Yöntem makalesi

Mitokondriyal Disfonksiyonu Incelemek İçin In Vitro Bir Yaklaşım: Bir Cybrid Modeli

DOI:

10.3791/63452

⸱

9 Mart 2022

 ,  ,  , 
1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transmitokondrial sibridler, mitokondriyal DNA (mtDNA) tükenmiş hücrelerin (rho0 hücreleri) mitokondriyal bozukluklardan etkilenen hastalardan türetilen sitoplastlarla (enüklee hücreler) kaynaştırılmasıyla elde edilen melez hücrelerdir. Hastalığın nükleer veya mitokondriyal kökeninin belirlenmesine, biyokimyasal aktivitenin değerlendirilmesine ve mtDNA ile ilişkili varyantların patogenetik rolünün doğrulanmasına izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) gerçekleştiren mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin eksikliği, insan mitokondriyal bozukluklarının biyokimyasal belirtecidir. Genetik açıdan bakıldığında, OXPHOS benzersiz bir örneği temsil eder, çünkü iki farklı genetik sistemin tamamlanmasından kaynaklanır: nükleer DNA (nDNA) ve mitokondriyal DNA (mtDNA). Bu nedenle, OXPHOS defektleri nükleer ve mitokondriyal kodlu genleri etkileyen mutasyonlardan kaynaklanabilir.

King ve Attardi'nin 1989'da yayınlanan çığır açan çalışması, mtDNA'dan (rho0 olarak adlandırılan) tükenmiş insan hücre hatlarının, sözde "transmitokondrial sibridler" elde etmek için eksojen mitokondri ile yeniden doldurulabileceğini gösterdi. Mitokondriyal bozuklukları (MD'ler) olan hastalardan ve rho0 hücrelerinden çekirdeklerden türetilen mitokondri içeren bu sibridler sayesinde, bir kusurun mtDNA veya nDNA ile ilişkili olup olmadığını doğrulamak mümkündür. Bu sibridler ayrıca bir mutasyonun patojenitesini doğrulamak ve biyokimyasal düzeyde etkisini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu yazıda sibrid üretimi, seçimi ve karakterizasyonunu açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal bozukluklar (MD'ler), nükleer (nDNA) veya mitokondriyal (mtDNA) DNA1'deki mutasyonlara bağlı mitokondriyal fonksiyonlardaki bozulmanın neden olduğu bir grup multisistem sendromudur. En sık görülen kalıtsal metabolik hastalıklar arasındadır ve prevalansı 1:5.000'dir. mtDNA ile ilişkili hastalıklar mitokondriyal genetik kurallarını izler: maternal kalıtım, heteroplazmi ve eşik etkisi ve mitotik ayrışma2. İnsan mtDNA'sı, replikasyon ve transkripsiyon için gerekli diziler, 13 protein kodlayan gen (solunum zincirinin tüm alt birimleri), 22 tRNA ve 2 rRNAgeni 3 içeren kısa bir kontrol bölgesi içeren 16.6 kb'lik çift sarmallı bir DNA çemberidir.

Sağlıklı bireylerde, patolojik koşullarda tek bir mtDNA genotipi (homoplazmi) bulunurken, birden fazla genotip (heteroplazmi) bir arada bulunur. Zararlı heteroplazmik mutasyonlar, OXPHOS'u bozmak ve4 yaşında herhangi bir organı etkileyebilecek hastalıklara neden olmak için kritik bir eşiğin üstesinden gelmelidir. OXPHOS'un ikili genetiği kalıtımı belirler: nDNA mutasyonları için otozomal resesif veya baskın ve X'e bağlı, mtDNA mutasyonları için anne, artı hem nDNA hem de mtDNA için sporadik vakalar.

Mitokondriyal tıp çağının başlangıcında, King ve Attardi5 tarafından yapılan bir dönüm noktası deneyi, mtDNA'nın tamamen tükendiği tümör hücre hatlarından (rho0 hücreleri) çekirdek içeren hibrit hücreler ve MD'li hastalardan mitokondri içeren hibrit hücreler yaratarak bir MD'den sorumlu bir mutasyonun kökenini anlamak için temel oluşturdu. ve nükleer veya mitokondriyal genomda bir mutasyonun mevcut olup olmadığını belirlemek kolay değildi. 1989'da tanımlanan yöntem daha sonra mitokondriyal tıp alanında çalışan birkaç araştırmacı tarafından kullanıldı 6,7,8,9; 10 yakın zamanda ayrıntılı bir protokol yayınlandı, ancak henüz bir video yapılmadı. NGS'nin bir mutasyonun nerede olduğunu kesin ve hızlı bir şekilde tanımlayabildiği günümüzde böyle bir protokol neden geçerli olmalıdır? Cevap, cybrid üretiminin, herhangi bir yeni mtDNA mutasyonunun patojenik rolünü anlamak, heteroplazmi yüzdesini hastalığın ciddiyeti ile ilişkilendirmek ve hastanın otokton nükleer arka planının katkısının bulunmadığı homojen bir nükleer sistemde biyokimyasal bir araştırma yapmak için hala en gelişmiş protokol olmasıdır11, 12,13.

