Yöntem makalesi

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

2.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63425

⸱

2 Şubat 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Çift yönlü mitotik kinesin-5 Cin8, hareketlilikleri sırasında bölünen ve birleşen kümelerde birikir. Kümelerdeki birikim ayrıca Cin8'in hızını ve yönlülüğünü de değiştirir. Burada, saflaştırılmış Cin8-GFP ile motilitesi tahlilleri ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizi için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Mitotik bipolar kinezin-5 motorlar, iş mili dinamiklerinde temel işlevleri yerine getirir. Bu motorlar, aktif kompleksin zıt uçlarında bulunan iki çift katalitik motor alanına sahip homo-tetramerik bir yapı sergiler. Bu benzersiz mimari, kinesin-5 motorlarının antiparalel mil mikrotübüllerini (MTs) çapraz bağlamasını ve kaydırmasını sağlar, böylece iş mili kutuplarını birbirinden ayıran dışa doğru yönlendirilmiş kuvveti sağlar. Daha önce, kinesin-5 motorlarının yalnızca artı uçlu yönlendirildiğine inanılıyordu. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, birkaç mantar kinezin-5 motorunun eksi uçlu tek molekül seviyesine yönlendirildiğini ve çeşitli deneysel koşullar altında yönselliği değiştirebileceğini ortaya koymuştur. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8, bu tür çift yönlü motor proteinin bir örneğidir: yüksek iyonik mukavemet koşullarında, Cin8'in tek molekülleri, MT'lerin eksi uç yönünde hareket eder. Ayrıca, Cin8'in ağırlıklı olarak MT'lerin eksi ucunda hareketli kümeler oluşturduğu ve bu kümelenmenin Cin8'in yön değiştirmesine ve yavaş, artı uçlu yönlendirilmiş hareketliliğe maruz kalmasına izin verdiği gösterilmiştir. Bu makale, GFP etiketli kinesin-5 Cin8 ile çalışmanın tüm adımları için, S. cerevisiae hücrelerinde protein aşırı ekspresyonundan ve saflaştırılmasından in vitro tek moleküllü motilitesi testine kadar ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Burada açıklanan yeni geliştirilen bir yöntem, floresan yoğunluklarına bağlı olarak tek moleküller ve Cin8 kümeleri arasında ayrım yapmaya yardımcı olur. Bu yöntem, tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketliliğinin ayrı ayrı analizini sağlar, böylece Cin8 hareketliliğinin küme boyutuna bağımlılığının karakterizasyonunu sağlar.

Giriş

Ökaryotik hücrelerdeki çok sayıda hareketlilik olayı, moleküler motor proteinlerin işlevi tarafından aracılık edilir. Bu motorlar sitoiskelet filamentleri, aktin filamentleri ve mikrotübüller (MTs) boyunca hareket eder ve ATP hidrolizinin kimyasal enerjisini, hücreler içindeki biyolojik hareketliliği yönlendirmek için gereken kinetik ve mekanik kuvvetlere dönüştürür. MT bazlı S. cerevisiae Cin8, iş mili MT'lerini çapraz bağlayan ve kaydıran bipolar, homotetramerik kinesin-5 motor proteinidir1. Cin8, mitoz sırasında, iş mili montajı 2,3,4'te ve anafaz 5,6,7 sırasında iş mili uzamasında temel işlevleri yerine getirir. Daha önce, Cin8'in farklı deneysel koşullar altında yönselliği değiştiren çift yönlü bir motor olduğu gösterilmişti. Örneğin, yüksek iyonik mukavemet koşulları altında, tek Cin8 motorları MT'lerin eksi ucuna doğru hareket ederken, kümelerde, çok motorlu MT kayma testlerinde ve antiparalel MT'ler arasında, Cin8 motorları esas olarak MTs 8,9,10,11,12'nin artı uçlarına doğru hareket eder. . Bu bulgular birkaç nedenden dolayı oldukça beklenmedikti. İlk olarak, Cin8 katalitik motor alanını amino terminusta taşır ve bu tür motorların daha önce sadece artı uçlu yönlendirildiğine inanılıyordu, oysa Cin8'in eksi uçlu tek molekül seviyesinde yönlendirildiği gösterildi. İkincisi, kinesin motorlarının eksi uçlu veya artı uçlu tek yönlü olduğuna inanılıyordu, oysa Cin8'in deneysel koşullara bağlı olarak çift yönlü olduğu gösterildi. Son olarak, mitotik mildeki MT oryantasyonu nedeniyle, kinezin-5 motorlarının iş mili montajı ve anafaz B sırasında iş mili direklerinin ayrılmasındaki klasik rolü, yalnızca 1,13'ü çapraz bağladıkları MT'ler üzerindeki artı uçlu yönlendirilmiş hareketlilikleri ile açıklanabilir. Cin8'in çift yönlülüğü hakkındaki ilk raporları takiben, diğer birkaç kinesin motorunun çift yönlü 14,15,16 olduğu gösterildi, bu da kinesin motorlarının çift yönlü hareketliliğinin daha önce inanıldığından daha yaygın olabileceğini gösteriyor.

