Bu protokol, kahve-mantar etkileşiminde pektini tespit etmek için mikroskobik bir yöntemi açıklar.
Yöntem makalesi
Bu protokol, kahve-mantar etkileşiminde pektini tespit etmek için mikroskobik bir yöntemi açıklar.
Bitki hücreleri, kendilerini mantar enfeksiyonundan korumak için kurucu veya indüklenebilir farklı yapısal mekanizmalar kullanırlar. Enkapsülasyon, mantar haustoriasını bitki hücresi protoplastından izole etmek için etkili bir indüklenebilir mekanizmadır. Tersine, hücre duvarının polimerik bileşenlerinden biri olan pektin, nekrotrofik etkileşimlerde birkaç pektolitik enzimin hedefidir. Burada, optik mikroskopi yoluyla pektin ve mantar hiflerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Pas mantarı Hemileia vastatrix ile enfekte olmuş kahve yapraklarının hücrelerinde pektin bakımından zengin kapsüllenme ve Cercospora coffeicola tarafından indüklenen mezofil hücre duvarı modifikasyonu araştırılmıştır. Lezyonlu yaprak örnekleri Karnovsky çözeltisi ile sabitlendi, dehidre edildi ve 2-4 gün boyunca glikol metakrilat içine gömüldü. Tüm adımları, hücreler arası boşluklardaki havayı uzaklaştırmak ve gömme işlemini iyileştirmek için vakum pompalama izledi. Gömülü bloklar, suyla kaplı bir cam slayt üzerinde biriktirilen ve daha sonra 30 dakika boyunca 40 ° C'de ısıtılan 5-7 μm kalınlığında bölümlere ayrıldı. Daha sonra, slaytlar mantarı tespit etmek için laktofenolde% 5 pamuk mavisi ve pektini (pektinin poliüronik asitlerinin asidik grupları) tespit etmek için suda% 0.05 rutenyum kırmızısı ile çift boyandı. Hemileia vastatrix'in fungal haustoria'sının pektin tarafından kapsüllendiği bulundu. Kahve cercosporiosis'te mezofil hücrelerinde hücre duvarlarında çözünme görüldü ve hücreler arası hifa ve konidioforlar gözlendi. Burada sunulan yöntem, bitki-mantar etkileşiminde pektin ile ilişkili bir yanıtı tespit etmek için etkilidir.
Bitkilerde hücre duvarı savunma mekanizmaları mantar enfeksiyonunu engellemek için çok önemlidir. Çalışmalar, 19.yüzyıldan bu yana hücre duvar kalınlığı ve bileşimindeki değişiklikleri bildirmiştir 1,2. Bu değişiklikler, mantarların hücreye girmesini önleyen bir papilla oluşumunu uyaran bir mantar patojeni tarafından indüklenebilir veya konakçı hücre protoplastını mantar haustoriasından izole etmek için hifleri kapsüllemek için kullanılabilir. Dinamik bir hücre duvarı bariyerinin (yani, papillalar ve tamamen kaplanmış bir haustorium) üretimi, bitki direncini arttırmak için önemlidir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Tamponlama çözeltisinin ve reaktiflerin hazırlanması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
GMA gömülü bölümdeki pamuk mavisi laktofenol boyaması, hem biyotrofik hem de nekrotrofik mantar etkileşimlerinde kahve mezofil hücreleri arasında ve içinde çeşitli mantar yapılarının varlığını ortaya koymuştur.
Biyotrofik patosistemde, çift boyama yöntemi kullanılarak boyandığında, hücre duvarları içeren Hemileia vastatrix hifleri ve yoğun protoplast içeriği hem süngerimsi hem de palisade parankimde koyu mavi renkte görünür (Şekil 4A,B). .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma, biyotrofik bir patosistemde haustoriayı kapsülleyen hücre duvarlarının pektin bileşimini araştırmak için alternatif bir çift boyama histokimyasal testi sunmaktadır. Amaç ayrıca, nekrotrofik mantarı ve bunun neden olduğu hücre duvarı değişikliklerini tespit etmek için yöntemin etkinliğini göstermektir. Burada, kahve parankimi hücre duvarlarının pektini, pas mantarı Hemileia vastatrix'in hem boynunu hem de haustoriumunu kapsayabilir. Silva ve ark. ayrıca kahve-H. vastatrix pathosystem 14,29'da.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Yazarlar, bu çalışmanın geliştirilmesine verdiği destek için Dr. Hudson W. P. de Carvalho'ya teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca ışık mikroskobu tesisini sağladığı için Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' ya minnettardır. Yazarlar, bitki materyaline lezyonlar sağladığı için Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício'ya teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bıçaklar DB80 HS | Leica | 14035838383 | Kesit |
| Kakodilat tamponu | EMS | # 11652 | Fiksasyon |
| Pamuk Mavisi Laktofenol | Metaquí mika | 70SOLSIG024629 | Boyama |
| Formaldehit | EMS | # 15712 | Fiksasyon |
| Glutaraldehit | EMS | # 16216 | Fiksasyon |
| Historesin Kiti | Technovit / EMS # | 14653 | |
| Sıcak plaka | Dubesser | SSCD25X30-110V | Boyama |
| Mikroskobu | Zeiss | # 490040-0030-000 | Görüntü yakalama |
| Mikrotom (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Kesit |
| Plastik kalıplama kabı tepsisi | EMS | 10176-30 | Boyama |
| Rutenyum kırmızı | LABHouse | #006004 | Boyama |
| Yazılımı Axion Vision | Zeiss | # 410130-0909-000 | Görüntü yakalama |
| Vakum pompası | Prismatec | 131 TIPO 2 VC | Fiksasyon |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste