Yöntem makalesi

Hipofiz Kök Hücre Biyolojisini Keşfetmek için Fare Hipofizinden In Vitro Model Olarak Organoidlerin Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/63431

⸱

25 Şubat 2022

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipofiz bezi, vücudun endokrin sisteminin anahtar düzenleyicisidir. Bu makalede, fare hipofizinden organoidlerin gelişimi, biyolojisi ve işlevi tam olarak anlaşılamayan bezin kök hücre popülasyonunu incelemek için yeni bir 3D in vitro model olarak açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipofiz, vücut büyümesi, metabolizma, cinsel olgunlaşma, üreme ve stres tepkisi dahil olmak üzere temel fizyolojik süreçleri düzenleyen ana endokrin bezidir. On yıldan fazla bir süre önce, hipofiz bezinde kök hücreler tanımlandı. Bununla birlikte, transgenik in vivo yaklaşımların uygulanmasına rağmen, fenotipleri, biyolojileri ve rolleri belirsizliğini korumaktadır. Bu gizemin üstesinden gelmek için, hipofiz kök hücre biyolojisini derinlemesine çözmek için yeni ve yenilikçi bir organoid in vitro model geliştirilmiştir. Organoidler, tanımlanmış kültür koşulları altında, bir dokunun (epitelyal) kök hücrelerinden kendi kendini geliştiren ve bu kök hücrelerin ve dokularının çoklu özelliklerini özetleyen 3D hücre yapılarını temsil eder. Burada, fare hipofiz kaynaklı organoidlerin bezin kök hücrelerinden geliştiği ve in vivo fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini sadık bir şekilde özetlediği gösterilmiştir. Diğerlerinin yanı sıra, kök hücrelerin aktivasyon durumunu, transjenik olarak verilen lokal hasara yanıt olarak meydana gelen in vivo olarak yeniden üretirler. Organoidler uzun süreli genişletilebilirken, sap fenotiplerini sağlam bir şekilde korurlar. Yeni araştırma modeli, yenidoğan olgunlaşmasından yaşlanmaya bağlı solmaya ve sağlıklıdan hastalıklı bezlere kadar değişen hipofiz yeniden yapılanmasının temel koşulları sırasında kök hücrelerin fenotipini ve davranışını deşifre etmek için oldukça değerlidir. Burada, hipofiz kök hücrelerinin henüz esrarengiz dünyasına dalmak için güçlü bir araç sağlayan fare hipofiz türevi organoidleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipofiz, hipotalamusa bağlı olduğu beynin tabanında bulunan küçük bir endokrin bezidir. Bez, ayarlanmış ve koordine edilmiş bir hormon salınımı oluşturmak için periferik ve merkezi (hipotalamik) girdileri bütünleştirir, böylece uygun zamanda uygun hormonları üretmek için aşağı akış hedef endokrin organlarını (adrenal bezler ve gonadlar gibi) düzenler. Hipofiz, endokrin sistemin anahtar düzenleyicisidir ve bu nedenle haklı olarak ana bez1 olarak adlandırılır.

Fare hipofizi üç lobdan oluşur (Şekil 1), yani ön lob (AL), ara lob (IL) ve arka lob (PL). Majör endokrin AL, büyüme hormonu (GH) üreten somatotroplar da dahil olmak üzere beş hormonal hücre tipi içerir; prolaktin (PRL) üreten laktotroplar; adrenokortikotropik hormon (ACTH) salgılayan kortikotroplar; tiroid stimüle edici hormon (TSH) üretiminden sorumlu tirotroplar; ve luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) yapan gonadotroplar. PL, oksitosin ve vazopressin (antidiüretik hormon) hormonlarının depolandığı hipotalamustan aksonal projeksiyonlardan oluşur. IL, AL ve PL arasında bulunur ve melanosit uyarıcı hormon (MSH) üreten melanotropları barındırır. İnsan hipofizinde, IL gelişim sırasında geriler ve melanotroplar AL1 içinde yayılır. Endokrin hücrelere ek olarak, hipofiz bezi ayrıca esas olarak transkripsiyon faktörü SOX2 2,3,4,5,6 ile işaretlenmiş bir kök hücre havuzu içerir. Bu SOX2 + hücreleri, marjinal bölgede (MZ), yarığın epitel astarında (AL ve IL arasında embriyonik bir kalıntı lümen) bulunur veya AL'nin parankimi boyunca kümeler halinde yayılır, böylece bezde iki kök hücre nişi önerir (Şekil 1)2,3,4,5,6.

