Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63433

⸱

16 Mart 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Bu makalede

Özet

Çalışma, etiketleme alanlarının seçimi, boya seçimi, elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere FRET haritalama metodolojisini detaylandırmaktadır. Bu metodoloji, protein sistemlerinde bağlanma bölgelerini, konformasyonel değişiklikleri ve dinamik hareketleri belirlemede etkilidir ve mevcut 3-B yapısal bilgilerle birlikte gerçekleştirilirse en yararlı olanıdır.

Özet

Förster rezonans enerji transferi (FRET), in vitro ve hücrelerdeki biyomoleküller arasındaki mesafeleri başarılı bir şekilde ölçmek için kullanılan floresan tabanlı bir yöntemdir. FRET'te, floresan yoğunluğundaki veya ömründeki değişikliklerle ölçülen enerji transferinin verimliliği, iki floresan molekülü veya etiketi arasındaki mesafe ile ilgilidir. Dinamiklerin belirlenmesi ve mesafelerden gelen konformasyonel değişiklikler, bu yöntemin biyolojik sistemlere uygulanmasına sadece birkaç örnektir. Belirli koşullar altında, bu metodoloji dinamikler, esneklik ve bağlanma yüzeylerine adaptasyon hakkında bilgi sağlayarak mevcut X-ışını kristal yapılarına katkıda bulunabilir ve geliştirebilir. Bir bağlanma yerinin tanımlanması veya dimer alt birimlerinin oryantasyonları yoluyla yapısal özellikleri aydınlatmak için FRET ve ilişkili mesafe belirlemelerinin kullanımını açıklıyoruz. Etiketleme alanlarının akıllıca seçilmesi ve sıklıkla çoklu etiketleme stratejilerinin kullanılmasıyla, bir protein-DNA kompleksindeki ve SecA-SecYEG protein translokasyon sistemindeki küresel yapısal özellikleri belirlemek için bu haritalama yöntemlerini başarıyla uyguladık. SecA-SecYEG sisteminde, preprotein bağlanma bölgesini tanımlamak ve bağlı sinyal dizisi bölgesinin yerel konformasyonunu belirlemek için FRET haritalama yöntemlerini kullandık. Bu çalışma, uygun etiketleme alanlarının belirlenmesi, doğal olmayan amino asit kalıntıları dahil olmak üzere olası etiketlerin tartışılması, etiketleme prosedürleri, ölçümlerin nasıl yapılacağı ve verilerin yorumlanması dahil olmak üzere FRET haritalama çalışmalarının gerçekleştirilmesi için gereken adımları özetlemektedir.

Giriş

Proteinler için, 3 boyutlu (3-B) yapısal bilgi ile birlikte dinamiklerin aydınlatılması, biyomoleküler sistemlerin yapı-işlev ilişkilerinin daha iyi anlaşılmasına yol açar. X-ışını kristalografisi ve kriyojenik elektron mikroskobu gibi yapısal yöntemler, statik bir yapı yakalar ve genellikle biyomolekül bağlanmasının ve dinamiğinin yönlerini aydınlatmak için çoklu yapıların belirlenmesini gerektirir1. Bu makalede, bağlama siteleri veya bağlama etkileşimleri gibi genel yapısal öğeleri eşlemek için potansiyel olarak daha geçici ve statik yöntemlerle daha az kolay yakalanan çözüm tabanlı bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji için güçlü aday sistemler, 3 boyutlu bir yapının daha önce X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopisi veya diğer yapısal yöntemlerle belirlendiği sistemlerdir. Bu durumda, protein genel sekretuar yolunda merkezi bir oyuncu olan SecA-SecYEG kompleksinin X-ışını kristal yapısından yararlanarak, preproteinin membran2 boyunca taşınmasından önce Förster rezonans enerji transferini (FRET) kullanarak bir sinyal peptid bağlanma bölgesinin yerini haritalandırıyoruz. Biyolojik sistemin genetik modifikasyonlar yoluyla manipülasyonu, 3-D yapısı hakkındaki bilgimizle birleştiğinde, kanal 3'e yerleştirilmeden hemen önce sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunun belirlenmesini sağladı.