Daha önce hücrelerde, Cin8'in çift yönlü bir şekilde hareket ettiğibildirilmiştir 8, bazı kinezin-5 motorlarının çift yönlü hareketliliğinin hücre içi fonksiyonları için önemli olduğu fikrini desteklemektedir. Ek olarak, çift yönlü olduğu bildirilen üç kinesin-5 motoru mantar hücrelerinden olduğundan, bu tür hücrelerde yakın zamanda kinesin-5 motorlarının çift yönlülüğü için olası bir rol önerilmiştir10. Bu modele göre, nükleer zarfın mitoz sırasında parçalanmadığı mantar hücrelerinin kapalı mitozunda, kinesin-5 motorları, iş mili montajından önce iş mili kutuplarını ayıran ilk kuvveti sağlar. Bu görevi yerine getirmek için, iş mili kutup ayrımından önce, kinesin-5 motorları, tek nükleer MT'ler üzerindeki eksi uçlu yönlendirilmiş hareketlilikleriyle iş mili kutuplarının yakınında lokalize olur. Bu konuma geldiğinde, kinesin-5 motorları kümelenir, yönselliği değiştirir, komşu mil direklerinden MT'leri yakalar ve çapraz bağlar. Daha sonra, kinesin-5 motorları, kutupların çapraz bağladıkları MT'lerde artı uçlu yönlendirilmiş hareketlilik ile ilk ayrımını sağlar. Bu modele göre, mantar kinezin-5 motorlarının iş mili düzeneği 1,13'teki rollerini yerine getirmesi için hem tek MT'lerde eksi uçlu yönlendirilmiş hareketlilik hem de çapraz bağlı MT'lerde artı uçlu yönlendirilmiş hareketlilik gereklidir.

Tarif edilen yöntemin genel amacı, yüksek saflıkta fungal GFP etiketli kinesin-5 Cin8 elde etmek ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin motilitesini ayrı ayrı analiz ederken tek moleküllü motilitesi testleri (Şekil 1) yapmaktır. Tek moleküller ve kümeler arasındaki ayrım önemlidir, çünkü Cin8'in yönlülüğünü etkilediği gösterilen faktörlerden biri, MTs10,12 üzerindeki kümelerde birikmesidir. MT yüzey kayma ve MT kayma testleri gibi alternatif hareketlilik testleri, tek motor proteinlerinin aktivitesi hakkında bilgi sağlamaz17,18. Burada açıklanan sağlam tek moleküllü hareketlilik testi ve analiz yöntemleri, kinezin-5 motorlarının, Cin8 ve Kip1 10,11,12,14,19,20'nin farklı yönlerini karakterize etmek için başarıyla uygulanmıştır.

Burada, Cin8 aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması, MTs'lerin polimerizasyonu ve tek moleküllü motilitesi testi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, tek moleküller ve Cin8 kümeleri arasında ayrım yapmak ve ortalama yer değiştirme (MD) ve ortalama kare yer değiştirme (MSD) analizi ile tek motor ve küme hızlarını belirlemek için yapılan analizler de açıklanmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların prosedürlerin tüm adımlarını görselleştirmelerine ve bu tür tahlillerde sorun gidermeye yardımcı olmalarına yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