Hipofizin vazgeçilmez doğası göz önüne alındığında, bezin arızalanması ciddi morbidite ile ilişkilidir. Hiperpituitarizm (bir veya daha fazla hormonun aşırı salgılanması ile karakterizedir) ve hipopituitarizm (bir veya daha fazla hormonun kusurlu veya eksik üretimi) hipofiz nöroendokrin tümörlerinden (PitNET'ler; örneğin, Cushing hastalığına yol açan ACTH üreten tümörler) veya genetik kusurlardan (örneğin, cücelikle sonuçlanan BH eksikliği) kaynaklanabilir7. Ek olarak, hipofiz cerrahisi (örneğin, tümörleri çıkarmak için), enfeksiyonlar (örneğin, hipotalamik-hipofiz tüberkülozu veya bakteriyel menenjit veya ensefalit sonrası enfeksiyonlar), Sheehan sendromu (doğumda ağır kan kaybına bağlı yetersiz kan akışı nedeniyle nekroz), hipofiz apopleksi ve travmatik beyin hasarı, hipofiz hipofonksiyonunun diğer önemli nedenleridir8 . Fare hipofizinin rejeneratif kapasiteye sahip olduğu, endokrin hücrelerin transgenik ablasyonu ile ortaya çıkan lokal hasarı onarabildiği gösterilmiştir 9,10. SOX2 + kök hücreleri, artmış proliferasyon (kök hücre genişlemesi ile sonuçlanan) ve köklükle ilgili faktörlerin ve yolakların (örneğin, WNT / NOTCH) artan ekspresyonu ile işaretlenmiş aktif bir fenotip gösteren hasara akut tepki verir. Dahası, kök hücreler ablatlanmış hormonu eksprese etmeye başlar ve sonunda tükenmiş hücre popülasyonunun 9,10 ay boyunca (5 ila 6) önemli ölçüde restorasyonu ile sonuçlanır. Ayrıca, bezin yenidoğan olgunlaşma aşamasında (doğumdan sonraki ilk 3 hafta), hipofiz kök hücreleri aktif bir durumda gelişir 6,11,12,13, oysa organizma yaşlanması, yaşlanmada (veya 'yanflamasyon') artan enflamatuar (mikro-) ortam nedeniyle in situ kök hücre işlevselliğinin azalmasıyla ilişkilidir10,14 . Ek olarak, bezdeki tümörigenez de kök hücre aktivasyonu ile ilişkilidir 7,15. Kök hücre aktivasyonu çeşitli hipofiz yeniden şekillenme durumlarında tespit edilmiş olmasına rağmen (7,16'da gözden geçirilmiştir), altta yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İn vivo yaklaşımlar (transgenik farelerde soy izleme gibi) hipofiz kök hücrelerinin net veya kapsamlı bir resmini sunmadığından, normal ve hastalıklı hipofizde kök hücre biyolojisini keşfetmek için güvenilir in vitro modellerin geliştirilmesi esastır. Primer hipofiz kök hücrelerinin standart in vitro kültürü, çok sınırlı büyüme kapasitesi ve hızlı fenotip kaybı olan fizyolojik olmayan (2D) koşullar nedeniyle yetersiz kalmaktadır (daha ayrıntılı bir genel bakış için bkz.16). 3D küre kültürleri (pituisferler), yan popülasyon ve SOX2 + fenotip 2,3,4 ile tanımlanan hipofiz kök hücrelerinden kurulmuştur. Pitusferler klonal olarak kök hücrelerden büyür, saplılık belirteçlerini eksprese eder ve endokrin hücre tiplerine farklılaşma kapasitesi gösterir. Bununla birlikte, sadece sınırlı geçitlilik (2-3 pasaj) gösterirken önemli ölçüde genişlemezler3,4. Küre benzeri yapılar, 1 hafta boyunca% 50 seyreltilmiş Matrigel'de kültürlendiğinde ayrışmamış hipofiz kök hücre kümelerinden de elde edildi, ancak genişletilebilirlik gösterilmedi17. Pituisfer yaklaşımı çoğunlukla kök hücre sayıları için bir okuma aracı olarak kullanılır, ancak daha sonraki uygulamalar daha düşük genişleme kapasitesi16 ile sınırlıdır.

