Kuş embriyosunun koryoallantoik membranı (CAM), çeşitli araştırma alanları için çok yararlı ve uygulanabilir bir araçtır. Japon bıldırcın CAM'in özel bir ex ovo modeli, fotodinamik tedavi araştırması için uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bıldırcın Korioallantoik Membran - Fotodinamik Tanı ve Tedavi için Bir Araç
Bu makalede
Özet
Özet
Bir kuş embriyosunun koryoalantoik zarı (CAM), birincil solunum organı olarak işlev gören ince, ekstraembriyonik bir zardır. Özellikleri, anjiyogenez, tümör büyümesi, ilaç dağıtım sistemleri veya fotodinamik tanı (PDD) ve fotodinamik tedaviyi (PDT) incelemek için mükemmel bir in vivo deneysel model olmasını sağlar. Aynı zamanda, bu model deney hayvanlarının uygun bir alternatifle değiştirilmesi gerekliliğini de ele almaktadır. Ex ovo ekili embriyo, kolay madde uygulaması, erişimi, izleme ve dokümantasyon sağlar. En sık kullanılan civciv CAM'dir; ancak, bu makalede, Japon bıldırcın CAM'in düşük maliyetli ve yüksek verimli bir model olarak avantajları açıklanmaktadır. Diğer bir avantaj, daha yüksek deneysel ciroya izin veren daha kısa embriyonik gelişmedir. Bıldırcın TAT'ının kanser ve mikrobiyal enfeksiyonların PDD ve PDT'sine uygunluğu burada araştırılmıştır. Örnek olarak, fotosensitizör hiperisinin lipoproteinler veya nanopartiküller ile kombinasyon halinde bir dağıtım sistemi olarak kullanımı açıklanmaktadır. Beyaz ışıktaki görüntülerden kaynaklanan hasar skoru ve mor ışık altında (405 nm) CAM dokusunun floresan yoğunluğundaki değişiklikler, histolojik kesitlerin analizi ile birlikte belirlendi. Bıldırcın TAT PDT'nin vaskülatür ve doku üzerindeki etkisini açıkça göstermiştir. Ayrıca, kılcal kanama, tromboz, küçük damarların lizisi ve daha büyük damarların kanaması gibi değişiklikler gözlenebilir. Japon bıldırcın TAT fotodinamik tanı ve tedavi araştırmaları için umut verici bir in vivo modeldir ve tümör anjiyogenezinin yanı sıra antivasküler ve antimikrobiyal tedavi çalışmalarında da uygulamalar vardır.
Giriş
Tavuk koryoalantoik membran (CAM) modeli iyi bilinmektedir ve çeşitli araştırma alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Gaz değişimi ve mineral taşınımı sağlayan zengin vaskülarize ekstraembriyonik bir organdır1. Bu zarın şeffaflığı ve erişilebilirliği nedeniyle, bireysel kan damarları ve yapısal değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir2. Avantajlarına rağmen, civciv CAM'ın diğer kuş türlerini kullanarak önlenebilecek bazı sınırlamaları (örneğin, daha büyük üreme tesisleri, yumurta üretimi ve yem tüketimi) vardır. Bu protokolde, Japon bıldırcın (Coturnix japonica) embriyosunu kullanan alternatif ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Araştırma kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm ekipman ve reaktifler otoklavlanmalı veya p etanol veya UV ışığı ile sterilize edilmelidir.
1. Yumurta inkübasyonu
- Döllenmiş bıldırcın yumurtalarını kuluçkaya başlamadan önce en fazla 4-5 gün boyunca 10-15 ° C'de saklayın. Sadece temiz ve hasarsız yumurtalar kullanın.
- Yumurtaları ~ 53-54 saat boyunca zorla çekilen bir inkübatörde inkübe edin. Yumurtaları, yumurta dönüşü kapalıyken,% 50-60 nem ve 37.5 ° C kuluçka sıcaklığında yatay olarak yerleştirin.
