Method Article

İntraperitoneal Bakteriyel Enfeksiyonun Murin Modelinde Splenik Mikroveziküllerin İzolasyonu

DOI:

10.3791/63480

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Universite de Strasbourg, 2Regenerative Nanomedicine, Centre de Recherche en Biomédecine de Strasbourg, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarından dökülen mikro-parçacıklar, hücresel efektörler olarak işlev görür. Dalak mikro-parçacıkları (SMV'ler) patofizyolojik durumların vekil belirteçleridir. Sıçanlarda ve farelerde, SMV içeriği ve özellikleri yaşlanmayı veya iltihabı karakterize eder ve sitoprotektif tedavilerle değiştirilir, bu da onları klinik öncesi araştırmalar için değerli ancak bol miktarda izleme aracı haline getirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroveziküller (MV'ler), proinflamatuar ve prokoagülan hücresel efektörler olarak işlev gören aktive edilmiş hücrelerin plazma zarından salınan mikron altı fragmanlardır. Sıçanlarda, dalak MV'leri (SMV'ler) patofizyolojik durumların vekil belirteçleridir. Önceki in vitro çalışmalar, önemli bir periodontal patojen olan Porphyromonas gingivalis'in (P. gingivalis) endotel dökülmesini ve apoptozu mümkün kıldığını, lipopolisakkaritin (LPS) ise splenosit kaynaklı mikro-parçacıkların (SMV'ler) dökülmesini desteklediğini göstermiştir. İn vivo çalışmalar, SMV dökülmesinin farmakolojik kontrolünün fizibilitesini göstermiştir. Bu protokol, splenik SMV'lerin P. gingivalis akut murin enfeksiyonu modelinden izole edilmesi için standart bir prosedür oluşturmaktadır. P. gingivalis enfeksiyonu genç C57BL / 6 farelerde intraperitoneal enjeksiyon ile indüklenmiştir (haftada 5 x 107 bakteri üç enjeksiyonu). İki hafta sonra dalaklar toplandı, tartıldı ve splenositler sayıldı. SMV'ler protein, RNA ve protrombinaz testleri ile izole edildi ve ölçüldü. Hücre canlılığı, propidyum iyodür veya tripan mavisi dışlama boyaları ile değerlendirildi. Splenosit ekstraksiyonunu takiben, 24 saatlik splenosit kültüründen sonra akış sitometrisi ile nötrofil sayıları elde edildi. P. gingivalis enjekte edilen farelerde, dalak ağırlığında 2.5 kat artış ve splenosit sayısında 2.3 kat artış gözlenirken, nötrofil sayısı 40 kat artmıştır. P. gingivalis enjekte edilen farelerden elde edilen splenositlerin hücre canlılığı %75-96 arasında değişmiş ve maruz kalmayan kontrollere kıyasla anlamlı bir fark olmaksızın 24 saatlik kültürden sonra %50 oranında azalmıştır. Bununla birlikte, enjekte edilen farelerden alınan splenositler, protrombinaz testi veya protein ölçümleri ile daha yüksek miktarda MV döker. Veriler, prokoagülan SMV'lerin intraperitoneal P. gingivalis enfeksiyonuna erken dalak yanıtını değerlendirmek için güvenilir araçlar olduğunu göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropartiküller veya ektozomlar olarak da adlandırılan mikroveziküller (MV'ler), çeşitli hücre uyaranlarına yanıt olarak vücut sıvılarında ve hücre dışı boşlukta salınan 0.1-1.0 μm çapında plazma zarı parçalarıdır. İlk olarak, çoğunlukla fosfatidilserin (PSer) olmak üzere prokoagülan fosfolipidleri açığa çıkaran trombosit tozu olarak tanımlanan MV'ler, kan pıhtılaşma komplekslerinin 1,2 montajı için ek bir yüzey oluşturur. Prokoagülan efektörler olarak dolaşımdaki MV'lerin anahtar rolü, disfonksiyonel PSer maruziyetine ve kanamaya yol açan nadir bir genetik hastalık olan Scott sendromu2 olan hastalarda gösterilmiştir (Ek Şekil 1). MV'ler, diyabet, kronik böbrek hastalığı, preeklampsi ve hipertansiyon gibi kardiyovasküler bozukluklarla ilişkili kronik hastalıklarda trombotik riskin dolaşımdaki biyobelirteçleri olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir 3,4. Şu anda miyokard1 gibi sıvılarda veya organ dokularında gerçek hücresel efektörler olarak kabul edilmektedirler. Aktif proteinleri, lipitleri ve miRNA'yı taşıdıkları için hemostaz, iltihaplanma, vasküler anjiyogenez ve vasküler büyüme veya doku yeniden şekillenmesi gibi vasküler tepkileri uzaktan modüle ederler5.