Bu eksiklikleri ele almak ve üstesinden gelmek için, yakın zamanda MZ ve parankimal kök hücreleri içeren farelerin majör endokrin AL'sinden başlayarak organoidler olmak üzere yeni bir 3D model kurulmuştur. Organoidlerin gerçekten de hipofizin kök hücrelerinden türetildiği ve fenotipleri18'i sadık bir şekilde özetlediği gösterilmiştir. Dahası, organoidler uzun süreli genişletilebilirken, saplılık doğalarını sağlam bir şekilde korurlar. Bu nedenle, derin keşif için birincil hipofiz kök hücrelerini genişletmek için güvenilir bir yöntem sağlarlar. Bu tür bir araştırma, bir hipofizden izole edilebilen sınırlı sayıda kök hücre ile elde edilemez, bunlar da 2D koşullarda genişletilemez16. Organoidlerin yeni hipofiz kök hücre özelliklerini ortaya çıkarmak için değerli ve güvenilir araçlar olduğu gösterilmiştir (in vivo'ya çevrilebilir)14,18. Önemli olarak, organoid model, lokal doku hasarı ve yenidoğan olgunlaşması sırasında meydana gelen hipofiz kök hücre aktivasyon durumunu sadık bir şekilde yansıtmakta, gelişmiş oluşum etkinliği göstermekte ve yukarı regüle moleküler yolları kopyalamaktadır14,18. Bu nedenle, hipofiz kaynaklı organoid modeli, yenilikçi ve güçlü bir hipofiz kök hücre biyolojisi araştırma modelinin yanı sıra bir kök hücre aktivasyon okuma aracıdır.

Bu protokol, fare hipofiz türevi organoidlerin oluşumunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu amaçla, AL izole edilir ve hücre dışı matrisi taklit eden Matrigel'e (bundan böyle ECM olarak anılacaktır) gömülü olan tek hücrelere ayrışır. Hücre-ECM grubu daha sonra, esas olarak kök hücre büyüme faktörleri ve hipofiz embriyonik düzenleyicileri içeren tanımlanmış bir ortamda kültürlenir (ayrıca 'hipofiz organoid ortamı' (PitOM) 18; Tablo 1). Organoidler tamamen geliştikten sonra (10-14 gün sonra), sıralı pasajda daha da genişletilebilir ve kapsamlı aşağı akış araştırmasına tabi tutulabilirler (örneğin, immünofloresan, RT-qPCR ve toplu veya tek hücreli transkriptomikler; Şekil 1). Uzun vadede, hipofiz kök hücre organoidlerinin doku onarımı yaklaşımlarına ve rejeneratif tıbba giden yolu açması beklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için hayvan deneyleri, KU Leuven Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (P153/2018) tarafından onaylanmıştır. Tüm fareler, standart koşullar altında (23 ± 1.5 ° C'lik sabit sıcaklık, bağıl nem% 40 -% 60 ve 12 saatlik bir gündüz / gece döngüsü) üniversitenin hayvan tesisinde barındırıldı.

1. Fareler

  1. Genç-yetişkin yaştaki (8-12 haftalık) C57BL/6J fareler gibi piyasada satılan fare suşlarını kullanın. Genel olarak, 2-3 fare, protokol için yeterli sayıda AL hücresi sağlar.

2. Fare AL'nin izolasyonu ve ayrışması

NOT: Orta A, B ve C19,20 önceden hazırlanmıştır. Kompozisyonlar Tablo 2'de gösterilmiştir.