figure-introduction-1
Şekil 1: Tek moleküllü motilitesi testinin şematik gösterimi. Biyotinile floresan MTs, yüzeye bağlı biyotinillenmiş BSA ile etkileşime giren Avidin ile kaplanmış cam yüzeye tutturulur. Yeşil ok, yüksek iyonik mukavemet koşulları altında tek Cin8 moleküllerinin hareket yönünü temsil eder. +/- MT'nin polaritesini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Arabellek
    1. -Leu aa bırakma karışımı: Adenin, Uracil, Triptofan, Histidin, Lizin ve Metiyonin'in her birini 2 g karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın.
    2. Rafinozlu maya seçici ortam (1 L): 6.7 g maya azot baz (amonyum sülfat ile), 2 g -Leu aa bırakma karışımı ve 20 g rafinozu çift damıtılmış suda tamamen çözünene kadar karıştırarak (ısıtmadan) karıştırın. 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak, çözeltiyi steril bir şişeye süzün.
    3. Lizis tamponu: 50 mM Tris, 30 mM Borular, 500 mM KCl,% 10 gliserol, 1,5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM MgCl 2, 0,1 mM ATP ve% 0,1 Triton X-100'den oluşan üçlü damıtılmış suda (TDW)25 mL çözelti hazırlayın. 6 M HCl kullanarak pH'ı 8'e ayarlayın.
    4. Elüsyon tamponu: TDW'de 50 mM Tris, 30 mM Borular, 500 mM KCl, 350 mM imidazol,% 10 gliserol, 1,5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP ve% 0,1 Triton X-100'den oluşan 10 mL çözelti hazırlayın. 6 M HCl kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
    5. P12 Tampon: TDW'de 12 mM Boru, 1 mM EGTA ve 2 mM MgCl2'den oluşan 10 mL'lik bir çözelti hazırlayın. 10 M NaOH kullanarak pH'ı 6,9'a ayarlayın.
    6. BRB80 tamponu: Ultra saf suda 80 mM Borular, 1 mM EGTA ve 2 mM MgCl2'den oluşan 50 mL'lik bir çözelti hazırlayın. 10 M NaOH kullanarak pH'ı 6,9'a ayarlayın.
    7. Genel Tubulin Tamponu (GTB): Ultra saf suda 80 mM Borular, 0,5 mM EGTA ve 2 mM MgCl2'den oluşan 50 mL'lik bir çözelti hazırlayın. 10 M NaOH kullanarak pH'ı 6,9'a ayarlayın.
    8. Tris-Borular çözeltisi: TDW'de 6.055 g Tris ve 9.07 g Boruyu karıştırarak 40 mL 1M Tris-0.6 M Boru çözeltisi hazırlayın ve 6 M HCl kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
      NOT: P12, BRB80 ve Tris-Pipes tamponları, hareketlilik testi için stok çözeltilerinin hazırlanmasında kullanılır. Bu tamponlar büyük miktarlarda hazırlanabilir, 1,5 mL tüplerde aliquoted edilebilir, çıtçıtlı dondurulabilir ve -20 ° C'de saklanabilir.
  2. Motilitenin tahlili için stok çözümleri
    1. Tubulin (10 mg mL-1): 1 mg liyofilize tübülini 100 μL soğuk (4 °C) genel tübülin tamponunda (GTB) çözün. 1 μL alikotu çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    2. Biyotinile tübülin (1 mg mL-1): 20 μg liyofilize tübülini 20 μL soğuk GTB'de çözün. 1 μL alikotu çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    3. Rhodamine etiketli tübülin (1 mg mL-1): 20 μg liyofilize tübülini 20 μL soğuk GTB'de çözün. 0,5 μL alikotları çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP, tedarikçiden 100 μL sulu çözelti olarak elde edilir ve -80 °C'de depolanır. Şişeyi GMPCPP ile buz üzerinde çözün. 1 μL aliquot hazırlayın, çıtçıtlayın ve -80 ° C'de saklayın.
    5. ATP: 0,5 M Tris tamponunda (pH 8) 500 μL 100 mM ATP çözeltisi hazırlayın. 2 μL alikotu çıtçıtla dondurun ve -20 °C'de saklayın.
    6. MgCl 2:P12 tamponunda 1 mL 200 mM MgCl2 çözeltisi hazırlayın. 5 μL alikotu -20 °C'de saklayın.
    7. Kazein: BRB 80 tamponunda 1 mL'lik 5 mg mL-1 kazein çözeltisi hazırlayın. 10 μL alikotları çıtçıtla dondurun ve -20 °C'de saklayın.
    8. D-Glikoz: P12 tamponunda 1 mL'lik bir 1 M D-glikoz çözeltisi hazırlayın. 10 μL alikotu -20 °C'de saklayın.
    9. Glikoz oksidaz: P12 tamponunda 10 mg mL-1 glikoz oksidaz içeren 1 mL'lik bir çözelti hazırlayın. 2 μL alikotu çıtçıtla dondurun ve -20 °C'de saklayın.
    10. Katalaz: P12 tamponunda 1 mL'lik bir 0.8 mg mL-1 katalaz çözeltisi hazırlayın. 2 μL alikotu çıtçıtla dondurun ve -20 °C'de saklayın.
    11. Dithiothreitol (DTT): Bir duman davlumbazında P12 tamponunda 1 mL'lik 1 M DTT çözeltisi hazırlayın. 10 μL alikotları çıtçıtla dondurun ve -20 °C'de saklayın.
    12. Kreatin fosfat: P12 tamponunda 1 mL'lik bir 1 M kreatin fosfat çözeltisi hazırlayın. 2 μL alikotu çıtçıtla dondurun ve -20 °C'de saklayın.
    13. Kreatin fosfokinaz: 0.25 M glisilglisin, pH 7.4 içinde 1 mL'lik 5 mg mL-1 kreatin fosfokinaz çözeltisi hazırlayın. 2 μL alikotu çıtçıtla dondurun ve -20 °C'de saklayın.
    14. EGTA: Ultra saf suda 100 mM'lik bir EGTA çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
    15. KCl: Ultra saf suda 1 M KCl çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
  3. Motilite tamponu ve reaksiyon karışımı
    1. 145 mM KCl, 2x stok ile Motilite tamponu (MB): 100 μL önceden hazırlanmış Tris-Pipes çözeltisi, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl ve 590 μL TDW karıştırarak hareketlilik tamponunun 1 mL'lik 2x stoğunu hazırlayın. Arabelleği buz üzerinde tutun.
    2. Motilite reaksiyon karışımı: Tablo 1'e göre hareketlilik reaksiyon karışımını hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
HacimStokReaktif adı
50 μL2XMB (adım 1.3.1'den itibaren)
40 μL-cesaret
1 μL100 mMATP
1 μL200 mMMgCl2
2 μL5 mg/mLKazein
1 μL1 milyonGlikoz
1 μL1 milyoncesaret
1 μL10 mg/mLGlikoz oksidaz
1 μL8 mg/mLKatalaz
1 μL1 milyonFosfokreatin
1 μL5 mg/mLKreatin fosfokinaz
100 μLToplam