Bu protokol, 35 mm Petri kaplarında yetiştirilen birleşik, hasta kaynaklı fibroblastlardan sitoplastların nasıl elde edileceğini açıklar. Çanakların sitoçalasin B varlığında santrifüjlenmesi, daha sonra polietilen glikol (PEG) varlığında rho0 hücreleri ile kaynaştırılan enüklee sitoplastların izolasyonuna izin verir. Elde edilen sibridler daha sonra klonlar ortaya çıkana kadar seçici ortamda yetiştirilir. Temsili sonuçlar bölümü, mtDNA'nın donör hastaların fibroblastlarınınkiyle aynı olduğunu ve nDNA'nın tümöral rho0 hücre hattının nükleer DNA'sı ile aynı olduğunu kanıtlamak için ortaya çıkan sibridlerin moleküler karakterizasyonunun bir örneğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: İnsan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Bu çalışmada kullanılan fibroblastlar MD hastalarından türetilmiş ve etik gerekliliklere uygun olarak Kurumsal biyobankada saklanmıştır. Hücrelerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verildi. Tüm hücre kültürü prosedürlerini steril laminer akış kabini altında oda sıcaklığında (RT, 22-25 °C) gerçekleştirin. Hücre kültürü ve steril ekipmanlar için uygun steril filtrelenmiş çözeltiler kullanın. Nemlendirilmiş bir inkübatördeki tüm hücre hatlarını %5 CO2 ile 37 °C'de büyütün. Mikoplazma içermeyen kültürleri sağlamak için mikoplazma testleri haftalık olarak yapılmalıdır. 143BTK- rho0 hücreleri daha önce açıklandığı gibioluşturulabilir 5.

1. Hücrelerin kültürü

  1. Herhangi bir prosedüre başlamadan önce, MD hastalarından türetilen fibroblastlardaki mutasyonun varlığını doğrulayın ve Kısıtlama Fragman Uzunluğu Polimorfizmi (RFLP) ve / veya tüm mtDNA dizileme analizleri14 ile heteroplazmi veya homoplazmi yüzdesini ölçün.
  2. Her biri 2 mL Tam Kültür Ortamı içeren dört adet 35 mm Petri kabında tohum fibroblastları (Tablo 1). Hücrelerin% 80'ine kadar kaynaşmasına izin verin (48 saat).
  3. 100 mm'lik bir Petri kabında 8 mL Takviyeli Kültür Ortamında (Tablo 1) 143BTK- rho 0 hücreleri büyütün.
  4. Hücreleri bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.
  5. Rho0 hücrelerinde mtDNA yokluğunu dizileme teknikleri ile kontrol edin14.