  1. Fare AL'nin izolasyonu
    1. Fareleri CO2 boğulması, ardından kafa kesme ile ötenazileştirin (Şekil 2A). Kanı çıkarmak için fare kafalarını deiyonize suyla yıkayın ve steril bir ortam oluşturmak için% 70 EtOH ile püskürtün.
    2. Steril cerrahi aletler kullanarak, başın derisini kulaklar arasında çıkarın (Şekil 2B).
    3. Kafatasını açın ve beyni çıkarın.
      1. 'Burun köprüsünü' kırın (yani, ön kemiğin ön kısmı; Şekil 2B) steril makaslı.
      2. Kafatasını kırık burun köprüsünden başlayarak kulaklara doğru makasla her iki taraftan da açın (Şekil 2C).
      3. Kafatasını ve beyni hipofiz bezine dokunmadan steril cımbızla çıkarın (Şekil 2D).
    4. Diyafram sellae'yi hipofize zarar vermeden künt cımbızla çıkarın. PL ve IL'yi AL'den bir stereomikroskop altında atın.
      NOT: PL ve IL birbirine bağlanır ve böylece aynı anda çıkarılır. Bu kısımlar pembe renkli AL'ye kıyasla beyaz doku olarak görünür (Şekil 2D).
    5. AL'yi künt cımbızla dikkatlice izole edin ve 3 mL orta A ile doldurulmuş 10 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde toplayın (bkz. Tablo 2). Şişeyi daha sonraki işlemlere kadar buzun üzerine yerleştirin.
  2. Fare AL'nin ayrışması
    1. Süpernatant (SN) ortam A'yı izole AL içeren Erlenmeyer şişesinden çıkarın. 2 mL önceden ısıtılmış (37 ° C)% 2.5 tripsin çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Tripsin çözeltisini çıkarmadan, 2 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) DNaz çözeltisi ekleyin (orta A'da 2 μg / mL; 0.22 μm'lik bir ağdan steril filtrelenmiş) ve Erlenmeyer şişesini 10 kez döndürün. Hipofizin dibe batmasına izin verin (~ 1 dakika) ve SN'yi çıkarın.
    3. 2 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) tripsin inhibitörü çözeltisi (orta A'da 0.1 mg / mL; 0.22 μm'lik bir ağdan steril filtrelenmiş) ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hipofiz tortusunu dibe bırakın ve SN'yi çıkarın.
    4. 2 mL önceden ısıtılmış (37 °C) orta B ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 5 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. SN'yi çıkarmadan, 2 mL önceden ısıtılmış (37 °C) orta C ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    5. Hipofizin dibe batmasına izin verin ve SN'yi çıkarın. Hipofizi önceden ısıtılmış (37 °C) orta C ile üç kez durulayın.
    6. Hipofizi tek hücrelere ayırın.
      1. 2 mL önceden ısıtılmış (37 °C) orta C ekleyin Aspire edin ve parçalar artık görünmeyene kadar steril, alevle parlatılmış bir Pasteur pipetle hipofiz bezini birkaç kez çıkarın.
      2. Süspansiyonu, 4,5 mL önceden ısıtılmış (37 °C) DNaz çözeltisi (orta A'da 2 μg / mL; 0,22 μm'lik bir ağdan steril filtrelenmiş) ile 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Erlenmeyer'i 2 mL önceden ısıtılmış (37 °C) orta C ile üç kez durulayın ve süspansiyonu 15 mL tüpe aktarın.
    7. Toplanan hücre süspansiyonunu karıştırın ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 30 mL'lik bir tüpe süzün. 15 mL'lik tüpü ve hücre süzgecini 2 mL orta C ile üç kez durulayın ve süspansiyonu 30 mL tüpe aktarın.
    8. 2 mL'lik %3'lük sığır serum albümini (BSA) çözeltisi (orta A'da; 0,22 μm'lik bir ağdan steril olarak filtrelenmiş) ile doldurulmuş bir cam Pasteur pipetinin ucunu tüpün dibine yerleştirin ve görünür bir yoğunluk tabakası oluşturmak için pipeti yavaşça dışarı doğru çekin. 4 °C'de 10 dakika boyunca 190 x g'de santrifüj.
    9. Tüpü tek bir akıcı hareketle ters çevirerek SN'yi çıkarın ve kalan SN damlacıklarını bir P1000 ucuyla çıkarın. Hücre peletini 1 mL buz gibi soğuk Gelişmiş DMEM / F12 (Adv DMEM / F12) içinde yeniden askıya alın ve hücreleri bir hücre sayacı ile sayısallaştırın.