FRET, enerjinin bir molekülden (donör) diğerine (alıcı) radyasyonsuz transferini, mesafeye bağlı bir şekilde,uzay 4,5 boyunca içerir. Bu transferin etkinliği, donördeki bir azalma veya alıcı floresan yoğunluğundaki bir artış ile izlenir. Enerji transferinin verimliliği şu şekilde tanımlanabilir:

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

R0 değerinin, aktarımın% 50 verimli olduğu mesafe6. Bu teknik daha önce moleküler bir cetvel olarak tanımlanmıştır ve donör-alıcıboyaların 4,7,8,9 kimliğine bağlı olarak 2.5-12 nm aralığındaki mesafelerin belirlenmesinde etkilidir. Donör floresan yoğunlukları ve alıcılı veya alıcısız ömürleri, transfer verimliliklerinin ve dolayısıylamesafelerin 5,8 olarak belirlenmesine izin verir. Teknolojinin mevcudiyeti, yöntemin hassasiyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle, FRET ayrıca tek moleküllü floresan spektroskopisi ve konfokal mikroskopi6 gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Yeşil floresan proteini gibi floresan proteinlerin ortaya çıkışı, hücre içi dinamiklerin ve canlı hücre görüntülemenin gözlemlenmesini nispeten kolay hale getirmiştir10,11. Bunlar gibi birçok FRET uygulaması bu sanal sayıda ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Bu çalışmada, yapısal detayları belirlemek için mesafe değerlerini elde etmek için FRET ölçümlerinin kullanımına özellikle odaklanıyoruz. Daha önce, FRET ölçümleri, protein 12,13,14'e, proteinlerin iç dinamiklerine ve protein bağlanma etkileşimlerine15,16,17 bağlandığında DNA moleküllerinin konformasyonunu belirlemek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Bu yöntemin avantajları, nispeten düşük miktarda malzemeye sahip bir çözeltide esnek ve dinamik yapısal elemanları belirleme yeteneğinde yatmaktadır. Önemli bir şekilde, bu yöntem mevcut yapısal bilgilerle birlikte kullanıldığında özellikle etkilidir ve 3 boyutlu yapı belirleme aracı olarak kullanılamaz. Yöntem, çalışmanın genellikle hesaplamalı simülasyon18,19 ile birleştirilen mevcut yapısal bilgilere dayanması durumunda yapının en iyi içgörüsünü ve iyileştirilmesini sağlar. Burada, kararlı durum ve zaman çözümlü FRET ölçümlerinden elde edilen mesafelerin kullanımı, genel sekretuar yolu3'teki ana proteinler olan SecA-SecYEG kompleksinin mevcut bir kristalografik yapısı üzerinde, yeri bilinmeyen bir bağlanma bölgesini haritalamak için tanımlanmıştır.

Prokaryotlardan ökaryotlara ve arkelere kadar oldukça korunmuş bir sistem olan genel salgı yolu, proteinlerin hücre içindeki fonksiyonel konumlarına membran boyunca veya içine taşınmasına aracılık eder. Çalışmamızda kullanılan organizma olan E. coli gibi Gram-negatif bakteriler için, proteinler iç zar boyunca periplazmaya yerleştirilir veya yer değiştirir. Bakteriyel SecY kanal kompleksi (translokon olarak adlandırılır), tipik olarak N-terminus20,21'de bulunan bir sinyal dizisi aracılığıyla hücredeki doğru konumuna yönlendirilen yeni sentezlenmiş proteini translokasyona yerleştirmek için diğer proteinlerle koordine olur. Periplazmaya bağlı proteinler için, ATPaz SecA proteini, ribozomun çıkış tüneli ile ve yaklaşık 100 kalıntı çevrildikten sonra preprotein ile ilişkilidir22. SecB şaperon proteini ile birlikte, preproteini açılmamış bir durumda tutar. SecA, SecYEG translokonuna bağlanır ve birçok ATP hidrolizi döngüsü boyunca, membran23,24 boyunca protein taşınmasını kolaylaştırır.