Klinik çalışmalarda MV'lerin risk faktörleri açısından prognoz değeri incelenirken, hastanın sıvılarından veya dokusundan izole edilen MV'ler efektör özelliklerinin ex vivo olarak değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır6. MV biyogenezini ve çapraz konuşma yeteneklerini yöneten mekanizmaların deşifre edilmesi, genellikle hücre kültürü modellerinde, MV'ler tarafından maruz kalan veya içinde kapsüllenen aktif molekülleri ve bunların aşağı akış sinyalizasyonunu tanımlamak için gerçekleştirilir. Hedef hücrelerle MV etkileşimleri, uygun karşı ligandlar mevcut olduğunda membran protein/protein bağlanmasına ve/veya lipid füzyonunabağlı olacaktır 7.

Fizyolojik koşullar altında, plazmada dolaşan MV'ler, soy kümesi farklılaşma belirteçleri (CD)8,9 tarafından tanımlandığı gibi, çoğunlukla vasküler hücrelerden kaynaklanır. Bununla birlikte, patolojide, özellikle kanser10 ve greft reddi 11,12'de, MV'ler hasarlı dokudan dökülür ve zararlı prokoagülan ve proinflamatuar özellikler taşır. Bunlar sistemik dolaşımda tespit edilir, bu da onları koruyucu veya gençleştirme tedavilerini ve olası farmakolojik hedefleri izlemek için yararlı problar haline getirir13. MV'ler sağlık ve hastalıkta vasküler ve doku hücre homeostazını yansıtan dinamik bir depolama havuzu olarak dolaştığından, küçük hayvanlarda IV enjeksiyonu veya nazal damlatmadan sonra uzaktan etkilerinin daha iyi anlaşılması da in vivo olarak araştırılmalıdır14,15. Gerçekten de, MV'lerin abartılı inflamasyon ve trombozu birleştiren karmaşık yollara önemli katkıda bulunduğu düşünülmektedir16.

Periodontitis, diş destek dokularını etkileyen enfeksiyöz kökenli inflamatuar bir hastalıktır17,18 ve trombotik risk ile ilişkilidir. Diş eti kanaması, alveol kemiği harabiyeti, diş hareketliliği ile karakterizedir ve sonuçta diş kaybına yol açabilir. Periodontitis dünya çapında oldukça yaygındır ve nüfusun %50'sinden fazlasını etkiler, %11'i ciddi bir form gösterir19. Periodontitis, doku yıkımını tetikleyen şiddetli bir enflamatuar yanıtı sürdüren subgingival biyofilmlerin bakteriyel disbiyozu ile indüklenir20. Son on yılda, periodontitis kardiyovasküler bozukluklar, diyabet ve romatoid artrit gibi sistemik hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Olası açıklamalar, periodontal patojenlerin belirli bir mesafedeki etkisi ve/veya interlökin (IL-1, IL-6) ve TNF-αgibi proinflamatuar sitokinlerin aracılık ettiği artmış sistemik inflamasyondur 21,22.

Periodontitis başlangıcı ve gelişimi ile ilişkili patojenler arasında, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)23, lipopolisakkarit (LPS)24 dahil olmak üzere çeşitli virülans faktörlerini toplayan en şiddetli lezyonlarda bulunur ve Toll benzeri reseptör (TLR) aracılı inflamatuar yanıtlarıindükleyen 25 ve ilk enfeksiyon bölgesinde nötrofillerin ve polimorfonükleer lökositlerin (PMN'ler) alınması26. P. gingivalis'ten elde edilen LPS, TLR-4 veya TLR-2'yi aktive ederek immün tespiti ve bakteriyel sağkalımdan kaçınmayı kolaylaştırır27. Vasküler düzeyde, TLR2'nin LPS ile aktivasyonu immünotromboz ile ilişkilidir. P. gingivalis'in TLR-4'e bağlı tanıma önemli ölçüde bozulmuşken TLR-2 sinyalini uyarma konusundaki benzersiz yeteneği, kalıcı düşük dereceli enfeksiyonu desteklemektedir28,29.