Tablo 1.

2. Cin8 aşırı ekspresyonu ve S. cerevisiae hücrelerinden saflaştırma

  1. Cin8-GFP-6His aşırı ekspresyonu için plazmid içeren S. cerevisiae hücrelerini, 28° C 12'de% 2 rafinoz (bkz. adım 1.1.2) ile desteklenmiş 1 L maya seçici ortamında üstel büyüme fazına (OD 600= 0.6-0.8) büyütün.
  2. % 2 galaktoz ilavesiyle Cin8-GFP-6His aşırı ekspresyonunu indükleyin. 600 nm'de absorbansı ölçerek maya kültürünün büyümesini izleyin.
  3. Galaktoz ilavesinden beş saat sonra, hücreleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile toplayın, hücreleri lizis tamponunda askıya alın ve sıvıN2'de dondurun.
    NOT: Dondurulmuş hücreler daha fazla kullanım için -80 °C'de saklanabilir veya hemen sıvıN2 içinde öğütülebilir.
  4. Dondurulmuş hücreleri, soğutulmuş harç ve havane kullanarak sıvı N2'de öğütün. Ekstraktları donmuş halde tutmak için öğütme sırasında sıvıN2 ekleyin. Genellikle 4-5 kez sıvı N2 eklenmesini gerektirir.
  5. Faz kontrastı veya DIC mikroskobu altında gözlem yaparak hücre lizisini izleyin.
  6. Zemin hücrelerini çözün ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı 2 mL Ni-NTA ile doldurulmuş ve lizis tamponu ile önceden dengelenmiş bir yerçekimi akış kolonuna yükleyin. Süpernatantın sütundan dışarı akmasına izin verin.
  7. Kolonu beş sütun hacimli lizis tamponu ile ve ardından 25 mM imidazol ile desteklenmiş beş sütun hacimli lizis tamponu ile yıkayın.
  8. Elute Cin8-GFP-6His elüsyon tamponu ile (bkz. adım 1.1.4).
  9. Salınan numuneleri SDS-PAGE fraksiyonasyonu ile analiz edin, ardından Coomassie mavi boyama ve α-GFP antikoru19 ile incelenen batı leke analizi yapın.
  10. Cin8-GFP-6His içeren fraksiyonları bir araya getirin (adım 2.8 ve 2.9). Ayrıca, 0,5 mL min-1 akış hızında boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve 1,5 MPa kolon basınç sınırında, 280 nm'de absorbansın ve 488 nm'de uyarma ile GFP floresans emisyonunun eşzamanlı izlenmesiyle saflaştırın (Şekil 2A).
  11. Cin8-GFP tetramerine karşılık gelen fraksiyonları toplayın ve bunları SDS-PAGE ve batı lekelemesi ile analiz edin (bkz. adım 2.9) (Şekil 2B).
  12. Spektrofotometri veya Bradford testi, BCA testi gibi biyokimyasal testler kullanarak protein konsantrasyonunu tahmin edin.
  13. Seçilen fraksiyonları alıkoyun, sıvıN2'de anında dondurun ve -80 ° C'de kullanıma kadar saklayın. Bu saflaştırılmış protein örnekleri 6 ay boyunca kullanılabilir.
    NOT: Cin8-GFP, galaktoz ile indüklenebilir promotörden Cin8-GFP-6His aşırı ekspresyonu, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS) için 2 μm plazmid içeren proteaz eksikliği olan bir S. cerevisiae suşundan aşırı eksprese edilir ve saflaştırılır. Maya suşu ve plazmid talep üzerine temin edilebilir.