SecA, sitozolik ve membrana bağlı formlarda bulunan çok alanlı bir proteindir. Sitosoldeki homodimerik bir protein olan SecA, bir preprotein bağlanma veya çapraz bağlanma alanı25, iki nükleotid bağlayıcı alan, bir sarmal kanat alanı, bir sarmal iskele alanı ve iki sarmal parmak (THF) 26,27,28,29'dan oluşur (Şekil 1). SecA-SecYEG kompleksinin önceki kristalografik çalışmalarında, THF'nin yeri, protein translokasyonunda aktif olarak yer aldığını ve daha sonra sinyal peptidi ile çapraz bağlanma deneylerinin bu bölgenin protein translokasyonundaki önemini daha da ortaya koyduğunu ileri sürdü30,31. FRET haritalama metodolojisini kullanan önceki çalışmalar, eksojen sinyal peptitlerinin SecA 2,32'nin bu bölgesine bağlandığını göstermiştir. SecYEG kanalına yerleştirilmeden önce sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin konformasyonunu ve yerini tam olarak anlamak için, erken olgun bölgenin sinyal dizisinin ve kalıntılarının bir Ser-Gly bağlayıcı aracılığıyla SecA'ya bağlandığı bir protein kimera oluşturuldu (Şekil 1). Bu biyolojik olarak uygulanabilir yapı kullanılarak, preproteinin sinyal dizisinin ve erken olgun bölgesinin THF'ye paralel bir şekilde bağlandığıgösterilmiştir 2. Daha sonra, FRET haritalama metodolojisi, aşağıda açıklandığı gibi SecYEG'nin varlığında sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunu ve yerini aydınlatmak için kullanılmıştır.

SecA-SecYEG kompleksi33,34,35'in 3-D yapısı ve bağlanma yerinin olası konumu hakkında bilgi, bireysel FRET mesafelerinin kesişiminin bağlanma yeri yerini tanımladığı yerlere bağışçı-alıcı etiketlerini makul bir şekilde yerleştirmemize izin verdi. Bu FRET haritalama ölçümleri, sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin, ucu SecYEG kanalının ağzında bulunan bir saç tokası oluşturduğunu ve saç tokası yapısının kanal yerleştirmeden önce şablonlandığını gösterdiğini ortaya koymuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Etiketleme alanlarının seçimi

  1. Mevcut protein yapıları üzerindeki varsayılan bağlanma bölgesini üçgenleştirmek için en az üç potansiyel etiketleme bölgesi tanımlayın. Bu durumda, genetik füzyon yoluyla SecA'ya bağlı SecA, SecYEG ve preprotein tanımlandı2.
    1. Varsayılan bağlanma bölgesinin 25-75 şiçindeki etiketleme bölgelerini seçin ve proteinin nispeten statik bölgelerinde, mesafe kullanılacak spesifik FRET boya çiftini belirleyecektir36. Etiketleme bölgelerini birbirinden nispeten farklı protein bölgelerinde bulun, böylece siteler bir üçgenin köşelerini, merkezde bulunan varsayılan bağlanma bölgesi ile tanımlar (Şekil 1A-D).
    2. Belirli bir bölgenin etiketleme verimliliğini artırmak için başka Cys kalıntısı olmayan bir proteindeki ilgili etiketleme bölgelerinde sistein (Cys) kalıntılarını tanıtmak veya tanımlamak37,38.
    3. Bir proteini farklı boyalarla iki farklı konumda etkili bir şekilde etiketlemek için tıklama kimyası ile etiketlemek için p-azidofenilalanin gibi doğal olmayan amino asitleri tanıtın39,40.
    4. Cys mutantlarını fonksiyon kaybı açısından test edin. Uygun bir aktivite testi kullanarak Cys-less mutantının ve doğal olmayan amino asit mutantının aktivitesini doğrulayın. Bu durumda, aktivite bir büyüme testi ve ardından in vitro malakit yeşil ATPaz testi 32,41,42 ile doğrulanmıştır.

