Çalışma, etiketleme alanlarının seçimi, boya seçimi, elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere FRET haritalama metodolojisini detaylandırmaktadır. Bu metodoloji, protein sistemlerinde bağlanma bölgelerini, konformasyonel değişiklikleri ve dinamik hareketleri belirlemede etkilidir ve mevcut 3-B yapısal bilgilerle birlikte gerçekleştirilirse en yararlı olanıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji
Bu makalede
Özet
Özet
Förster rezonans enerji transferi (FRET), in vitro ve hücrelerdeki biyomoleküller arasındaki mesafeleri başarılı bir şekilde ölçmek için kullanılan floresan tabanlı bir yöntemdir. FRET'te, floresan yoğunluğundaki veya ömründeki değişikliklerle ölçülen enerji transferinin verimliliği, iki floresan molekülü veya etiketi arasındaki mesafe ile ilgilidir. Dinamiklerin belirlenmesi ve mesafelerden gelen konformasyonel değişiklikler, bu yöntemin biyolojik sistemlere uygulanmasına sadece birkaç örnektir. Belirli koşullar altında, bu metodoloji dinamikler, esneklik ve bağlanma yüzeylerine adaptasyon hakkında bilgi sağlayarak mevcut X-ışını kristal yapılarına katkıda bulunabilir ve geliştirebilir. Bir bağlanma yerinin tanımlanması veya dimer alt birimlerinin oryantasyonları yoluyla yapısal özellikleri aydınlatmak için FRET ve ilişkili mesafe belirlemelerinin kullanımını açıklıyoruz. Etiketleme alanlarının akıllıca seçilmesi ve sıklıkla çoklu etiketleme stratejilerinin kullanılmasıyla, bir protein-DNA kompleksindeki ve SecA-SecYEG protein translokasyon sistemindeki küresel yapısal özellikleri belirlemek için bu haritalama yöntemlerini başarıyla uyguladık. SecA-SecYEG sisteminde, preprotein bağlanma bölgesini tanımlamak ve bağlı sinyal dizisi bölgesinin yerel konformasyonunu belirlemek için FRET haritalama yöntemlerini kullandık. Bu çalışma, uygun etiketleme alanlarının belirlenmesi, doğal olmayan amino asit kalıntıları dahil olmak üzere olası etiketlerin tartışılması, etiketleme prosedürleri, ölçümlerin nasıl yapılacağı ve verilerin yorumlanması dahil olmak üzere FRET haritalama çalışmalarının gerçekleştirilmesi için gereken adımları özetlemektedir.
Giriş
Proteinler için, 3 boyutlu (3-B) yapısal bilgi ile birlikte dinamiklerin aydınlatılması, biyomoleküler sistemlerin yapı-işlev ilişkilerinin daha iyi anlaşılmasına yol açar. X-ışını kristalografisi ve kriyojenik elektron mikroskobu gibi yapısal yöntemler, statik bir yapı yakalar ve genellikle biyomolekül bağlanmasının ve dinamiğinin yönlerini aydınlatmak için çoklu yapıların belirlenmesini gerektirir1. Bu makalede, bağlama siteleri veya bağlama etkileşimleri gibi genel yapısal öğeleri eşlemek için potansiyel olarak daha geçici ve statik yöntemlerle daha az kolay yakalanan çözüm tabanlı bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji için güçlü aday si....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Etiketleme alanlarının seçimi
- Mevcut protein yapıları üzerindeki varsayılan bağlanma bölgesini üçgenleştirmek için en az üç potansiyel etiketleme bölgesi tanımlayın. Bu durumda, genetik füzyon yoluyla SecA'ya bağlı SecA, SecYEG ve preprotein tanımlandı2.
- Varsayılan bağlanma bölgesinin 25-75 şiçindeki etiketleme bölgelerini seçin ve proteinin nispeten statik bölgelerinde, mesafe kullanılacak spesifik FRET boya çiftini belirleyecektir36. Etiketleme bölgelerini birbirinden nispeten farklı protein bölgelerinde bulun, böylece siteler bir üçgenin köşelerini, merkezde bulunan varsayılan bağ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışma, preproteinin SecYEG kanalına yerleştirilmesinden önce preprotein bağlanma bölgesinin SecA üzerindeki yerini belirlemeye odaklanmıştır. Bağlanma bölgesini haritalamak için, preproteinin farklı bölgeleri ile SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki üç farklı konum arasında FRET deneyleri yapıldı (Şekil 1A-D). Elde edilen mesafelerden ve SecA, SecYEG ve preproteinin üç boyutlu yapılarından, preprotein bağlanma bölgesinin yeri tahmin edildi. Bu ölçümler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
FRET haritalama metodolojisini kullanarak, SecA proteini üzerindeki sinyal dizisi bağlanma bölgesini belirledik. Daha da önemlisi, kompleksin 3 boyutlu kristal yapısının varlığı, çalışmamızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Bu haritalama metodolojisinin gücü, etiketleme için konumları tanımlamak için mevcut bir yapıyı kullanma yeteneğinde yatmaktadır. Bu metodoloji 3B bir yapıyı belirlemek için kullanılamaz; Bununla birlikte, yapısal elemanların belirlenmesi56, mevcut bir yapının iyileştirilmesi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R15GM135904 (IM'ye verildi) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe GM110552 (DBO'ya verildi) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 490 nm LED lazer | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimid // DIBO Alkin | Yaşam Teknolojileri | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimid / DIBO Alkin | Yaşam Teknolojileri | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkin | Yaşam Teknolojileri | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkin | Yaşam Teknolojileri | S10906 | |
| Amicon Ultra 4 Santrifüj filtre (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodesilmaltosit (DDM) | Anatrace | D310 | |
| E. coli< / em> alkalin fosfataz sinyal peptidi SP22 | Biyomoleküller Midwest | N/A | Sentezlenmiş özel öğe |
| genişletilmiş sinyal peptit SP41 | Biyomoleküller Midwest | N/A | Sentezlenmiş özel ürün |
| FluorEssence | Fluoromax4 spektroflorometre için | Horiba | sürüm 2.4 |
| Fluoromax 4 spektroflorometre | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Floresan Dinamiği Laboratuvarı, California Üniversitesi, Irvine | Zamanla çözülen bozunmalar için spektral analiz programı | |
| H 4&utangaç; Azido&utangaç; Phe OH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Değirmenci) Et Suyu | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 kolloidal silika (H2O'da ağırlıkça %40 süspansiyon) | bir saçılma çözeltisi yapmak için | Sigma-Aldrich | 420816 |
| PTI Felix GX | Horiba | sürüm 4.1.0.4096 | PTI Time Master Instrument için spektral edinim programı |
| Enstrüman | Horiba | NA | |
| Pymol Moleküler Grafik Programı | Schrödinger | sürüm 2.4 | |
| Su banyosu | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
Kaynaklar
- Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
- Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Cons....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