3. AL türevi organoidlerin kurulması ve kültürlenmesi

NOT: ECM'yi önceden buz üzerinde çözün (1 mL için 2-3 saat) ve protokol süresince buz üzerinde tutun.

  1. Organoid tohumlama ve kültürleme
    1. AL hücresi süspansiyonunu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 190 x g'de santrifüj yapın ve SN'yi çıkarın. Adv DMEM / F12'deki hücre peletini, 1.1 x 106 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğuna ulaşmak için hesaplanan spesifik hacmi kullanarak yeniden askıya alın.
      NOT: Örneğin, hücre süspansiyonu 500.000 hücre / mL içeriyorsa, istenen 1.1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğa ulaşmak için hücre peletini 454.54 μL Adv DMEM /F12'de yeniden askıya almalıdır.
    2. Kaplama için gereken hücre süspansiyonunun hacmini çıkarın (organoid gelişimi için tohuma istenen kuyucuk sayısına göre) ve 30:70 oranında ECM ekleyin (% 30 hücre süspansiyonu (Adv DMEM / F12'de) ve% 70 ECM). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
      NOT: Örneğin, 30 μL'lik bir damlacık için (bkz. adım 3.1.3), 9 μL hücre süspansiyonu (1.1 x 106 hücre/mL süspansiyondan alındığında ~10.000 hücre içeren) 21 μL ECM ile (nazikçe) karıştırılmalıdır.
    3. Kuyu başına, hücre süspansiyonu / ECM karışımının 30 μL'lik bir damlasını (bkz. adım 3.1.2) önceden ısıtılmış (37 ° C) 48 delikli bir plaka üzerine koyun. Plakayı baş aşağı çevirin ve ECM'nin 20 dakika boyunca 37 °C'de katılaşmasına izin verin.
      NOT: Kültür plakalarını 37 °C'de en az 24 saat önceden ısıtın.
    4. Plakayı uygun yönüne geri döndürün ve 10 μM Kaya İnhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 250 μL önceden ısıtılmış (37 ° C) PitOM (bakınız Tablo 1) dikkatlice ekleyin.
    5. Organoidler tamamen büyüyene kadar her 2-3 günde bir ortamı (Y-27632'den yoksun) değiştirerek organoidleri kültürlemeye devam edin, bu da 10-14 gün sürer (Şekil 3A). Ardından, organoidleri geçirin.
      NOT: Ortamı aspire ederken, ECM kubbesini bozmadığınızdan emin olun. Kültür plakasını hafifçe eğin ve ortamı kuyucuğun alt kenarından çıkarın. Taze (37 °C'de önceden ısıtılmış) ortam kuyunun kenarına nazikçe eklenmelidir. Jel damlacıkları yapışırsa, organoidleri toplayın ve yeni bir ECM damlacığında tekrar askıya alın ve kültürleyin.
  2. Organoid pasaj
    1. Ortamı nazikçe aspire edin ve ECM'yi parçalamak ve organoidleri bir mikrosantrifüj tüpünde toplamak için 400 μL buz gibi soğuk Adv DMEM / F12 ekleyin. 400 μL buz gibi soğuk Adv DMEM/F12 EM ile bir kez yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    2. SN'yi dikkatlice çıkarın ve 400 μL önceden ısıtılmış (37 ° C) TripLE Express Enzimi (1X) ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    3. 400 μL buz gibi soğuk Adv DMEM/F12 ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. SN'yi kaldırın.
    4. Peleti 100 μL buz gibi soğuk Adv DMEM/F12 ile yeniden askıya alın ve daha sonra organoid fragmanlar (yaklaşık 50 μm çapında) elde edilene kadar daralmış bir P200 ucu ile yukarı ve aşağı kuvvetli bir şekilde pipetleyerek organoidleri parçalayın (yani, boş ucu mikrosantrifüj tüpünün dibine doğru itin, açılma çapını azaltmak için) (Şekil 3B).
      NOT: Ayrışma karışımı ağırlıklı olarak organoid fragmanlar ve sadece birkaç tek hücre içermelidir. Organoidlerin tek hücrelere sert ayrışması, organoidlerin yeniden büyümesini olumsuz yönde etkiler.
    5. 800 μL Adv DMEM/F12 ekleyin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 190 x g'de santrifüj yapın. SN'yi kaldırın.
    6. Organoidleri 1: 2 ila 1: 4 oranında geçirin. Pelet, kaplama için gerektiği gibi yeterli miktarda Adv DMEM/F12 içinde yeniden askıya alın ve 30:70 oranında ECM ekleyin (%30 hücre süspansiyonu ve %70 ECM). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
    7. Tohum ve kültür organoidleri yukarıda 3.1.3-3.1.5 adımlarında açıklandığı gibi.
      NOT: Ortalama olarak, tohumlanan 10.000 bütün AL hücresinden (% 0.2) kuyu başına 20 organoid gelişir. Bu pasaj 0 organoidleri 1: 2 oranında bölünebilir ve bu da kuyu başına >50 organoid gelişmesiyle sonuçlanır (pasaj 1). Organoidler daha sonra sonraki pasajlar sırasında 1: 2 ila 1: 4 oranında bölünebilir. Organoidlerin yeniden büyümesi, ~ 10 pasajdan sonra yavaşlar (3 aylık kültüre karşılık gelir), giderek daha az ve daha küçük organoidlerde somutlaşır.