figure-protocol-1
Resim 2: Cin8-GFP'nin saflaştırılması. (A) Ni-NTA'nın boyut dışlama kromatogramı, 488 nm uyarma ve ~ 510 nm'de emisyon yoluyla sürekli GFP floresan algılaması ile saflaştırılmış Cin8-GFP. Cin8-GFP tetramer, SEC sütunundan (bir okla işaretlenmiş) ~ 10 mL'de süzülür. (B) SEC'den salınan Cin8-GFP fraksiyonlarının Coomassie boyalı SDS-PAGE jeli (üstte) ve α-GFP batı lekesi (altta) Şeritlerdeki örnekler aşağıdaki gibidir: M - Moleküler ağırlık işaretleyicisi, SEC kolonuna yüklenen Ni2 + - Ni-NTA saflaştırılmış Cin8-GFP örneği, GF fraksiyonları: panel A'da işaretlendiği gibi Cin8-GFP SEC elüsyonuna karşılık gelen fraksiyon. Sağdaki ok, Cin8-GFP monomerinin boyutunu gösterir (SDS-PAGE'de beklenir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Saflaştırılmış Cin8 ile tek moleküllü hareketlilik testi

  1. GMPCPP ile stabilize edilmiş MTs etiketli biyotin ve rodamin polimerizasyonu.
    1. MT polimerizasyonuna, aşağıdaki bileşenleri 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırarak başlayın: 1 μL 10 mg/mL tübülin proteini, 1 μL 1 mg/mL biyotinillenmiş tübülin, 0,5 μL 1 mg/mL rodamin etiketli tübülin, 1 μL 10 mM GMPCPP ve 6,5 μL genel tübülin tamponu (GTB). Karışımı 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
    2. MT polimerizasyonunu takiben, 80 μL sıcak (37 ° C) GTB ekleyin, dikkatlice karıştırın ve 20 dakika boyunca 16.500 x g'de santrifüj yapın.
    3. Süpernatantı atın ve 50 μL sıcak GTB ile yukarı ve aşağı pipetle indirerek peleti dikkatlice yeniden askıya alın. Süspansiyonu 28 °C'de saklayın.
    4. MT'leri 647 nm rodamin kanalını kullanarak bir floresan mikroskobu ile inceleyin (Şekil 3A).
      NOT: Biyotinile floresan etiketli MT'ler elde etmek için, polimerizasyon reaksiyonu etiketsiz tübülinin yanı sıra biyotinillenmiş ve floresan etiketli tübülin içerir. Bu protokolde, rodamin etiketli tübülin kullanılır, ancak diğer floresan konjugatlar da kullanılabilir.
  2. Akış Odası montajı
    1. Bant şeritleri arasında üç 'şerit' oluşturmak için gelişmiş bir yapışkan cam slayt üzerine (daha uzun kenara paralel ve ~3-4 mm arayla) dört çift taraflı bant şeridi (~4 cm x ~3 mm) yerleştirerek bir akış odası monte edin. Koruyucu kağıdı bant şeritlerinden çıkarın ve hacimce ~10 μL'lik üç akış odası oluşturmak için bant şeritlerine silanize edilmiş bir kapak kayması10 yerleştirin.
  3. Avidin kaplı yüzeye MT immobilizasyonu (Şekil 1)
    1. Silanize kapak kaymasını, 15 μL 1 mg / mL biyotinillenmiş sığır serum albümini (b-BSA, GTB'de çözünmüş) ile bir mikropipet kullanarak akış odasına perfüze ederek kaplayın. 5 dakika sonra, odayı 80 μL GTB ile yıkayın.
    2. Daha sonra, adım 3.3.1'de olduğu gibi, b-BSA'ya bağlanan 1 mg / mL Avidin'in (GTB'de çözünmüş) 15 μL'lik akış odasına yerleştirin. 5 dakika sonra, odayı 80 μL GTB ile yıkayın.
    3. Silanlaştırılmış örtü kayma yüzeyini 20 μL% 1 poloksamer kullanarak pasifleştirin. 3 dakika sonra, 80 μL GTB ile yıkayın.
    4. Biyotinile MT'leri (adım 3.1), tipik olarak GTB'de 1:20'ye kadar seyreltilmiş 20 μL MTs ekleyerek b-BSA-avidin kaplı kapak kapağına takın. Kızakları ters bir konumda, yani kapak kayması karanlık bir nem odasında (örneğin, ıslak mendil kağıdı içeren bir Petri kabı) aşağı bakacak şekilde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 200 μL GTB ile yıkayın.
    5. Akış odasına 30 μL hareketlilik reaksiyonu karışımı uygulayın (bkz. adım 1.3.2).
    6. Cin8-GFP motorlarını (adım 2.13) 20 μL hareketlilik reaksiyonu karışımında seyreltin (bakınız Tablo 1) (tipik olarak 5-10 μM'lik bir son konsantrasyona). Bunları akış odasına uygulayın ve hemen motorların MT'ler boyunca hareketini görüntüleyin.
  4. Motor motilite görüntüleme
    NOT: MT bağlama ve motorların hareketliliği, cıva ark lambası, 100x/1.4 sayısal açıklık hedefi ve biri 647 nm dalga boyuna (rodamin için) diğeri 488 nm dalga boyuna (GFP için) sahip iki floresan bandpass filtre seti ile donatılmış bir epifloresan ters mikroskop kullanılarak izlenmiştir.
    1. Mikroskop hedefine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Akış odasını floresan mikroskop aşamasına, kapak aşağı doğru bakacak şekilde yerleştirin.
    2. Kapak kayması yüzeyine takılı MT'lere odaklanmak için rodamin kanalını açın ve Micro-Manager ImageJ-Fiji yazılımı21'i kullanarak 20 ms pozlama ile görüntü elde edin.
    3. GFP kanalını açın ve Cin8-GFP hareketliliğini analiz etmek için 1 s aralıklı ve 800 ms pozlama ile 90 hızlandırılmış görüntü elde edin.