2. Proteinin etiketlenmesi

  1. Doğru etiketleme için ilgili protein veya proteinleri en az% 95 saflığa kadar saflaştırın. SecA ve SecYEG proteinlerini referans3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolleri izleyerek saflaştırın. Bu adım için en az 5 μg saflaştırılmış proteine sahip olduğunuzdan emin olun, çünkü etiketleme işlemi sırasında bir miktar protein kaybolacaktır.
  2. FRET ölçümleri için R0 değerlerine ve etiketli bölgeler arasındaki tahmini mesafelere bağlı olarak iki boya seçin. R0 değerlerini tahmin edin ve yaygın olarak kullanılan boyalar için spektrum veren floresan protein veritabanındaki bilgileri kullanarak donör emisyonu ve alıcı absorbansının örtüştüğünü gözlemleyin (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    NOT: R 0, belirli bir boyaçifti için transfer verimliliğinin P olduğu mesafe olarak tanımlanır. Haritalama deneyleri için, mesafelerin doğru bir şekilde ölçülebilmesini sağlamak için tahmin edilen mesafeler boya çiftinin R0 değerine yakın olmalıdır.
  3. Adım 1.1.1'de tanımlanan konumları etiketleyin. donör-alıcı boya çifti ile.
    1. Proteini, üreticinin talimatlarına göre, optimal protein konsantrasyonu, sıcaklık, pH, süre uzunluğu ve kullanılan spesifik boyalar için tampon gibi parametrelere özellikle dikkat ederek etiketleyin43,44.
    2. Proteini 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) tamponunda 1-2 mg / mL konsantrasyonda veya yaklaşık 10 μM konsantrasyonda hazırlayın. Boyayı dimetilformamid (DMF) veya dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona çözün. Bir boyaya ulaşmak için karıştırırken boyayı çözeltiye damla damla ekleyin: 5: 1 protein molar oranı (50 μM boya: 10 μM protein).
    3. Reaksiyonun oda sıcaklığında (RT) bir cam şişede hafifçe sallanan veya 4 ° C'de gece boyunca 4 saat ilerlemesine izin verin. β-merkaptoetanol ekleyerek reaksiyonu durdurun.
      NOT: Protein Tris tamponu ile uyumlu değilse, fosfat veya HEPES tamponları kullanılabilir. PH'ı 7.0-7.5 aralığında tutun. Proteinin disülfür bağları varsa, etiketlemeden önce DTT veya TCEP gibi bir indirgeyici ajan ekleyin. DTT'yi boya eklemeden önce diyaliz veya jel filtrasyonu ile çıkarın.
  4. Doğru FRET ölçümleri için, etiketli proteini korurken serbest boyanın akmasına izin vermek için serbest boyayı uygun bir moleküler ağırlık kesimine (MWCO) sahip bir santrifüjlü yoğunlaştırıcı ile çıkarın.
    1. Konsantratör membranını, 3 mL'lik bir konsantratörün üst kısmına ~ 1 mL su yerleştirerek hazırlayın ve ardından suyu membrandan santrifüj edin (4.300 x g'de en az 10 dakika).
    2. Etiketli numuneyi yoğunlaştırıcıda santrifüj yaparak serbest boyayı çıkarın (4.300 x g'de 20 dakika). 3-4 kez tekrarlayın ve akışı atın.
    3. UV-Vis absorpsiyon spektroskopisi kullanarak etiketli proteinin etiketleme verimliliğini kontrol edin.
      NOT: FRET ölçümleri, P veya daha yüksek etiketleme verimlilikleri gerektirir. Düşük etiketleme verimlilikleri FRET sinyalini azaltır ve ölçümlerde yanlışlıklara neden olabilir.
    4. Hem protein absorpsiyon bandını hem de boya maksimum absorpsiyon bandını gözlemlemek için etiketli proteinin 250-700 nm aralığında bir UV-Vis spektrumunu elde edin. Absorbansı boyanın emilim zirvesinde ve protein için 280 nm'de ölçün.
    5. Protein konsantrasyonunu belirleyin ve düzeltme faktörü, CF ve aşağıdaki denklemler45,46'yı kullanarak boyadan gelen herhangi bir katkı için doğru yapın:
      figure-protocol-1
      burada C, proteinin (M) konsantrasyonudur, A 280,280 nm'deki numune absorbansıdır, A max, boya absorpsiyon maksimumundaki absorbanstır, ε protein, 280 nm'de protein için yok olma katsayısıdır ve CF, düzeltme faktörüdür, A'280 / A'max, burada A'280, 280 nm'de absorbanstır ve A'max sadece boya için maksimum zirvedeki absorbanstır.
    6. Aşağıdaki denklemi kullanarak etiketleme verimliliğini belirleyin:
      figure-protocol-2
      burada εboya, boyanın molar yok olma katsayısıdır, C, adım 2.4.5'te belirlenen proteinin konsantrasyonudur ve E, etiketleme verimliliğidir. Etiketleme verimliliği değeri platolaşana ve 0'den az olana kadar adım 2.4.2'yi tekrarlayın.