4. AL türevi organoidlerin kriyoprezervasyonu ve çözülmesi

  1. Organoidlerin kriyoprezervasyonu
    1. Adım 3.2.1'den adım 3.2.5'e kadar geçiş protokolünü izleyin.
    2. Organoid peleti (fragmanlar ve hücreler içeren) 1 mL kriyoprezervasyon ortamı ile yeniden askıya alın (Tablo 3). Süspansiyonu bir kriyovale aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: 48 delikli plakanın dört kuyucuğundan organoidler (yani, ortaya çıkan parçalar ve hücreler) bir kriyovyalde birleştirilebilir.
    3. Kriyovalleri dondurucu bir kaba koyun ve -80 ° C'ye aktarın.
    4. 24 saat sonra, numuneleri bir kriyokutuya aktarın ve uzun süreli depolama için sıvı azotta (-196 ° C) saklayın.
  2. Kriyokorunmuş organoidlerin çözülmesi
    1. Kriyovyali sıvı azot tankından çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Hemen çözme protokolüne devam edin.
    2. Çözeltiyi kriyokorunmuş organoid parçaları ve tek hücrelerle 37 ° C'de (su banyosu) çözün.
      NOT: DMSO tarafından hücre toksisitesini önlemek için çözeltiyi 37 ° C'de 2 dakikadan fazla tutmayın.
    3. İçeriği, %30 fetal sığır serumu (FBS) ile 10 mL buz gibi soğuk Adv DMEM/F12 içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Kriyovyayı %30 FBS ile 1 mL Adv DMEM/F12 ile durulayın.
    4. 4 °C'de 10 dakika boyunca 190 x g'de santrifüj. Peleti 1 mL buz gibi soğuk Adv DMEM / F12 ile yeniden askıya alın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 190 x g'de santrifüj. Pelet, kaplama için gerektiği gibi yeterli miktarda Adv DMEM / F12 içinde yeniden askıya alın ve 30:70 oranında ECM ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
    6. Tohum ve kültür organoidleri yukarıda 3.1.3-3.1.5 adımlarında açıklandığı gibi.