figure-protocol-2
Şekil 3: MTs ve MT'ye bağlı Cin8-GFP. (A) MTs için iki alandan (sol ve sağ) gelen görüntüler, adım 3.1'de açıklanan protokolü izleyerek polimerize edilmiş ve adım 3.4'te açıklandığı gibi 100x objektif ile görüntülenmiştir. (B) Üst panellerde gösterilen MT'ye iliştirilmiş Cin8-GFP (alt paneller, oklarla işaretlenmiş) için iki alandan (sol ve sağ) görüntüler. Ölçek çubuğu: 4 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Motilite analizi

NOT: Tüm görüntü analizini gerçekleştirin ve ImageJ-Fiji Yazılımını kullanarak kimograflar oluşturun.

  1. Kymograph üretimi
    1. Hızlandırılmış filmi ve ilgili MT alan görüntüsünü açın. Aşağıdaki seçeneği belirleyerek bu iki pencereyi eşitleyin: > Araçlarını Çözümle > Windows'u Eşitle.
    2. Parçalı Çizgi seçeneğini kullanarak bir MT'yi vurgulayın ve bir kymograph elde etmek için Analiz > Multi Kymograph sekmesini kullanın.
  2. Cin8-GFP'nin küme boyutunun belirlenmesi (yani, bir kümedeki Cin8 moleküllerinin sayısı)
    1. Arka Plan Çıkarma İşlemi ve Arka Planı Çıkar seçeneğini kullanarak arka plan çıkarma > düzensiz aydınlatma düzeltmesini gerçekleştirin. Yuvarlanan Top Yarıçapı'nı 100 piksele ayarlayın ve Sürgülü Paraboloid seçeneğini işaretleyin.
    2. Aşağıdaki seçeneği belirleyerek ImageJ-Fiji yazılımının TrackMate eklentisini kullanarak 4 piksel yarıçaplı bir daire içinde zamanın bir fonksiyonu olarak belirli bir hareketli olmayan Cin8-GFP motorun ortalama floresan yoğunluğunu (Şekil 3B) takip edin: TrackMate > Eklentileri > LoG Dedektörü > Basit Tur İzleyici >.
    3. Farklı Cin8-GFP motorlar için adım 4.2.2'yi tekrarlayın. Farklı Cin8-GFP motorlarının floresan yoğunluğunu zamanın bir fonksiyonu olarak çizin.
      NOT: Küme boyutunu ölçmek için deneysel bir strateji - yani, bir kümedeki Cin8 moleküllerinin sayısı - Cin8 kümelenmesi ile ilgili hareketliliğin analizi için bir temel oluşturur. Cin8'e bağlı GFP'nin fotobeyazlatması, tek GFP moleküllerinin Cin8 kümelerinin toplam yoğunluğuna katkısını belirlemek için kullanılır. Örneğin, floresan yoğunlukları ~ 50 keyfi birimlik (a.u.) adımlarda azalır, her bir adım muhtemelen bir GFP molekülünün fotobeyazlatmasını temsil eder (Şekil 4A). Cin8 bir homo-tetramerik motor protein olduğundan, dört GFP molekülü içerir. Bu nedenle, yoğunluğu 200 a.u.≤ olan tüm Cin8 motorlarının tek tetramerik Cin8 molekülleri olması muhtemeldir. Bu yöntemi takiben, Cin8 motor floresansının yoğunluk aralıkları, tek Cin8 molekülleri, Cin8 molekül çiftleri (Cin8 tetramerinin dimer) ve Cin8 oligomerleri için sırasıyla <200, 200-400 ve >400 olarak atanır.
  3. Cin8-GFP motorlar için yoğunluk dağılımı analizi
    1. Adım 4.2.2'de açıklandığı gibi ImageJ-Fiji'deki TrackMate eklentisini kullanarak hızlandırılmış dizinin ilk karesindeki tüm floresan Cin8-GFP motorlarının ortalama floresans yoğunluğunu ölçün.
    2. Cin8-GFP'nin ortalama yoğunluklarının 20 a.u. kutu boyutunda bir histogramını çizin ve histogramın ana zirvesini bir Gauss eğrisine sığdırın (Şekil 4B).
      NOT: Yoğunluk dağılımı analizi, fotobeyazlatma deneylerinden elde edilen Cin8-GFP motorlar için küme boyutu belirlemesini tamamlar. Cin8-GFP popülasyonu için yoğunluk dağılımı histogramına takılan Gauss eğrisi, ~ 125 a.u.'da zirveye ulaşır; bu, bir, iki, üç veya dört floresan (ağartılmamış) GFP molekülü içeren tek tetramerik Cin8 moleküllerinin ortalama yoğunluğu ile tutarlıdır ve her floresan GFP molekülü ~ 50 a.u'ya katkıda bulunur. Böylece, bu yoğunluk dağılımı yöntemini kullanarak, bir GFP molekülünün katkısı da hesaplanabilir, bu da Cin8-GFP moleküllerinin küme boyutunu atamak için daha fazla kullanılabilir.