2. Fibroblastların enükleasyonu

  1. 250 mL'lik santrifüje uygun dört şişeyi, 20 dakikalık bir döngü için 121 °C'de otoklav sterilizasyonu ile sterilize edin. Bunları bir laboratuvar fırınında veya RT'de kurutun.
  2. Santrifüjü 37 °C'de önceden ısıtın.
  3. Fibroblastları içeren 35 mm'lik bulaşıkları iki kez, kalsiyum ve magnezyum olmadan 2 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak yıkayın.
  4. Bulaşıkların dış yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin ve alkol buharlaşana kadar bekleyin.
  5. Kapakları bulaşıklardan ve vidalı kapakları şişelerden çıkarın. Her tabağı, kapaksız, her 250 mL santrifüj şişesinin altına baş aşağı yerleştirin.
  6. Her şişeye yavaşça 32 mL Enükleasyon Ortamı ekleyin (Tablo 1), ortamın yemeğe girmesine ve hücrelerle temas etmesine izin verin. Uzun bir cam Pasteur pipet kullanarak bulaşıklardaki kabarcıkları çıkarın ve ucu bir Bunsen alevinde kıvırın.
    NOT: Ortamın çanağa girmesine ve hücrelerle temas etmesine izin vermek için kabarcıkları çıkarmak önemlidir.
  7. Her şişeyi vidalı kapakla kapatın ve santrifüje aktarın.
  8. 37 °C ve 8.000 × g'de 20 dakika santrifüj, maksimum hızlanma, yavaşlama yavaş. Santrifüjü dengelemeye dikkat edin: her şişeyi karşı ağırlıklandırın. Gerekirse, uygun miktarda Enucleation Medium ekleyerek ağırlığı ayarlayın.
  9. Santrifüjleme sırasında, ortamı 143BTK- rho 0 kültür plakalarından aspire etmek ve atmak için vakum veya10 mL serolojik pipet kullanın ve kalsiyum ve magnezyum olmadan 4 mL 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın.
  10. Hücre tek katmanını tamamen örtmek için 2 mL tripsin ekleyin.
  11. Bulaşıkları ~ 2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  12. Bulaşıkları inkübatörden çıkarın, canlı hücreler için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücre ayrılmasını gözlemleyin (4x veya 10x hedefler) ve 2 mL Takviyeli Kültür Ortamı ekleyerek enzim aktivitesini inhibe edin.
  13. Çanak içindeki hücre süspansiyonunun 4 mL'sini 10 mL'lik bir pipetle aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  14. Bir Burker hemositometre odası veya otomatik bir sayaç kullanarak hücreleri sayın.
  15. Santrifüjlemenin sonunda (adım 2.8), ortamı şişelerden aspire edin ve atın.
  16. Şişeleri daha önce% 70 etanol ile püskürtülen steril bir gazlı bez üzerinde ters çevirerek bulaşıkları çıkarın. Bulaşıkların dış yüzeyini ve kapaklarını% 70 etanol ile temizleyin. Alkol buharlaşana kadar bekleyin ve ardından bulaşıkları kapatın.
  17. Devam etmeden önce, canlı hücreler için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak sitoplast (hayalet) oluşumunu kontrol edin (objektif 4x veya 10x). Sitochalasin B tarafından indüklenen çekirdeklerinin ekstrüzyonu nedeniyle aşırı derecede uzatılmış fibroblastları arayın.
  18. Her 35 mm'lik kaba, %5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 2 mL'lik 143BTK- rho 0 kültür ortamında yeniden askıya alınmış 143BTK- rho0 hücresinden 1 × 10 6'sını ekleyin.
  19. Bulaşıkları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 saat bekletin ve 143BTK- rho0 hücrelerinin hayaletlerin üzerine yerleşmesine izin verin. Bulaşıkları rahatsız etmeyin.

3. Enüklee fibroblastların rho 0 hücreleri ile füzyonu

  1. 3 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı bulaşıklardan aspire edin ve atın.
  2. Yapışkan hücreleri iki kez 2 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yüksek glikoz ile serumsuz veya Minimum Esansiyel Ortam (MEM) ile yıkayın.
  3. Ortamı aspire edin ve atın.
  4. Hücrelere 500 μL PEG çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve tam olarak 1 dakika inkübe edin.
  5. PEG çözeltisini aspire edin ve atın.
  6. Hücreleri 2 mL DMEM yüksek glikoz kullanarak serum olmadan veya MEM ile üç kez yıkayın.
  7. 2 mL Füzyon Ortamı ekleyin (Tablo 1) ve inkübatörde gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.