Düşük dereceli patojen, kronik ve sürekli enfeksiyona MV yanıtlarını incelemek için in vivo prosedürler azdır. Sisküler MV'lerin ekstraksiyonu için metodolojik yaklaşımlar literatürde yetersiz tanımlanmıştır ve genellikle dalak kan dolaşımındaki bakteri ve virüsleri algılarken katı tümörler, karaciğer steatozu, aterotrombotik plaklar veya greftler 11,29,30 gibi patolojik dokulardan MV'lerin toplanması ile ilgilidir. Ayrıca immün yanıtta yer alan eritrositleri, trombositleri, lenfositleri, monositleri, bazofilleri ve eozinofilleri depolar. Kırmızı hamurdan elde edilen nötrofiller gibi granülositler de patojenleri yok eden ve enfeksiyonun yayılmasını önleyen reaktif oksijen türleri (ROS) ve proteazlar üretir31,32. Şaşırtıcı bir şekilde ve bildiğimiz kadarıyla, dalak MV'leri patojen kaynaklı doku hakaretleri bağlamında araştırılmamıştır. Fizyopatolojide doku MV'lerinin varyasyonlarını incelemek için küresel olarak karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.

Laboratuvarımızdan elde edilen in vitro veriler, LPS'nin sıçan splenositlerinden prokoagülan MV'lerin dökülmesini indüklediğini ve bunun da kültürlenmiş koroner endotel hücrelerinin yaşlanmasını ve ardışık bir proinflamatuar ve proinflamatuar prokoagülan endotel fenotipini11 tetiklediğini gösterdi. Dalak MV'lerinin farmakolojik kontrolünün fizibilitesi, hayvanın optimize edilmiş bir omega-3 formülü ile tedavi edilmesinden sonra daha da gösterilmiştir. Orta yaşlı ve yaşlı sıçanların oral gavajının, hem prokoagülan MV'lerin splenositlerden dökülmesine hem de koroner endotelyuma doğru prosenan zararlı özelliklerine karşı koruyucu olduğu bulunmuştur33.

Kanla karşılaştırıldığında, dalak bir bireyde önemli bir lökosit kaynağı olma avantajını sunar. Ek olarak, yakın zamanda bir dalak-kardiyak eksen önerilmiştir 3,34, bu da dalağı farmakolojik kontrol için faydalı ilgi gören enfeksiyonla ilişkili kardiyovasküler riske olası bir katkıda bulunur. SMV'lerin özelliklerinin veya salınımının değerlendirilmesi, patojen kaynaklı veya inflamatuar yanıtların anlaşılmasında anahtardır. İlginç bir şekilde, tedavi edilen hayvanlarda ve farklı fizyopatolojik modellerde (yaş, hipertansiyon, diyabet) elde edilebilir. Gerçekten de, orta yaşlı ve yaşlı sıçanlar33 karşılaştırılarak, dalak MV'lerinin özellikleri ve salınımındaki farklılıklar, basit bir 24 saatlik splenosit kültürünün ardından kanıtlanabilir.

Sıçanlarda dalak MV'lerinin efektör özelliklerinin fizyopatolojik durum ve farmakolojik kontrollerinin fizibilitesi ile değiştiğine dair yukarıdaki kanıtlar göz önüne alındığında, burada murin dalağı MV'lerinin izolasyonu için standartlaştırılmış bir protokol açıklanmaktadır. Prosedür, SMV'lerin aracılı etkilerini destekleyen in vivo mekanizmaların, sonunda mühendislik farelerinde derinlemesine araştırılmasına daha iyi uyacaktır. Prosedür, patojenin dalak MV (SMV) efektör özellikleri üzerindeki uzak etkisinin kanıtını oluşturmak için P. gingivalis tarafından lokal intraperitoneal enfeksiyon kullanılarak C57BL/6 farelerinde oluşturulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel protokoller, yerel Etik Kurul (APAFIS # 28745-2020121815051557) ve ev sahibi Üniversite ve INSERM'in hayvan bakımı tarafından onaylandı ve ilgili yönergeleri takip etti. Deneyler için 6-8 haftalık erkek Young C57BL/6 fareler kullanıldı. Fareler, ağrı ve stresi değerlendirmek için düzenli olarak incelendi ve ağırlıkları günlük olarak izlendi. Aksi belirtilmedikçe, tüm ekstraksiyon tamponları ve çözeltileri steril ve oda sıcaklığında olmalıdır.