figure-protocol-3
Şekil 4: Cin8-GFP ağartma profili ve yoğunluk dağılımı. (A) GFP'nin dört farklı Cin8-GFP motorda fotobeyazlatılması. Her biri muhtemelen bir GFP'nin fotobeyazlatmasını temsil eden tek fotobeyazlatma adımları, ~ 50 a.u. (B) Cin8-GFP motorlarının bir hızlandırılmış dizinin ilk karesindeki yoğunluk dağılımı (giriş) floresan yoğunluğunda bir düşüşe yol açar. ~ 125 a.u'da merkezlenmiş Gauss zirvesi (mavi), tek Cin8-GFP moleküllerini temsil eder. Bu zirve, bir, iki, üç veya dört floresan GFP molekülüne sahip tek Cin8 tetramerlerinin ortalama yoğunluğunu sergiler ve her GFP molekülü toplam yoğunluğa ~ 50 a.u. katkıda bulunur (yani, (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. MT rayları boyunca Cin8-GFP moleküllerinin hareketliliğinin izlenmesi
    1. Kaydedilen karelerin hızlandırılmış dizisinde analiz edilecek MT'yi Dikdörtgen aracıyla vurgulayıp Görüntü > Kırp'ı seçerek kırpın.
    2. Analiz için bir floresan Cin8-GFP partikülü seçin. Nokta Aracı ve Ölçüm seçeneklerini kullanarak zaman atlama dizisinin her karesindeki (zaman noktası) parçacık koordinatlarını kaydedin. Hızlandırılmış dizideki diğer floresan parçacıklar için koordinatların benzer kaydını gerçekleştirin.
    3. İncelenen tüm Cin8-GFP parçacıklarına, adım 4.2'de açıklandığı gibi, görünümlerinin ilk karesinde küme boyutu atayın.
  2. Ortalama yer değiştirme (MD) ve ortalama kare yer değiştirme (MSD) analizleri
    1. Adım 4.4'te belirlenen Cin8-GFP hareketlerinin koordinatlarından, verilen koordinatlara sahip iki nokta arasındaki mesafenin hesaplanması için denklemi kullanarak, başlangıç koordinatlarına göre her zaman noktasında Cin8-GFP'nin yer değiştirmelerini hesaplayın:
      figure-protocol-4
      burada d t, Cin8-GFP'nin t zamanındaki yer değiştirmeleridir, x t ve y t,t. x 0 ve y 0 zamanındaki ilgili koordinatlardır,t = 0'daki Cin8-GFP'nin ilgili koordinatlarıdır.
    2. Bu yer değiştirme değerlerinden, belirli bir Cin8-GFP parçacığı için olası tüm zaman aralıkları için yer değiştirmeyi hesaplayın. İncelenen tüm Cin8-GFP parçacıkları için prosedürü tekrarlayın.
    3. İncelenen tüm Cin8-GFP parçacıklarının zaman aralığına karşı ortalama yer değiştirmesini (MD) çizin ve doğrusal bir uyuma, MD = v x t + c'ye tabi olun. Bu uyumun eğimi (v), hareketli Cin8-GFP parçacıklarının ortalama hızını temsil eder.
      NOT: Bu şekilde, her küme boyutuna ait tüm Cin8-GFP moleküllerinin ortalama hızı, farklı küme boyutlarının hareketliliğini karakterize ederek ayrı ayrı hesaplanabilir. MD analizine ek olarak, ortalama kare yer değiştirme (MSD) analizi, adım 4.5.1 ve 4.5.2'de hesaplanan yer değiştirme değerlerinin karesi alınarak da gerçekleştirilebilir. MSD değerleri zaman aralığına göre çizilir ve MSD = v 2 x t2 + 2D x t + c polinom eğrisine takılır ve Cin8-GFP hareketinin difüzyon katsayısı olan ek D parametresini verir. MD analizi, MTs 8,10 işaretli polarite üzerinde yapılmalıdır, oysa MSD analizi için MT polaritesinin bilgisi gerekli değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deney, tek MT'ler üzerinde farklı küme boyutlarındaki çift yönlü motor protein Cin8'in hareketlilik özelliklerini araştırmayı amaçlamaktadır. Cin8-GFP'nin temsili motilitesi, motorun zaman içindeki uzamsal konumunun gösterildiği Şekil 5A'daki kimograflardan da belirgindir.