3. R 0 değerlerini belirleyin

  1. R0 değerlerini in situ olarak ölçün. Aynı toplam protein konsantrasyonunda, 4 μM'de, biri sadece donör boya ile etiketlenmiş protein ve diğeri sadece alıcı boya ile etiketlenmiş protein ile iki protein örneği hazırlayın. SecA için, 4 μM SecA monomerlik bir protein konsantrasyonu bu ölçümler için iyi çalışır.
    1. 1 cm x 1 cm küvet için 2,5 mL, 5 mm x 5 mm küvet için 600 μL veya 3 mm x 3 mm küvet için 200 μL numune hacimleri hazırlayın.
  2. Florometreyi açın ve spektroflorometre kullanıyorsanız floresan yazılımında spektral toplama ve analiz programını açın. Bilgisayarı cihaza bağlamak için kırmızı M'ye tıklayın (Şekil 2A) ve Emisyon Spektrumları'nı seçin.
    1. Uyarma dalga boyu, emisyon taraması aralığı, sıcaklık ve numune değiştirici konumu gibi tarama parametrelerini Toplama Deneyi menü öğesini kullanarak girin (Şekil 2B).
    2. RTC'ye tıklayın ve boyanın emme maksimumunda ayarlanmış bir uyarma dalga boyu kullanarak floresan emisyonunu zirvede izleyerek cihaz ayarlarını (örneğin, spektral yarıklar) optimize edin. SecA için aşağıdaki ayarları yapın: bandpass 1 nm olarak; uyarma ve emisyon yarıkları sırasıyla 1 ve 1,5 mm olarak, sıcaklık 25 ° C'de ve karıştırma hızı 250 rpm'de olmak üzere.
      NOT: Cihazın saniye başına sayım (cps) kapasitesini aşmayın (tipik olarak 2 x 106 cps).
  3. Donör etiketli protein örneğini numune tutucuya yerleştirin ve numuneyi boya emme maksimumunda (örneğin, AF488 için 488 nm) heyecanlandırarak ve emisyon zirvesini (AF488 ile etiketlenmiş sadece donör SecA proteini için 505-750 nm) tarayarak yalnızca donör boyası (yalnızca donör proteini) ile etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını oluşturmak için Çalıştır'ı tıklayın.
  4. Taramayı zirvenin sonundan 25-50 nm uzağa uzatarak tarama için bir taban çizgisi oluşturun. Tarif edildiği gibi farklı konsantrasyonlardaki numuneler üzerinde absorpsiyon ve floresan ölçümleri yaparak sadece donör proteinin kuantum verimini ölçün47. Bu ölçümler için aynı yarık ayarlarını yapın.
    1. Kuantum verimi için referans olarak serbest donör boyası kullanın. Doğru bir belirleme için sadece donör proteininin ve serbest boyanın en az dört ölçümünü farklı konsantrasyonlarda elde edin.
    2. Floresan yoğunluğunu veya entegre alanı, yalnızca donör proteini ve serbest boya veya referans için absorbansa karşı çizin. Sadece donör proteini (EğimD) ve referans (Eğim R) için eğimleri belirleyin.
    3. Kuantum verimi (Φ) aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
      figure-protocol-3
      burada Φ D, donör sadece proteinin kuantum verimidir, Φ R, serbest boyanın kuantum verimidir (bu genellikle üreticiden elde edilebilir), Eğim D ve Eğim R, sırasıyla donör sadece protein ve referans için adım 3.4.2'de belirlenen eğimlerdir ve η D ve ηR sadece donör proteininin kırılma indeksini ve referanssız boya çözeltilerini temsil eder, sırasıyla 47.
  5. 1 cm'lik bir yol boyu hücre kullanarak yalnızca alıcı proteininizin absorpsiyon spektrumunu elde edin. Emilim spektrumunu boya konsantrasyonuna bölerek yalnızca alıcı proteininizin yok olma katsayısı spektrumunu oluşturun.
  6. Bir grafik analiz programı kullanarak spektral örtüşme integrali, J (λ) oluşturun. Bu işlem için standart bir çalışma sayfası programı (örneğin, elektronik tablo) da kullanılabilir.
    1. Sadece donör proteininin floresan emisyon spektrumunu (adım 3.4), örtüşme spektrumunu oluşturmak için yalnızca alıcı proteinin yok olma katsayısı spektrumu ile çarpın.
    2. Elde edilen örtüşme spektrumunu λ4 ile çarpın.
    3. Örtüşen bölgenin tümleştirilmesiyle eğrinin altındaki alanı belirleyin. Örtüşme bölgesi, alıcı yok olma katsayısı spektrumu ile çarpılan donör emisyon spektrumunun pozitif değerler verdiği alan olarak tanımlanır. Spektral örtüşme integrali şu şekilde tanımlanır:
      figure-protocol-4
      burada FD (λ), yalnızca donör proteininin emisyon spektrumudur (adım 3.4'te elde edilir) ve εA (λ), yalnızca alıcı proteinin yok olma katsayısı spektrumudur ve M-1 cm-1birimlerine sahiptir (adım 3.5'te elde edilmiştir). Elde edilen spektral örtüşme integrali M-1 cm-1nm 4 birimlerine sahip olmalıdır.
    4. Spektral örtüşme integralini normalleştirin. Örtüşme integralini, donörün entegre alanına bölün, aynı spektral aralıktaki sadece protein spektrumu:
      figure-protocol-5
    5. Aşağıdaki denklemi kullanarakÅ'daki R 0 değerini hesaplayın:
      figure-protocol-6
      burada κ 2, serbestçe dönen boyalar için tipik olarak 2/3 olarak alınan oryantasyon faktörüdür, η kırılma indeksidir ve seyreltik sulu çözeltiler için 1.33 olarak yaklaştırılabilir, QD, donörün kuantum verimidir (adım 3.4) ve J (λ), adım 3.6.35'te belirlenen spektral örtüşme integralidir. NOT: Boyalar serbestçe dönmüyorsa, düzeltmeler Ivanov 48 tarafından tanımlandığı ve Auclair49 ve Zhang 2,3 tarafından uygulandığı şekilde getirilebilir.