1. Hayvan hazırlama

  1. Fareleri 2 hafta boyunca her 2 günde bir altı intraperitoneal P . gingivalis (PG) enjeksiyonu ile uygulayın (haftada üç 5 x 107 bakteri enjeksiyonu, Ek Dosya 1).
  2. 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin kombinasyonu kullanarak fareleri uyuşturun.
  3. Anestezi uygulanmış fareleri kurban edin ve laparotomiden sonra dalağı alın.
    NOT: P. gingivalis enfeksiyonu için özel koşullar ve dalak hasadı için hayvanların kurban edilmesi, Ek Dosya 1'in "hayvan deneyi" bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Protokol adımlarının şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

2. Splenositlerin ekstraksiyonu

  1. Bir neşter kullanarak, dalak dokusunu 3 mL RPMI içeren antibiyotikler (Streptomisin (100 U / mL) / Penisilin (100 U / mL), Fungizone (250 mg / mL), L-glutamin (2 mM)) ile doldurulmuş ve %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile takviye edilmiş bir Petri kabında ~ 1 mm'lik dilimler halinde kıyın (bkz.
  2. Dilimleri, önceden 50 mL'lik bir polistiren tüpe bağlı olan bir eleğe aktarın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  3. Elek üzerindeki dokuları ezmek için bir şırınganın pistonunu havaneli olarak kullanın.
  4. Süzgeci RPMI ortamı (3 mL) ile durulayın.
  5. Hücre süspansiyonu elüasyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı geri akışa karşı dikkatli bir şekilde atın.

3. Eritrositlerin ozmotik şok ile çıkarılması

  1. 1 mL ACK tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), iyice karıştırın, oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin ve el döndürerek hafifçe çalkalayın.
  2. 9 mL RPMI ekleyerek seyreltin ve aspirasyon ve geri akış kullanarak iyice karıştırın.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı aspirasyon ve geri akışla atın ve peleti 5 mL RPMI ortamında yeniden süspanse edin.
  5. Nazikçe karıştırın (aspirasyon/geri akış) ve sonunda pipetleyerek veya bir elek kullanarak lipidik kalıntıları temizleyin.

4. İzole splenosit konsantrasyonunun ayarlanması

  1. 900 μL RPMI içeren 1,5 mL'lik bir mikrotüpü doldurun.
  2. Bir mikropipet kullanarak, 100 μL hücresel süspansiyon alın, 900 μL RPMI ortamı içeren 1.5 mL mikrotüpe ekleyin ve iyice karıştırın.
  3. Seyreltilmiş hücrelerin 10 μL'sini bir mikrotüpe aktarın, 10 μL tripan mavisi dışlama boyası ekleyin ve iyice karıştırın.
  4. 10 μL çözeltiyi (adım 3.3) otomatik hücre sayacının sayma slaytına yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücre sayısını belirleyin.
    NOT: Cihaz yazılımı iki değer verir: toplam hücre sayısı ve canlı hücre sayısı ve yüzdesi.
  5. Canlı hücrelerin konsantrasyonunu 3 veya 5 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın (Vmaks = 20 mL; maksimum toplam kapasite 100 x 106 hücre / mL'dir).
  6. Hücreleri RPMI içeren 75 mL'lik bir şişeye tohumlayın.
  7. Şişeyi nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 24 saat dikey olarak inkübe edin.
    DİKKAT: Tripan mavisi mutajenik ve kanserojen bir ajandır35,36. Sayma sırasında, kaputun dışında bile eldiven giydiğinizden emin olun. Uçları ve sıvıları hemen kaplara atın ve tezgah yüzeyini yıkayın.
    NOT: Toplanan hücreler 50 x 106'dan küçükse, 25 mL'lik bir kültür şişesi kullanın. Hücre sayısı bir kişiden diğerine çok fazla değişmemelidir. Bu aşamada canlı hücrelerin yüzdesi genellikle %80'in üzerindedir.