4. Cybrid seçimi ve genişlemesi

  1. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın, hücreleri yukarıda açıklandığı gibi tripsinize edin (adım 2.9-2.13) ve her 35 mm'lik kabın içeriğini 100 mm'lik bir kaba aktarın.
  2. 8 mL Seçim Ortamı (Tablo 1) ekleyin ve plakaları inkübatöre% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin.
  3. Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.
  4. Hücre kolonileri görünene kadar ~ 10-15 günlük seçim bekleyin.
  5. Tüm klonları toplayarak ve sonunda yeniden klonlanabilecek ve daha ileri araştırmalar için kullanılabilecek cybridlerin yedeği olarak "büyük" bir kültür oluşturarak dört Petri kabından birini dondurun.
  6. Klonlar ortaya çıkana kadar Takviyeli Kültür Ortamında (Tablo 1) 50-100 hücre/tabakta kalan kültür tabaklarındaki hücreleri tripsinize edin, sayın ve bir veya daha fazla Petri kabına tohumlayın. Birkaç gün büyümelerine izin verin.
  7. Kalan hücreleri RT'de 3 dakika boyunca 1.200 × g'de santrifüjleme ile pelet edin ve süpernatanı atın.
  8. Peletten DNA çıkarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  9. Daha önce bildirildiği gibi değişken sayıda tandemly tekrarlanan (VNTR) analizi ile genotipleme gerçekleştirin15.
  10. Petri kabından klonlama silindirleri veya pipet ucu ile klonları alın, farklı klonların bir araya gelmesini önlemek için bir stereomikroskop kullanın ve bunları her biri 200 μL Takviyeli Kültür Ortamı içeren 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın (Tablo 1).
  11. DNA'yı dondurmak ve çıkarmak için yeterli hücre olana kadar her klonu genişletin.
  12. RFLP veya diğer sıralama yöntemleriyle her klonun mutasyon yüzdesini doğrulayın. İdeal olarak, her ikisi de homoplazmik mutant mtDNA'ya (% 100 mutasyon) ekleyen vahşi tip mtDNA'lı klonları (% 0 mutasyon) ve farklı mutasyon yüzdelerine sahip klonları elde etmeye çalışın. Kibrid oluşturma protokolünün şematik diyagramı için Şekil 1'e bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sibrid üretmek, 3 günlük laboratuvar çalışması artı bir seçim süresi (~ 2 hafta) ve klonların büyümesi için ek 1-2 hafta gerektirir. Kritik adımlar sitoplastların kalitesi ve seçim dönemidir. Sibridlerin morfolojisi rho0 donör hücrelerininkine benzer. Hücrelerin kimliğini doğrulamak için sibridlerde doğru mtDNA ve nDNA'nın atanması zorunludur. Örnek Şekil 2'de verilmiştir. Bu durumda, mitokondriyal miyopati, ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri ataklar (MELAS) ile ilişkili ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mtDNA, koruyucu histonların eksikliği ve solunum zincirine yakın konumu nedeniyle nDNA'ya kıyasla çok yüksek bir mutasyon oranına sahiptir, bu da molekülü onarım sistemleri tarafından verimli bir şekilde karşı konulamayan zararlı oksidatif etkilere maruz bırakır16. İlk patojenik mtDNA mutasyonları 1988'de17,18 olarak tanımlandı ve o zamandan beri çok sayıda mutasyon tanımlandı. NGS teknolojisi, tüm mitokondriyal genomu taramak ve varyantla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Mariani Vakfı tarafından finanse edilen Mitokondriyal Çocuk Hastalıkları Çalışmaları Merkezi'nde (http://www.mitopedia.org) gerçekleştirilmiştir. VT, Nadir Nöromüsküler Hastalıklar için Avrupa Referans Ağı'nın (ERN EURO-NMD) bir üyesidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5-Bromo-2'-DeoksiüridinSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6 kuyulu PlakalarCorning3516
96 kuyulu PlakalarCorning3596
Kan ve Hücre Kültürü DNA ekstraksiyon kitiQIAGEN13323
SantrifüjBeckman CoulterAvanti J-257,200 rcf, 37 ° C
Santrifüj şişeleri, 250 mLBeckman Coulter356011
Drechslera dematioidea'dan Cytochalasin BSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
Diyaliz FBSGibco26400-036 100mL
DMEM Yüksek Glikoz (L-Glutamin W/Sodyum Pirüvat olmadan)EuroCloneECB7501L
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu - PBS (w/ w/ o Magnezyumsuz Kalsiyum)EuroCloneECB4004L
Etanol Mutlak SusuzCarlo Erba414601
FetalClone III (Sığır Serum Ürünü)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
Cam pastör pipetleriCanlı
Ters Araştırma MikroskobuNikonECLIPSE TE200
JA-14 Sabit Açılı Alüminyum RotorBeckman Coulter339247
Laboratuvar otoklav Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutamin 200 mM (100x)EuroCloneECB 3000D
Minimum Temel Orta MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert Mikoplazma Tespit KitiLonzaLT07-318
PEG (Polietilen glicol çözeltisi)Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
Penisilin-Streptomisin (çözelti 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC Tabakları 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC Tabakları 35 mmEuroCloneET2035
Sodyum Piruvat 100 mMEuroCloneECM0542D
StereomikroskopNikonSMZ1000
EuroCloneECB3051DU3003-5G'de
2.5
Hücre Mikroskobu için VWR M4150NO250SP4 HBSS Uridine Sigma-Aldrich (Merck)Tripsin%

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
  2. DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
  3. El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  6. Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
  7. Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
  8. Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
  9. Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).
  10. Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
  11. Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
  12. Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).
  13. Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).
  14. Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
  15. Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
  16. Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061(2020).
  17. Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
  18. Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
  19. Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
  20. Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).
  21. Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
  22. Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
  23. Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
  24. Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591(2020).
  25. Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
  26. Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
  27. Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
  28. Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondriyal DNA MutasyonuOksidatif FosforilasyonSolunum Zinciri KompleksleriSibrit Olu turmaHeteroplazmi AnaliziFibroblast F zyonuRestriksiyon Fragman AnaliziMitokondriyal Miyopati

İlgili makaleler