4. FRET spektral ölçümleri yapın

  1. Sadece donör proteini, sadece alıcı protein ve donör-alıcı protein örneklerini aynı konsantrasyonda hazırlayın; 4 μM'lik bir konsantrasyon önerilir. 3 mm x 3 mm küvet kullanıyorsanız 200 μL, 5 mm x 5 mm küvet kullanıyorsanız 600 μL veya 1 cm x 1 cm küvet kullanıyorsanız 2,5 mL çözelti kullanın.
    1. Donör-alıcı protein örneğini, sadece donör ve sadece alıcı proteinin eşit miktarda molar kullanarak hazırlayın.
    2. Etiketsiz proteinin sadece donör veya sadece alıcı numunelere eşit miktarda molar miktarda sokulması yoluyla sadece kontrol donöründe ve sadece alıcı protein numunelerinde aynı miktarda etiketli numuneyi koruyun. Örneğin, aynı konsantrasyondaki çözeltiler için, her bir donör FRET örneği, 200 μL'lik bir hacim için 100 μL sadece donör proteini ve 100 μL etiketsiz protein içerecektir.
  2. Yalnızca donör, yalnızca alıcı ve donör-alıcı numunelerinin floresan emisyon spektrumlarını oluşturun. Sinyali adım 3.2'de açıklandığı gibi optimize edin. Optimize edildikten sonra tüm numuneler için aynı ayarları yapın.
    1. Adım 3.3'te açıklandığı gibi yalnızca donör taramasını edinin. Çözeltiyi donör boya emiliminde maksimumda uyarın ve donör ve (beklenen) alıcı emisyon zirvelerini tarayın.
    2. Numuneyi yalnızca alıcı proteinle değiştirin veya numune değiştirici pozisyonunu yalnızca alıcı proteini içeren küvete değiştirin.
    3. Adım 4.2.1'deki ayarlarla aynı ayarları kullanarak yalnızca alıcı boya (yalnızca alıcı protein) ile etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını alın. Numuneyi donör uyarma dalga boyunda uyarın.
      NOT: Bu spektrum, donör dalga boyunda uyarılan alıcı miktarı için bir düzeltme sağlar (adım 5.1.2'de FA )
    4. Numuneyi donör-alıcı protein numunesine değiştirin veya numune değiştirici pozisyonunu donör-alıcı etiketli proteini içeren küvete değiştirin.
    5. Adım 4.2.1 ve 4.2.3'teki ayarlarla aynı ayarları kullanarak donör-alıcı protein numunesinin emisyon taramasını elde edin.
    6. Tüm spektrumlar için, taramanın sonunda ölçülen arka plan sayımlarını çıkararak arka plan floresansı için düzeltin.
  3. Sadece donörün donör ömürlerini ve adım 4.1.2'de açıklandığı gibi hazırlanan donör-alıcı örneklerini ölçün. Nanosaniye (10-9 s) zaman aralığındaki floresan bozunumlarını ölçebilen ve çözebilen, zamanla ilişkili tek foton sayma floresan cihazı kullanın.
    NOT: FRET boya çiftleri için, uyarma ışık kaynağını donör boyanın emilim maksimumuyla eşleştirin.
    1. Cihazı açın. Edinme yazılımını açın, floresan spektrometresi ile veri toplama için cihaz kontrol yazılımını kullanın.
    2. Satın alma için, 55 ns'lik bir zaman aralığına, 1 ve 4096 kanallık bir kazanca sahip TCSPC Decay'i seçin.
    3. Süt ürünü olmayan krema çözeltisi veya ticari saçılma çözeltisi kullanarak bir cihaz tepki fonksiyonu (IRF) elde edin ve 490 nm'de saçılımı izleyin. Yarık ayarını yapın ve darbe yığılmasını önlemek için yeterince düşük bir sayım oranını korumak için gerektiğinde nötr yoğunluk filtreleri kullanın5. Kabul Et'i ve ardından Başlat'ı tıklatın. Bu, satın almayı başlatacaktır.
      NOT: 180 kHz tekrarlama hızı için maksimum 4000 cps sayım hızı kullanılır.
    4. IRF'yi 490 nm'de toplayın, ta ki tepe kanalı maksimum 20.000 sayıma sahip olana kadar. Her floresan bozunumunu ölçmeden önce ve sonra bir IRF toplayın.
    5. Sadece donörün floresan bozunumlarını ve donör-alıcı numunelerini, donör emisyon dalga boyundaki floresan emisyonunu (520 nm) izleyerek elde edin.
    6. Maksimum 4000 cps veya daha az sayım hızı için yarık ayarlarını yapın. Yarık ayarları, protein örnekleri için tipik olarak 15-20 nm bandpass'tır. Tepe kanalında 20.000 sayım elde edilene kadar çürümeyi toplayın.
  4. Floresan ömrü (τ) için zamanın (t) bir fonksiyonu olarak çürümeyi veya floresan yoğunluğunu (I) analiz edin. Bozunumu, aşağıdaki denklemle üstellerin toplamına sığdırın:
    figure-protocol-7
    burada α I, i. bileşenin preüstel faktörüdür ve τ I, yaşamdır. Uyum, floresan bozunumuna uyacak şekilde IRF ile yeniden birleştirilir. Uyumun kalitesini azaltılmış Χ 2 parametrelerindendeğerlendirin.