5. Splenosit mikro-parçacıklarının izolasyonu

  1. 24 saat sonra, şişe içeriğini 50 mL'lik bir polipropilen veya polistiren tüpe dökün.
  2. Hücreleri ve kalıntıları temizlemek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin.
  3. Santrifüjlemeden sonra, izolasyon verimini hesaplamak için ilk MV konsantrasyonunun nihai ölçümü için 100 μL 1. süpernatant (SN1) tutun. SN1 birimine dikkat edin.
  4. SN1'i oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin.
  5. Peleti atın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 450 x g'da tekrar santrifüjleyin. SN2'yi hızla çekin ve toplayın (hacme dikkat edin).
  6. SN2'yi konik şekilli tabanlara sahip 1.8 mL mikrotüplere aktarın. Çok fazla kalıntının SN1'deki MV ölçümünü bozması durumunda izolasyon verimini hesaplamak için ilk MV konsantrasyonunun nihai ölçümü için 100 μL SN2 tutun.
  7. Peletlere (hücrelere) 5 mL RPMI ortamı ekleyin ve splenositleri sayın.
    NOT: Hücre süspansiyonu, %0.1 paraformaldehitte (nihai konsantrasyon) akış sitometrisi karakterizasyonu için de sabitlenebilir37.
  8. SN2'yi 4 °C'de 1 saat boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve sonunda boş rotoru 4 °C'de çalıştırarak rotoru önceden soğutun. Bu adım SN3 oluşturur.
  9. Tek bir steril 50 mL tüpü (kaputun altında) ters çevirerek SN3'ü her bir mikrotüpten hemen çekin. SN3 birimine dikkat edin.
  10. Kaputun altında bir pipet kullanarak SN3'ü nazikçe karıştırın. Süspansiyonda nihai ölçümler için alikotları saklayın.
    NOT: Çözelti artık MV'lerden tükenmiştir, ancak çözünür aracıları ve eksozomları içerir.
  11. Peletteki MV'lerin yeniden süspansiyonunu mekanik olarak desteklemek için her bir mikrotüpü (kapalı) çivili bir rafa kazıyın.
  12. İlk mikrotüpe Ca2 + ve Mg2 + (HBSS) içermeyen 200 μL Hank'in dengeli tuzlu su çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  13. 1 mL mikropipet kullanarak hafif aspirasyon/geri akış döngüleri (~ 10 kez) ile ilk tüpün OG peletini yeniden süspanse edin. Köpürmeyi önlemek için büyük özen gösterin, çünkü bu, süspansiyondaki veziküllerin ve diğer kısımların oksidasyonunu teşvik edecektir.
  14. İlk 200 μL yeniden askıya alınmış MV'leri hasat edin ve bunları peletin üzerindeki ikinci tüpe dökün. Yukarıdaki gibi yavaşça karıştırın ve ardından tekrar üçüncü tüpe dökün ve hafifçe karıştırın. Süspansiyon tüpten tüpe giderek daha bulanık hale gelir. Üçüncü tüpü kapatın.
  15. Sonraki üç mikrotüpün toplanmasını yukarıdaki gibi başlatın (adım 4.14).
  16. Yeniden askıya alınan tüm MV'leri tek (veya iki) bir kolektör mikrotüpünde (konik şekilli alt kısım ile 2 mL) toplayın. Bu adımın veriminin nihai hesaplanması için 50 μL tutun. Süspansiyon hacmine dikkat edin.
  17. Kolektör tüpünü 4 °C'de 1 saat boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin. Bu adım SN4 oluşturur.
  18. SN4'ü hemen atın (bir süpernatan toplama tüpünün üzerine dökün). Saflaştırma adımının verimini hesaplamak için bir SN4 alikotu tutun ve peleti 500 μL HBBS'de (Ca2+ ve Mg2 + olmadan) nazikçe yeniden süspanse edin. Saflaştırma verimini hesaplamak ve hacmini not etmek için yeniden askıya alınmış peletin 50 μL'lik bir alikotunu saklayın.
  19. Yeniden süspanse edilmiş peleti steril koşullar altında fonksiyonel testler için bir aya kadar 4 °C'de veya yapısal testler için -20 °C'de saklayın.
  20. Süpernatantlardaki ve/veya pelet süspansiyonlarındaki MV'lerin konsantrasyonunu ölçerek her adımın veya tüm prosedürün saflaştırma verimini (aşağıdaki NOTA bakın) hesaplayın.
    NOT: Saflaştırma Verimi (%): ([MV1] x SN1 hacmi) / ([MV4] x son süspansiyon hacmi) x 100.
    Bu verimin, kültür şişesinden izole edilen splenosit sayısına rasyonelleştirilmesi ve adım 4.4'te sayılması gerekir. Mevcut deneyin saflaştırma verimi, 111 x 106 hücre ve 60 mL süpernatandan başlayarak ~%70'tir.
    1. SMV'lerden yoksun ve esas olarak eksozomlar (SN2 ve SN4) içeren süpernatantlarda kalan SMV'leri ölçerek prosedürün neden olduğu SMV kaybını değerlendirin.
    2. Yüksek hassasiyet ve özgüllük için MV konsantrasyonunu TRPS veya protrombinaz testi38 ile ölçün.