5. AL türevi organoidlerin doğrulanması

  1. RNA izolasyonu için organoidlerin toplanması ve lizisi
    1. Yukarıda açıklandığı gibi organoidleri toplayın ve santrifüj edin (adım 3.2.1).
    2. SN'yi çıkarın ve% 1 2-merkapto-etanol ile 350 μL lizis tamponu ekleyin. 30 s boyunca vorteks yapın ve -80 ° C'de saklayın veya hemen RNA izolasyonuna geçin.
      DİKKAT: 2-merkapto-etanolün toksik bir bileşik olduğuna dikkat edin. Tüm işler nitril eldiven, toz maskesi ve güvenlik gözlüğü takarken kimyasal bir duman başlığında yapılmalıdır. 2-Merkapto-etanol gözlerde ve ciltte geri dönüşü olmayan hasara neden olabilir.
  2. İmmüno-histokimya/-floresan boyama için organoidlerin sabitlenmesi ve gömülmesi
    1. Yukarıda açıklandığı gibi organoidleri toplayın ve santrifüj edin (adım 3.2.1).
    2. SN'yi çıkarın, 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve yörüngesel bir çalkalayıcıda (100 rpm) oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca inkübe edin.
      DİKKAT: PFA, korneada geri dönüşü olmayan hasara neden olabilen bilinen bir insan kanserojenidir. Tüm işler kimyasal bir duman davlumbazında yapılmalıdır. Nitril eldivenler ve güvenlik gözlükleri her zaman giyilmelidir.
    3. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve SN'yi çıkarın. 1 mL PBS ekleyin, yörüngesel çalkalayıcıda (100 rpm) RT'de 10 dakika inkübe edin ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 90 x g'de santrifüj yapın. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın. PBS'de 4 °C'de saklayın.
    4. Doku işleme ve dehidrasyon için, SN'yi çıkarın ve önceden ısıtılmış genişletilmiş bir p200 ucu (ucun küçük bir parçasını keserek yapılmış) kullanarak organoid pelete 150 μL% 2 agaroz jeli (PBS cinsinden) ekleyin. Hemen tüm hacmi yukarı doğru pipetleyin ve mikrosantrifüj tüpünün kapağına çıkarın.
      NOT: Organoidleri içeren jel hızla katılaşacağından hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir.
    5. Jelin 30 dakika boyunca sıkıca katılaşmasına izin verin ve jel diskini bir histoloji kasetine taşıyın. Doku işlemcisinde dehidrasyona kadar% 50 EtOH'ye daldırın ve saklayın.
    6. Parafin gömme için, jel diski (forseps kullanarak) bir gömme kalıbına yerleştirin ve ılık parafin (60 ° C) ile doldurun. Parafin katı olana kadar (yaklaşık 45 dakika) kalıpları 4 ° C'ye yerleştirin. Bu numuneler 4 °C'de saklanabilir veya hemen kesitlemeye tabi tutulabilir.
    7. 5 μm kalınlığında organoidler içeren parafin blokları mikrotom ve örnekleri cam slaytlar üzerinde toplar. Bölümün düzgün bir şekilde gerilmesine izin vermek için her bölümün altına bir damla deiyonize su ekleyin ve slaytları gece boyunca 37 ° C'de düz bir ısıtma plakasına yerleştirin. Slaytları 4 °C'de kesitlerle saklayın veya doğrudan immünohistokimyasal veya immünofloresan boyama ile devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AL'nin izolasyonu ve ayrışmasından sonra, elde edilen tek hücreler ECM'de tohumlanır ve PitOM'da yetiştirilir (Şekil 1, Tablo 1). Şekil 3A, tohumlamadaki hücre kültürünü ve yoğunluğunu gösterir (Gün 0). Bazı küçük döküntüler mevcut olabilir (Şekil 3A, beyaz ok uçları), ancak pasajda kaybolacaktır. Tohumlamadan on dört gün sonra, AL türevi organoidler tamamen gelişir (Şekil 3A). Organoid...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AL türevi organoidler, burada açıklandığı gibi, in vitro hipofiz kök hücrelerini incelemek için güçlü bir araştırma modelini temsil eder. Şu anda, bu organoid yaklaşım, birincil hipofiz kök hücrelerini güvenilir ve sağlam bir şekilde büyütmek ve genişletmek için mevcut tek araçtır. Embriyonik kök hücrelerden (ESC) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) türetilen ve hipofiz embriyonik organogenezi23'ü yakından özetleyen bir hipofiz organoid modeli daha önce bildirilmiştir; Bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, KU Leuven Araştırma Fonu ve Bilimsel Araştırma Fonu (FWO) - Flanders'ın hibeleriyle desteklendi. E.L. (11A3320N) ve C.N. (1S14218N), FWO/FWO-SB'den doktora bursu ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM6250
48 oyuklu plakalar, TC ile işlenmiş, ayrı ayrı sarılmışCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Gelişmiş DMEM/F12Gibco12634010
Albümin Sığır (hücre kültürü sınıfı)Serva47330
B-27 Takviyesi ( 50X), eksi A vitaminiGibco12587010
Baz kalıplarıVWR720-1918
Tampon RLTQiagen79216