Cin8-GFP'nin hareketli özelliklerinin analizi için, ilk olarak, MT'ye bağlı her bir hareketli Cin8-GFP parçacığına küme boyutu atanır (adım 4.3) ve daha sonra incelenen Cin8 parçacıklarının konu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, çift yönlü kinezin-5 Cin8 ile tek moleküllü motilite testi için bir protokol ve motilitenin analizi sunulmuştur. C-terminalindeki doğal nükleer lokalizasyon sinyalini (NLS) içeren tam uzunluktakiCin8 18 , yerli konakçı S. cerevisiae'den arındırılmıştır. Cin8 bir nükleer motor proteini olduğundan, S. cerevisiae hücrelerinin sıvı azot altında öğütülmesi, hücre lizisi için en etkili yöntem olarak bulunmuştur. Lizisten sonra, metal afinitesi ve boyut dışlama kromatograf...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma kısmen İsrail Bilim Vakfı hibesi (ISF-386/18) ve L.G.'ye verilen İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı hibesi (BSF-2019008) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AdeninFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biyotinillenmiş-BSASigmaA8549
KazeinSigmaC7078
Katalaz (C40)SigmaC40
Kreatin-KinazSigmaC3755
Ditiotreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Chromaiçin floresan filtre seti: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Chromaiçin floresan filtre seti: ET-CY3/TRITC
Floresan ters mikroskopZeissAxiovert 200M
GalaktozTivan BiotechGAL02
GlikozSigmaG8270
Glikoz OksidazSigmaG7141
GliserolSigmaG5516
GlisilGlisinMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBHücre İskeletiBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI yazılımıhttps://imagej.net/plugins/trackmate/sürüm 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] Windows 10
için İmidazolSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein LekesiAbcamab119211
LensZeiss100x/1.4 yağ DIC objektif
LizinFORMEDIUMDOC0161
Magnezyum KlorürSigmaM8266
MetiyoninDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TeknolojilerisCMOS kamera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgarozInvitrogenR901-15
Fosfo-KreatinSigmaP1937
BorularSigmaP1851
Pluronik asit F-127 (poloksamer)SigmaP2443
Potasyum KlorürSigmaP9541
RafinozTivan BiotechRAF01
Boyut Dışlama kromatografi cihazıGE HealthcareAKTA Saf
SpektrofotometreThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Sağlık17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TriptofanDuchefa BiyokimyaT0720.0100
Tübülin proteiniHücre iskeletiT240
Tübülin, biyotinileHücre İskeletiT333P
Tübülin, TRITC RhodamineHücre İskeletiTL530M
UrasilSigmaU0750-100G
Maya nitrojen bazıFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP antikoruSanta Cruz BiyoteknolojiSC8036
β-merkaptoetanolSigmaM3148
GFP 49002Rhodamine 49004

Kaynaklar

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036(2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687(2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999(2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131(2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597(2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772(2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Etiketler

Kinesin 5 MotilitesiCin8 Motor ProteiniTek Molek l MotilitesiMotor Proteini K melenmesiMikrot b l Dinami iift Y nl Motor ProteiniBoyut D lama KromatografisiFloresan MikroskobuSaccharomyces CerevisiaeGFP Etiketlemesi

İlgili makaleler