hPLAP VektörüKas Araştırmaları & Terapötik Laboratuvarı (Melbourne Üniversitesi, Avustralya) AAV6-CMV-hPLAP talep üzerine sağlanabilir.
Alüminyum folyo
Anti-AAV6 (sağlam parçacık) fare monoklonal antikoru, (ADK6)PROGEN610159Pozitif kontrol monoklonal antikoru
BCIP/NBTSIGMAFASTB5655
Hücre ve doku kültürü güvenlik kabini
Elektronik Pipet5 ve 10 mL şerit ekler
Fetal Sığır SerumuGibco10099-141
Hemositometre
Yüksek glikoz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco11965118
HT1080 hücreleriATCC
ImageJ YazılımıÜcretsiz olarak kullanılabilir:
https://imagej.nih.gov/ij/download.html İnkübatör37 & derece; C, %5 CO2
ışık mikroskobu4x objektif lens ile fotoğraf çekebilme
65; C inkübasyon
ParaformaldehitMERCK30525-89-4
Penisilin StreptomisinGibco15140-122
Fosfat tamponlu tuzlu su
Pipetler ve uçlar20 μ L, 200 μ L & 1 mL tekli pipetler ve uçlar & 200 μ L çok kanallı pipet
Stericup hızlı serbest bırakma filtresiMilliporeS2GPU10REMedya reaktiflerini birleştirmek için kullanılır
Tripan mavisi çözeltisiSigma-AldrichT8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Ayırıcı Pıhtı AktivatörüGreiner BIO-ONE455071Koyunlardan serum toplama ve işleme için kullanılır
Su banyosu
kameralı derece için fırın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16(2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399(2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220(2011).
  25. National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538(2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627(2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142(2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N tralize Edici Antikor TespitiAAV6 Kolorimetrik DeneyiRekombinant AAVSerum N tralizasyonuAlkalen Fosfataz Raporlay cViral Transd ksiyonImageJ AnaliziEnfeksiyon oklu uMonoklonal Antikor Deneyi

İlgili makaleler