Kasetler, Q Yolu MicrotwinVWR720-2191
Hücre süzgeci, 40 & m mesh, tek kullanımlıkFalcon352340
Vibrio'dan Kolera Toksini choleraeSigma-AldrichC8052
Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz ISigma-AldrichD5025
D-glikozMerck108342
Dimetilsülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM, toz, yüksek glikozluGibco52100039
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 1,5 mLEppendorf30120086
Epredia SuperFrost Plus Yapışma kızaklarıThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar Gömme İş İstasyonu, 220 - 240VacThermo Fisher Scientific12587976
Etanol Mutlak %99,8+ThermoFisher Scientific
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX TakviyesiGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES Tampon ÇözeltisiGibco15630056
İçi Çözelti Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030081
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran Matrisi, LDEV İçermeyenCorning15505739
Mr. Frosty Dondurma KabıThermo Fisher Scientific5100-0001
N-2 Takviyesi (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-Asetil-L-sisteinSigma-AldrichA7250
Nunc Biyobankacılık ve Hücre Kültürü Kriyojenik TüplerThermo Fisher Scientific375353
Sentez için paraformaldehit (PFA)Merck818715
Penisilin G sodyum tuzuSigma-AldrichP3032
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140122
Fenol kırmızısıMerck107241
Potasyum Klorür (KCl)Merck104936
Rekombinant İnsan EGF Proteini, CFR& D sistemleri236-EG
Rekombinant İnsan FGF temel/FGF2/bFGF (157 aa) ProteinR& D sistemleri234-FSE
Rekombinant İnsan FGF-10Peprotech100-26
Rekombinant İnsan IGF-1Peprotech100-11
Rekombinant İnsan IL-6Peprotech200-06
Rekombinant İnsan NogginPeprotech120-10C
Rekombinant İnsan R-Spondin-1Peprotech120-38
Rekombinant İnsan/Murin FGF-8bPeprotech100-25
Rekombinant Fare Sonic Kirpi/Şş (C25II) N-TerminaliR& D sistemleri464-SH
RNeasy mikro kitiQiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodyum Klorür (NaCl)BDH102415K
Sodyum di-Hidrojen Fosfat 1-hidratPanReac-AppliChemA1047
Sodyum Hidrojen Karbonat (NaHCO3)Merck106329
Sodyum-Piruvat (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0.22 & mikro; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Steril Santrifüj Tüp Üst Filtre Ünitesi, 0.22 & mu; mMilliporeSCGP00525
Steril suFreseniusB230531
Streptomisin sülfat tuzuSigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES Doku İşlemcisiThermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express Enzim (1X), fenol kırmızısıThermo Fisher Scientific12605028
Glisin max (soya fasulyesi)Sigma-AldrichT9003
Tripsin çözeltisinden Tripsin inhibitörü %2.5Thermo Fisher Scientific15090046
10342652 PBS, pH 7.4 Gibco 10010023

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
  4. Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
  5. Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
  6. Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
  7. Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).
  8. Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
  9. Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
  10. Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
  11. Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
  12. Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
  13. Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142(2021).
  14. Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).
  15. Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
  16. Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).
  17. Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
  18. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  19. Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
  20. Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
  21. Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
  22. Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111(2013).
  23. Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
  24. Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
  25. Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
  26. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  27. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  28. Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hipofiz OrganoidleriHipofiz K k H creleriOrganoid K lt rEpiteliyal Mark rlermm nofloresan BoyamaOrganoid PasajlamaKistik MorfolojiK k H crelik Mark rleri

İlgili makaleler