      DİKKAT: Santrifüjlemeden sonra MV'leri, süpernatantın hızlı bir şekilde baş aşağı dökülmesiyle hasat edin. Beklemek veya U şeklindeki mikrotüplerin kullanılması, mikrotüp duvarında OG kaybına neden olacaktır. Süpernatanı atmak için asla mikropipet kullanmayın; Bunun yerine pelet aspire edilebilir. Santrifüj durdurulduktan sonra işlemi asla geciktirmeyin. Aşırı hızlı santrifüjleme, OG peletinin eksozomlar tarafından kirlenmesine neden olacaktır.
      NOT: Santrifüjleme hızları ve süresi, eksozomlar tarafından minimum kontaminasyon ile bir OG zenginleştirmesi için optimize edilmiştir. Bu protokol, dalak monosit/makrofaj MV'lerini incelemek için güvenilir değildir, çünkü bu hücreler fagosit yapabilir ve kendi MV'lerini hızla yeniden yakalayabilir39. Hücre canlılığı nedeniyle hücre kaybı nedeniyle protokol duraklatılamaz ve daha sonra yeniden başlatılamaz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlanan veriler, iki ana hayvan koşulu kullanılarak tüm prosedürün tam bir temsilini verir: tedavi edilmemiş genç C57BL / 6 fareleri ve 2 hafta boyunca her 2 günde bir altı intraperitoneal (IP) PG enjeksiyonuna tabi tutulan yavrularını kontrol edin. Ayrıca, 2 hafta sonra dalak yanıtı üzerinde intraperitoneal PG enjeksiyonunun uzaktan etkisini gösterirler. Splenosit mikro-parçacıkları, protrombinsaz enzimatik testi ile veya proteinleri ve RNA konsantrasyonu spektrofotometrik olarak ölçülerek ölçüldü ve nötrofillerin oran...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, dalağın, farelerde sınırlı hacimdeki kan gibi diğer kaynaklarla karşılaştırıldığında, fizyopatolojik önemi olan önemli ve güvenilir bir MV kaynağı olduğunu doğrulamaktadır. Önlem alınması şartıyla, yöntemin kurulumu kolaydır ve pahalı ekipman gerektirmez. İn vivo değerlendirmeden başka alternatif bir yol mevcut olmadığından, mevcut model, pro-ilaçların MV dökülmesi üzerindeki etkisini incelemek için değerli bir yöntem gibi görünmektedir. Daha da önemlisi, burada sunu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, dalağın karmaşık akış sitometrisi analizine uzman yardımı ve formasyonu için Service commun de cytométrie en flux'tan (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) Claudine Ebel'e ve sıçan dalak hücrelerinin etiketlenmesi konusunda ilk eğitim için Ali El Habhab'a borçludur. Deniz Karagyoz kazı yapmaya, yayın toplamaya yardım etti. Bu çalışma kısmen iki ANR hibesi COCERP (N°A17R417B), ENDOPAROMP(N°ANR-17-CE17-0024-01) ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL tüp tipi EppendorfDutscher54816Konik alt sté riel mikrotüpler
Allegra 64 R SantrifüjBeckman Coulter
Otomatik hücre sayacıBiorad
Sığır serum albüminiEuromedex04-100-812-EHazırlanmış, 0.22 & ile filtrelenmiş; m elek ve 4 &° C'de saklanır; Aşağıdaki formülleri kullanarak steril koşullar altında C: 2 mM EDTA,% 0,5 BSA ve steril PBS
CD11 (Mac-1)e-Biosciences45-00112-80eFluor 450'ye konjuge edilmiş; λ maks uyarma 405 nm ve lambda; maks emisyon 445 nm
CD16/32BD Biosciences553142konjuge
olmayan EDTACalbiochemCalbiochemS 6381-92-6
Falcon tubeHücre yıldızı22726150 mL
Fetal Sığır serumuDutscherS1810-500Parti numarası = S14028S1810
Fortessa AriaBD Biosciencesiçin hücre sıralama
Fortessa akış sitometresiBecton-Dickinson.
FungizonePAN biyoteknolojiP06-01050
HBSSGibco14175-053Fenol kırmızısı olmadan, Ca+2 ve Mg olmadan + 2< / sup>
ICAM-1abcamab171123
LYG-6 (Gr-1)BD Biosciences566218BUV395 ile konjuge edilmiş; λ maks uyarma 348 nm, &da; max emisyonu 395 nm
Lizis tampon eritrositleri (ACK)SigmaHazırlanmış, 0.22 & mikro ile filtrelenmiş; m elek ve 4 ° C'de saklanır; Aşağıdaki formülleri kullanarak steril koşullar altında C: NH < alt > 4 < / alt >Cl, 0.15 M (molarite), 53.491 (mw) 4 g < br / > KHCO < alt > 3 < / alt> 1 mM (molarite) 100.115 (mw), 50 mg < br / > EDTA ve nbsp; 0.1 mM (molarite), 292.24 (mw), 14.6 g
pH: 7.2– 7.4
NanoDrop 1000 spektrofotometreThermoscientific
PBSLonza17-516FCa + 2< / sup> ve Mg + 2< / sup>
Plastik petri kabı100 mm
Polistiren tüpFalcon352070
q-Nano GoldiZON bilimi
olmadanRPMI 1640 kültür ortamı: 2 g/L glikozPAN biotechp04-18047Streptomisin (100 U/mL) /Penisilin (100 U/mL), Fungizon (250 mg/mL), L-glutamin (2 mM) ve FBS %10 ile desteklenmiştir.
Neşter
Elek NaylonŞahin ABD352360100 & m
Streptomisin / PenisilinPAN biyoteknolojiP06-07100
Şırınga2 mL
Tripan MaviBiorad1450013
VCAM1abcamab215380

