Yöntem makalesi

Bitki-Mantar Etkileşiminde Pektini Tespit Etmek için Çift Boyama Yöntemi

4.7K görüntüleme

DOI:

10.3791/63432

4 Şubat 2022

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kahve-mantar etkileşiminde pektini tespit etmek için mikroskobik bir yöntemi açıklar.

Özet

Bitki hücreleri, kendilerini mantar enfeksiyonundan korumak için kurucu veya indüklenebilir farklı yapısal mekanizmalar kullanırlar. Enkapsülasyon, mantar haustoriasını bitki hücresi protoplastından izole etmek için etkili bir indüklenebilir mekanizmadır. Tersine, hücre duvarının polimerik bileşenlerinden biri olan pektin, nekrotrofik etkileşimlerde birkaç pektolitik enzimin hedefidir. Burada, optik mikroskopi yoluyla pektin ve mantar hiflerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Pas mantarı Hemileia vastatrix ile enfekte olmuş kahve yapraklarının hücrelerinde pektin bakımından zengin kapsüllenme ve Cercospora coffeicola tarafından indüklenen mezofil hücre duvarı modifikasyonu araştırılmıştır. Lezyonlu yaprak örnekleri Karnovsky çözeltisi ile sabitlendi, dehidre edildi ve 2-4 gün boyunca glikol metakrilat içine gömüldü. Tüm adımları, hücreler arası boşluklardaki havayı uzaklaştırmak ve gömme işlemini iyileştirmek için vakum pompalama izledi. Gömülü bloklar, suyla kaplı bir cam slayt üzerinde biriktirilen ve daha sonra 30 dakika boyunca 40 ° C'de ısıtılan 5-7 μm kalınlığında bölümlere ayrıldı. Daha sonra, slaytlar mantarı tespit etmek için laktofenolde% 5 pamuk mavisi ve pektini (pektinin poliüronik asitlerinin asidik grupları) tespit etmek için suda% 0.05 rutenyum kırmızısı ile çift boyandı. Hemileia vastatrix'in fungal haustoria'sının pektin tarafından kapsüllendiği bulundu. Kahve cercosporiosis'te mezofil hücrelerinde hücre duvarlarında çözünme görüldü ve hücreler arası hifa ve konidioforlar gözlendi. Burada sunulan yöntem, bitki-mantar etkileşiminde pektin ile ilişkili bir yanıtı tespit etmek için etkilidir.

Giriş

Bitkilerde hücre duvarı savunma mekanizmaları mantar enfeksiyonunu engellemek için çok önemlidir. Çalışmalar, 19.yüzyıldan bu yana hücre duvar kalınlığı ve bileşimindeki değişiklikleri bildirmiştir 1,2. Bu değişiklikler, mantarların hücreye girmesini önleyen bir papilla oluşumunu uyaran bir mantar patojeni tarafından indüklenebilir veya konakçı hücre protoplastını mantar haustoriasından izole etmek için hifleri kapsüllemek için kullanılabilir. Dinamik bir hücre duvarı bariyerinin (yani, papillalar ve tamamen kaplanmış bir haustorium) üretimi, bitki direncini arttırmak için önemlidir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Tamponlama çözeltisinin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. 100 mL damıtılmış suya 4.28 g sodyum kakodilat ekleyerek 2 M kakodilat tamponu hazırlayın ve pH'ı 0.2 N HCl ile 7.25'e ayarlayın.
  2. 10 mL% 25 sulu glutaraldehit, 10 mL% 10 sulu formaldehit, 25 mL 2 M kakodilat tamponu ve 0.5 mL 0.5 M CaCl 226'yı karıştırarak 100 mL Karnovsky fiksatif çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su ile hacmi 100 mL'ye kadar yapın.
    NOT: Çözelti buzdolabında 6 ay boyunca saklanabilir.
    DİKKAT: Kakodilat tamponlama çözeltisi toksiktir; bu nedenle, fiksatif çözeltiyi bir duman davlumbazında veya açık bir alanda tutun. Çöze....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

GMA gömülü bölümdeki pamuk mavisi laktofenol boyaması, hem biyotrofik hem de nekrotrofik mantar etkileşimlerinde kahve mezofil hücreleri arasında ve içinde çeşitli mantar yapılarının varlığını ortaya koymuştur.

Biyotrofik patosistemde, çift boyama yöntemi kullanılarak boyandığında, hücre duvarları içeren Hemileia vastatrix hifleri ve yoğun protoplast içeriği hem süngerimsi hem de palisade parankimde koyu mavi renkte görünür (Şekil 4A,B). .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, biyotrofik bir patosistemde haustoriayı kapsülleyen hücre duvarlarının pektin bileşimini araştırmak için alternatif bir çift boyama histokimyasal testi sunmaktadır. Amaç ayrıca, nekrotrofik mantarı ve bunun neden olduğu hücre duvarı değişikliklerini tespit etmek için yöntemin etkinliğini göstermektir. Burada, kahve parankimi hücre duvarlarının pektini, pas mantarı Hemileia vastatrix'in hem boynunu hem de haustoriumunu kapsayabilir. Silva ve ark. ayrıca kahve-H. vastatrix pathosystem 14,29'da.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmanın geliştirilmesine verdiği destek için Dr. Hudson W. P. de Carvalho'ya teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca ışık mikroskobu tesisini sağladığı için Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' ya minnettardır. Yazarlar, bitki materyaline lezyonlar sağladığı için Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício'ya teşekkür eder.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bıçaklar DB80 HSLeica14035838383Kesit
Kakodilat tamponuEMS# 11652Fiksasyon
Pamuk Mavisi LaktofenolMetaquí mika70SOLSIG024629Boyama
FormaldehitEMS# 15712Fiksasyon
GlutaraldehitEMS# 16216Fiksasyon
Historesin KitiTechnovit / EMS #14653
Sıcak plakaDubesserSSCD25X30-110VBoyama
MikroskobuZeiss# 490040-0030-000Görüntü yakalama
Mikrotom (Leica RM 2540)Leica149BIO000C1 14050238005Kesit
Plastik kalıplama kabı tepsisiEMS10176-30Boyama
Rutenyum kırmızıLABHouse#006004Boyama
Yazılımı Axion VisionZeiss# 410130-0909-000Görüntü yakalama
Vakum pompasıPrismatec131 TIPO 2 VCFiksasyon

Kaynaklar

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pektin TespitiOptik MikroskopiFungal HaustoryalarH cre Duvar ModifikasyonuRutenyum K rm z BoyamaPamuk Mavisi BoyamaKahve Yapra PatolojisiHistopatolojik al malar

İlgili makaleler