5. FRET verilerinin analizi

  1. FRET verimliliğini, donör-alıcı numunenin donöre göre donör yoğunluğundaki azalmadan sadece aşağıdaki denklemle hesaplayın.
    figure-protocol-8
    burada FDA , donör-alıcı numunenin floresan yoğunluğudur ve FD , donör floresansının zirvesindeki sadece donör numunenin floresan yoğunluğudur. Veriler gürültülüyse tepe noktalarının tümleşik alanlarını kullanın.
    1. Yalnızca donör ve donör-alıcı numuneler arasındaki etiketlemedeki farklılıklar için doğrudur. Aşağıdaki gibi etiketlemenin donör derecesine göre düzeltmeleri hesaplayın.
      figure-protocol-9
      burada f DA, donör-alıcı numunedeki donör etiketleme verimliliğidir ve fD, yalnızca donör numunesindeki etiketleme verimliliğidir.
    2. Alıcı floresanın, sadece alıcı protein spektrumunun (adım 4.2) donör-alıcı protein spektrumundan çıkarılması yoluyla donör uyarılmış spektruma herhangi bir katkısı için doğrudur.
      figure-protocol-10
    3. Donör-alıcı protein örneğine göre alıcı sadece proteinin etiketleme verimliliğindeki farklılıklar için doğru, verimliliği hesaplamak için aşağıdaki denklemi verir:
      figure-protocol-11
      burada fA , alıcı etiketlemenin kesirli miktarını gösterir. Bu denklem, boya etiketleme ve alıcı floresansı nedeniyle yapılan tüm düzeltmeleri içerir.
    4. Aşağıdaki denklemi kullanarak verimliliklerden FRET mesafelerini hesaplayın:
      figure-protocol-12
      adım 3.6.5'te elde edilen R0 değerini kullanarak.
    5. Yalnızca donörün floresan ömürlerini ve adım 4.3.3-4.3.5'te ölçülen donör-alıcı numuneleri kullanarak FRET verimliliğini hesaplayın:
      figure-protocol-13
    6. FRET verimliliklerini hesaplamak ve kararlı durum sonuçları5 ile karşılaştırmak için genlik ağırlıklı yaşam süresini kullanın.
      figure-protocol-14
    7. Adım 5.1.4'te olduğu gibi floresan ömrü ile belirlenen verimliliklerden uzaklığı hesaplayın. FRET verimlilikleri ve mesafeleri için kararlı durum ve zaman çözümlenmiş değerleri karşılaştırın ve birbirlerinin hatası içinde olduklarından emin olun.