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loyer, X., et al. Intra-cardiac release of extracellular vesicles shapes inflammation following myocardial infarction. Circulation Research. 123 (1), 100-106 (2018).
  2. Aupeix, K., Toti, F., Satta, N., Bischoff, P., Freyssinet, J. M. Oyxsterols induce membrane procoagulant activity in monocytic THP-1 cells. Biochemical Journal. 314 (3), 1027-1033 (1996).
  3. Emami, S., et al. Antibiotic resistance pattern and distribution of pslA gene among biofilm producing Pseudomonas aeruginosa isolated from waste water of a burn center. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (11), 23669(2015).
  4. Burger, D., et al. Microparticles: biomarkers and beyond. Clinical Science. 124 (7), 423-441 (2013).
  5. Braeckmans, K., et al. Sizing nanomatter in biological fluids by fluorescence single particle tracking. Nano Letters. 10 (11), 4435-4442 (2010).
  6. Chironi, G. N., et al. Endothelial microparticles in diseases. Cell and Tissue Research. 335 (1), 143-151 (2009).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
  8. Chen, T. S., et al. Mesenchymal stem cell secretes microparticles enriched in pre-microRNAs. Nucleic Acids Research. 38 (1), 215-224 (2010).
  9. Pirro, M., et al. Microparticles derived from endothelial progenitor cells in patients at different cardiovascular risk. Atherosclerosis. 197 (2), 757-767 (2008).
  10. Zahra, S., Anderson, J. A., Stirling, D., Ludlam, C. A. Microparticles, malignancy and thrombosis. British Journal of Haematology. 152 (6), 688-700 (2011).
  11. Amoura, L., et al. Assessment of plasma microvesicles to monitor pancreatic islet graft dysfunction: Beta cell- and leukocyte-derived microvesicles as specific features in a pilot longitudinal study. American Journal of Transplantation. 20 (1), 40-51 (2020).
  12. De Rop, C., et al. Evaluation of tissue factor bearing microparticles as biomarkers in allogeneic stem-cell transplantation. Transplantation. 92 (3), 351-358 (2011).
  13. de Abreu, R. C., et al. Native and bioengineered extracellular vesicles for cardiovascular therapeutics. Nature Reviews Cardiology. 17 (11), 685-697 (2020).
  14. Beitler, J. R., et al. Advancing precision medicine for acute respiratory distress syndrome. The Lancet Respiratory Medicine. 10 (1), 107-120 (2022).
  15. Porro, C., et al. Proinflammatory effect of cystic fibrosis sputum microparticles in the murine lung. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 721-728 (2013).
  16. Boisrame-Helms, J., et al. Lipid emulsions differentially affect LPS-induced acute monocytes inflammation: in vitro effects on membrane remodeling and cell viability. Lipids. 49 (11), 1091-1099 (2014).
  17. Kinane, D. F., Stathopoulou, P. G., Papapanou, P. N. Authors' reply: Predictive diagnostic tests in periodontal diseases. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), (2017).
  18. Kinane, D. F., Stathopoulou, P. G., Papapanou, P. N. Periodontal diseases. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-14 (2017).
  19. Kassebaum, D. K., Tedesco, L. A. The 21(st)-century dental curriculum: a framework for understanding current models. Journal of Dental Education. 81 (8), 13-21 (2017).
  20. Hajishengallis, G., Chavakis, T., Hajishengallis, E., Lambris, J. D. Neutrophil homeostasis and inflammation: novel paradigms from studying periodontitis. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 539-548 (2015).
  21. Suh, J. S., et al. Periodontitis-induced systemic inflammation exacerbates atherosclerosis partly via endothelial-mesenchymal transition in mice. International Journal of Oral Science. 11 (3), 21(2019).
