Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Sebastian Bass-Stringer; Colleen J. Thomas; Clive N. May; Paul Gregorevic; Kate L. Weeks; Julie R. McMullen

doi:10.3791/63419

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

4.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63419

⸱

7 Aralık 2021

Sebastian Bass-Stringer¹^,² , Colleen J. Thomas²^,³ , Clive N. May³ , Paul Gregorevic⁴ , Kate L. Weeks¹^,⁵^,⁶ , Julie R. McMullen¹^,²^,⁵^,⁶^,⁷

¹Baker Heart and Diabetes Institute, ²Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, ³Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, ⁴Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, ⁵Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, ⁶Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, ⁷Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

Bu makalede

Özet

AAV6'ya karşı nötralize edici unsurları tespit etmek için hızlı, uygun maliyetli ve basit kolorimetrik hücre tabanlı bir test için kapsamlı bir laboratuvar protokolü ve analiz iş akışı açıklanmaktadır.

Özet

Rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV), hem laboratuvarda hem de klinikte çeşitli sağlık koşullarını tedavi etmek için genetik materyal transferi için güvenli ve başarılı bir vektör olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, AAV kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorlar (NAbs), hem büyük hayvan deney modellerinde hem de insan popülasyonlarında gen tedavilerinin başarılı bir şekilde verilmesi için devam eden bir zorluk oluşturmaktadır. AAV'ye karşı konak bağışıklığı için ön tarama, AAV tabanlı gen tedavilerinin hem bir araştırma aracı hem de klinik olarak uygulanabilir bir terapötik ajan olarak etkinliğini sağlamak için gereklidir. Bu protokol, AAV serotip 6'ya (AAV6) karşı nötralize edici faktörleri tespit etmek için kolorimetrik bir in vitro testini açıklar. Test, alkali fosfataz (AP) muhabir geni kodlayan bir AAV ile kombinasyon halinde çözünmeyen ölçülebilir mor bir leke oluşturan NBT/BCIP alt tabakası arasındaki reaksiyonu kullanır.

Bu protokolde serum örnekleri AP'yi ifade eden bir AAV ile birleştirilir ve potansiyel nötralizasyon aktivitesinin gerçekleşmesine izin vermek için inkübe edilir. Virüs serum karışımı daha sonra nötralize edilmemiş AAV'lerin viral transdüksiyonu için hücrelere eklenir. NBT/BCIP substratı eklenir ve viral transdüksiyon ve nötralize edici aktiviteye karşılık gelen kromojenik bir reaksiyona uğrar. Renkli alan oranı, nötralize edici titreler oluşturmak için özgür bir yazılım aracı kullanılarak nicelleştirilir. Bu test, renklenme ve viral konsantrasyon arasında güçlü bir pozitif korelasyon görüntüler. Rekombinant AAV6'nın uygulamadan önce ve sonra koyunlardan alınan serum örneklerinin değerlendirilmesi nötralize edici aktivitede çarpıcı bir artışa yol açtı (125 ila >10.000 kat artış). Test, 1:32.000 > serum seyreltmesinde nötralizasyon aktivitesini tespit etmek için yeterli hassasiyet gösterdi. Bu tahlil, NAB'leri AAV'lere karşı tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Giriş

Adeno ilişkili virüsler (AAV), gen tedavilerinin kardiyovasküler, pulmoner, dolaşım, oküler ve merkezi sinir sistemlerini etkileyen çeşitli sağlık durumları için deneme tedavilerine ulaştırılmasında vektör olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1,2,3,4,5. AAV vektörlerinin önde gelen gen tedavisi platformu olarak popülaritesi, pozitif güvenlik profili, uzun süreli transgene ekspresyasyonu ve dokuya özgü geniş kapsamlı tropizmlerinden ^{kaynaklanmaktadır1,6}