2. Ex ovo kültür hazırlığı
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tümörün TAT yüzeyindeki lokalizasyonu beyaz ışıkta zordur. PDD'de kullanılan fotosensitizörün (burada, hiperisin) tümör tarafından seçici olarak alınması beklenir, ve tümörün görselleştirilmesine yardımcı olur. Hiperisin ilavesi ve floresan ışık kullanımı (örneğin, 405 nm) tümörün (skuamöz hücreli karsinom TE1) pozisyonunu çok iyi göstermiştir (Şekil 6A). Histolojik analiz, sağlıklı dokuları istila eden hayati tümör hücrelerini gösterdi. Genellikle skuamöz hücreli karsinom dokusunda (keratin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Başarılı ex ovo yetiştiriciliği için, yukarıdaki protokolü takip etmek önemlidir. Ayrıca, yumurtalar yeterince dikkatli açılmazsa veya ekim sırasında yetersiz nem varsa, yumurta sarısı çuvalı kabuğa yapışır ve sıklıkla yırtılır. Yaklaşık 60 saatlik yumurta inkübasyonu sırasında bir ex ovo yetiştiriciliğinin başlaması, embriyoların yüksek hayatta kalma oranını sağlar, çünkü bunlar zaten kullanımdan kurtulacak kadar büyüktür. Daha sonraki gelişim aşamalarında, CAM incelir ve yumurta kabuğuna yapışarak mem.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Çalışma VEGA 2/0042/21 ve APVV 20-0129 tarafından desteklenmiştir. V. Huntošová'nın katkısı, proje uygulamasının sonucudur: Tıpta modern disiplinlerarası araştırmalar için açık bilimsel topluluk (Kısaltma: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455, ERDF tarafından finanse edilen Operasyonel Program Entegre Altyapısı tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 6 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası | Sarstedt | 83.392 | Şeffaf polistiren, steril |
| CO2 İnkübatör ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapur | CCL-050B-8 | CO2 hücre kültürü inkübatörü |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, ABD | ||
| dijital fotoğraf makinesi Canon EOS 6D II | Canon, Japonya | ||
| diyot lazer 405 nm | Okyanus Optik, ABD | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimetil sülfoksid |
| eozin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| etanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| ince fırça boyutu 2 | CAM ayırma ve manipülasyon için | Faber-Castell | 281802 |
| glutaraldehit | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoksilen | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hiperisin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| inkübatör Bios Midi | Bios Sedl any, Çek Cumhuriyeti | İlk kuluçka makinesi için cebri taslak kuluçka | |
| Memmert IF160 | Memmert, Almanya | CAM inkübasyonu için cebri hava sirkülasyon inkübatörü | |
| Kaiser slimlite plano, LED ışık kutusu | Kaiser, Almanya | 2453 | Transilluminator |
| LED ışık 405 nm | ısmarlama dairesel LED ışık | ||
| makro lens Canon MP- E 65 mm f/ 2.8 | Canon, Japonya | ||
| mikroskobu Kapa 2000 | Kvant, Slovakya | optik mikroskop | |
| mikrotomu Auxilab 508 | Auxilab, İspanya | manuel döner mikrotom | |
| paraformaldehit | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | doku gömme PBS için parafin ortamı |
| Sigma-Aldrich | P4417 | Fosfat salin tampon | |
| makas Castroviejo | Orimed | OR66-108 | CAM ayırma yazılımı için mikro makas |
| ImageJ 1.53 | kamu malı | görüntü işleme ve analiz programı | |
| stok çözümü HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | yüksek yoğunluklu lipoproteinler |
| stok çözeltisi LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | düşük yoğunluklu lipoproteinler |
| Tissue-Tek OCT Bileşik | Sakura Finetek | 4583 | Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiği 118 mL sıkma şişeleri |
Kaynaklar
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