  22. Bugueno, I. M., et al. Porphyromonas gingivalis triggers the shedding of inflammatory endothelial microvesicles that act as autocrine effectors of endothelial dysfunction. Scientific Reports. 10 (1), 1778(2020).
  23. Hajishengallis, G., Lamont, R. J. Breaking bad: manipulation of the host response by Porphyromonas gingivalis. European Journal of Immunology. 44 (2), 328-338 (2014).
  24. Lamont, T., Worthington, H. V., Clarkson, J. E., Beirne, P. V. Routine scale and polish for periodontal health in adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 12, (2018).
  25. Huck, O., et al. Reduction of articular and systemic inflammation by Kava-241 in a Porphyromonas gingivalis-induced arthritis murine model. Infection and Immunity. 86 (9), 00356(2018).
  26. Sochalska, M., Potempa, J. Manipulation of neutrophils by Porphyromonas gingivalis in the development of periodontitis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 197(2017).
  27. Kocgozlu, L., Elkaim, R., Tenenbaum, H., Werner, S. Variable cell responses to P. gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Dental Research. 88 (8), 741-745 (2009).
  28. Slocum, C., et al. Distinct lipid a moieties contribute to pathogen-induced site-specific vascular inflammation. PLOS Pathogens. 10 (7), 1004215(2014).
  29. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  30. Witek, R. P., et al. Liver cell-derived microparticles activate hedgehog signaling and alter gene expression in hepatic endothelial cells. Gastroenterology. 136 (1), 320-330 (2009).
  31. Tahir, F., Ahmed, J., Malik, F. Post-splenectomy sepsis: a review of the literature. Cureus. 12 (2), 6898(2020).
  32. Hussain, M., Stover, C. M., Dupont, A. P. gingivalis in periodontal disease and atherosclerosis - scenes of action for antimicrobial peptides and complement. Frontiers in Immunology. 6, 45(2015).
  33. Qureshi, A. W., et al. Ageing enhances the shedding of splenocyte microvesicles with endothelial pro-senescent effect that is prevented by a short-term intake of omega-3 PUFA EPA:DHA 6:1. Biochemical Pharmacology. 173, 113734(2020).
  34. Dunford, A., Keramida, G., Anagnostopoulos, C. D., Michael Peters, A. The cardiosplenic axis: another obscure pathophysiological function of the spleen and its investigation using molecular imaging. Nuclear Medicine Communications. 38 (3), 205-208 (2017).
  35. Ford, R. J., Becker, F. F. The characterization of trypan blue-induced tumors in Wistar rats. The American Journal of Pathology. 106 (3), 326-331 (1982).
  36. Field, F. E., et al. Trypan blue: identification and teratogenic and oncogenic activities of its coloured constituents. Chemico-Biological Interactions. 16 (1), 69-88 (1977).
  37. Covarrubias, R., et al. Optimized protocols for isolation, fixation, and flow cytometric characterization of leukocytes in ischemic hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (3), 658-666 (2019).
  38. El Habhab, A., et al. Significance of neutrophil microparticles in ischaemia-reperfusion: Proinflammatory effectors of endothelial senescence and vascular dysfunction. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (13), 7266-7281 (2020).
  39. Freyssinet, J. M. Cellular microparticles: what are they bad or good for. The Journal of Thrombosis and Haemostasist. 1 (7), 1655-1662 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Splenic MicrovesiclesMicrovesicle IsolationMurine Infection ModelIntraperitoneal InfectionProthrombinase AssayFlow CytometryCell ViabilitySplenocyte ExtractionNeutrophil CountProcoagulant Microvesicles
Video Coming Soon

Related Articles