6. Mesafelerin haritalandırılması

  1. Üç boyutlu yapıdaki bağlama bölgesini eşlemek için hesaplanan mesafeleri kullanın. Her FRET çifti için adım 3.6.5'te elde edilen adım 5.1.4 ve R0 değerlerinde verilen denklemi kullanarak incelenen tüm boya çiftleri ve konumları için mesafeleri ve hataları hesaplayın.
    1. Mesafeleri yapıya eşlemek için PyMOL50 gibi bir 3-B grafik görüntüleme programı kullanın ( Ek Dosyada verilen komut dosyası). Komut dosyasından gelen komutlar, uygun mesafe bilgileriyle doğrudan komut penceresine girilebilir.
    2. Ölçülen her mesafe ve ilişkili hata için bir kabuk oluşturun (Şekil 3, Şekil 4, Ek Şekil 1-3).
    3. Farklı kabukların kesişimi boyunca konumu haritalayın (Ek Şekil 1-3). Sinyal peptidi bağlanma bölgesi, SecA ve SecYEG'deki üç farklı konum ve sinyal peptidi üzerindeki dört farklı konum üzerinden haritalandı (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışma, preproteinin SecYEG kanalına yerleştirilmesinden önce preprotein bağlanma bölgesinin SecA üzerindeki yerini belirlemeye odaklanmıştır. Bağlanma bölgesini haritalamak için, preproteinin farklı bölgeleri ile SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki üç farklı konum arasında FRET deneyleri yapıldı (Şekil 1A-D). Elde edilen mesafelerden ve SecA, SecYEG ve preproteinin üç boyutlu yapılarından, preprotein bağlanma bölgesinin yeri tahmin edildi. Bu ölçümler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

FRET haritalama metodolojisini kullanarak, SecA proteini üzerindeki sinyal dizisi bağlanma bölgesini belirledik. Daha da önemlisi, kompleksin 3 boyutlu kristal yapısının varlığı, çalışmamızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Bu haritalama metodolojisinin gücü, etiketleme için konumları tanımlamak için mevcut bir yapıyı kullanma yeteneğinde yatmaktadır. Bu metodoloji 3B bir yapıyı belirlemek için kullanılamaz; Bununla birlikte, yapısal elemanların belirlenmesi56, mevcut bir yapının iyileştirilmesi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R15GM135904 (IM'ye verildi) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe GM110552 (DBO'ya verildi) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
490 nm LED lazerHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimid // DIBO AlkinYaşam TeknolojileriA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimid / DIBO AlkinYaşam TeknolojileriA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkinYaşam TeknolojileriS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkinYaşam TeknolojileriS10906
Amicon Ultra ­ 4 Santrifüj filtre (50kDa MWCO)SigmaUFC805008
Dodesilmaltosit (DDM)AnatraceD310
E. coli< / em> alkalin fosfataz sinyal peptidi SP22Biyomoleküller MidwestN/ASentezlenmiş özel öğe
genişletilmiş sinyal peptit SP41Biyomoleküller MidwestN/ASentezlenmiş özel ürün
FluorEssenceFluoromax4 spektroflorometre içinHoribasürüm 2.4
Fluoromax 4 spektroflorometreHoribaN/A
GlobalsWEFloresan Dinamiği Laboratuvarı, California Üniversitesi, IrvineZamanla çözülen bozunmalar için spektral analiz programı
H­ 4&utangaç; Azido&utangaç; Phe­ OHBACHEM4020250.0001
LB (Değirmenci) Et SuyuFisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 kolloidal silika (H2O'da ağırlıkça %40 süspansiyon)bir saçılma çözeltisi yapmak içinSigma-Aldrich420816
PTI Felix GXHoribasürüm 4.1.0.4096PTI Time Master Instrument için spektral edinim programı
EnstrümanHoribaNA
Pymol Moleküler Grafik ProgramıSchrödingersürüm 2.4
Su banyosuThermo ScientificNESLAB RTE 10
spektral edinim programıUygun seyreltme gereklidir

Kaynaklar

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

FRET HaritalamaProtein Yap sal AnaliziLigand Ba lanma B lgesiProtein EtiketlemeFloresans SpektroskopisiDon r Aksept r iftiKuantum Verimi l mProtein DNA KompleksiSecA SecYEG Sistemi
Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.